第一章 生物感應器-BIAcore X 之原理與其應用
第二節 BIA 之光學原理-表面薄膜共振技術(SPR)
( S u r f a c e P l a s m o n R e s o n a n c e t e c h n o l o g y ) BIAcore X 的測定原理所運用的是表面薄膜共振技術（1~7），係為一 種光學現象。當光束於玻璃稜鏡內傳導時，在整個光束傳導路徑上遇 到金屬箔層界面時會有全反射的發生，但是其能量並非全部侷限在金 屬箔層介質內，此時一種稱為漸逝波(evanescent wave)的電磁場會 以垂直於光纖軸心的方向，將部分能量傳遞進入非照射端的介質中，
穿過距離大約 1 個波長左右。當非照射面因介質組成、濃度或成分改 變時而導致折射係數有變化的情況下，會藉由漸逝波的光動能變化反 應到共振角度的變化上，而共振角的產生是由於光束的電子振盪與金 屬箔層內金屬原子產生共振作用時，在特定的反射角範圍內會引起反 射強度的急遽變化，SPR 一詞因此而得，而此反射角又稱為共振角 (resonance angle) 。使用漸逝波的好處在於光穿透深度只及於表面 附近，即產生訊號的光線並未穿過全部檢體溶液，由於試劑僅圍著於 光學感測器表面，生化反應亦只需在此表面進行，檢體溶液遠離光線 的部分並沒有發生反應，因此可避免大部分溶液(bulk)之訊號。與金 屬面鄰接的介質部分之有效回應距離約距金屬表面 300 nm 左右，又 由於折射係數值隨該有效距離內之溶液的濃度而改變，因此 SPR 技術 可以用來定量靠近感測面表面之待測物濃度，而不需預先做任何的標
示(labelling)。
Detection unit
Reflected intensity
Angle Angle
Resonance signal (RU)
Time (S)
第三節 B I A 儀器之基本組成
BIAcore X 是一種以親和性(affinity)為主體的生物感應器（19）， 利用固定化的方式，選擇具有生物特異性的鍵合物(ligand)以共價結 合的方式結合在感應晶片聚葡萄糖間質(dextran)的表面上，靠著系 統流體的循環下，以控制流速將待測物注射到感應表面。當分析物與 鍵合物有相互作用發生時，形成表面質量濃度的改變，進而影響入射 光線折射率的變化，而 SPR 的光學反應也即時感應，並且表現於感應 圖(sensorgram)上，上述這些反應必須依賴著 BIAcore X 三大主要的 基本系統（18）(圖 1-2 所示)之運作：1.感應晶片表面系統 2.SPR 之光 學系統 3.液體傳送之微射流系統，茲分述如後：
圖 1-2 BIAcore X 三大主要系統
Microfluidic system Gold-dextran surfaces
SPR deyection system
3 - 1 感應晶片表面系統
感應晶片是即時 BIA 訊號的傳遞者，其構造大概可以分為四個主 要部分（11），包括玻璃稜鏡層(glass prism layer)、金箔層(glod film layer)、連接層(linker layer)和專一感應層(specific layer)。(如 圖 1-3 所示)
圖 1-3 感應晶片解剖圖
選擇金箔的原因是在於活潑性低之化學特性和良好的 SPR 反應組 合。另外專一反應層則提供四個主要功能：
i. 可以固定具有生物特異性的鍵合物 ii. 藉由表面結合的能力增加敏感性
iii. 提供親水環境，適合於大多數生物反應時的相互作用 iv. 有著專一性的結合能力
當感應晶片的非照射面與溶液接觸後開始相互作用，透過 SPR 的
Glass layer Specufic layer
Linker layer Glod film layer
運作來偵測生物分子在晶片表面的濃度變化。
實驗的成功與否和選擇適合的鍵合物(ligand)以及該物與感應晶 片固定程度有很大的相關性。
3-1-1 鍵合物的選擇
鍵合物之選擇應注意下列條件，1.專一性(specificity) ：專一 性高的鍵合物對於溶液中眾多的分子具有篩選的功能。2.再生的穩定 性(regeneration stability) （19）：反應作用完成後，需將分析物去 除，以備另一樣品做另一測試循環，鍵合物需有穩定之再生性繼續保 持本身原來的活性。3 純度(purity)：減少發生非專一性的結合 (non-specificity binding) 。4.大小(size) ：鍵合物的感應圖反 應與本身的質量成正比，鍵合物較大時，敏銳度差，會降低 RU 值可 靠性。
3-1-2 感應晶片 (sensor chip)
除了鍵合物外，需選擇適當的感應晶片，不同的感應晶片表面適 合不同的目的，亦有不同之固定模式。本研究中使用了兩種感應晶 片：CM5 chip、SA chip：
C M 5 感應晶片
CM5 chip 是 研 究 所 廣 泛 應 用 的 晶 片 ， 其 專 一 反 應 層 是 由 carboxymethyl dextran 所組成
，
提供了相當好的親水性環境，再根 據 鍵 合 物 性 質 和研 究 要 求 ， 可 選 擇 不 同 的 化 學 方 法 進 行 偶 聯（coupling）。在固定的方式上，多以胺類偶合法（amino coupling）
（20）被利用的最多，尤其在蛋白質的應用方面（21），因為大部分的蛋白 質 都 少 不 了 有 胺 類 的 官 能 基 。 首 先 利 用 0.05 M NHS (N-hydroxysuccinimide) / 0.2 M EDC（N-ethyl-N-(dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride）活化晶片表面，當感應晶片表面活化後 接下來就是固定化的步驟，胺類偶合法是利用胺基的氮原子未配位電 子進行所謂的親核性取代反應。使用胺類偶合法有幾個變數要注意 的：pH 值、鍵合物的濃度、反應時間，若鍵合物是酸性蛋白質，則 氮原子質子化的結果會降低結合時的效率；如果被固定的胺基剛好是 鍵合物的活性區（active site），則會導致整個作用反應的降低。
在本研究中，是以此種感應晶片用於實驗一與實驗三，偵測標的 物（target compound）和蛋白質與輔脢 B12之間的相互作用。
S A 感應晶片
SA chip 表面是由一層類似卵白素（avidin）的蛋白質-鍊霉菌卵 白素所構成（streptavidin），做為捕捉分子之用。而這種晶片通常 只用來固定有生物素修飾的鍵合物（22）（biotinylated ligand），因為 鍊霉菌卵白素與生物素（biotin）之間有相當好的親合性與專一性，
但它們之間雖然結合相當緊密，但並非以共價鍵結合的方式鍵合在一 起。
在使用 SA chip 之前，必須先將鍵合物經過生物素的修飾，形成 生物素修飾鍵合物，才能繼續進行後續的固定化反應與分析的工作。
當生物素鍵合物以一端固定於 SA chip 後，其它部分將以動態的方式 懸浮於晶片表面，可增加分析物與鍵合物的結合敏感度，有助於分析。
在本研究中，實驗二以此種感應晶片來偵測 Grb2 SH2 的胜月太 衍 生物之抑制效力。
3 - 2 S P R 光學系統
BIAcore 的光線來源是一個波長接近紅外線光的兩極真空管發射 出來，以一定入射角的楔形(wedge-shaped) 光束直射焦點落於感應 晶片上。當監測到 SPR 的反應時，電腦內附的程式軟體會自動的計算 角度，也就是共振角度，其原理已在本章第二節中做了詳細的描述。
3 - 3 液體傳送系統
液體傳送系統（ 18 ）具有精確的幫浦與微射流卡匣（integrated fluidic cartridge）簡稱 IFC。預分析之樣品是以人工的方式注射進 入，並滯留在一標準的微射流盤的 sample loop 內，溫度控制在一定 範圍後，機器軟體即自動式控制 IFC 的瓣膜閥，使液體流動經過管路 到達感應晶片的表面。IFC 的表面有精密正確的凹槽，藉由機器的幫 助使它與感應晶片的流路(Flow cell，Fc)接觸，Fc 是被設計只需少 量的樣品傳送於感應晶片的表面。IFC 和辦膜的操作可以很快的改變 樣品與緩衝液交替於感應晶片表面和有能力去控制樣品接觸於表面 時間的正確性與再生性。
第四節 典型感應圖( s e n s o r g r a m ) （2）之說明
BIA 的感應圖是 SPR 共振角度回應的訊息，連續對時間作圖而得。
其縱軸單位為 SPR 回應的訊號，為量測共振角度的變化所獲得之度量 單位，稱之為共振單位(resonance unit，RU)；橫軸為時間，以秒為 單位(s)。 感應圖可即時的紀錄流動狀態下的標的物(analyte)與感 應晶片(sensor chip)上的固相鍵合物整個結合、解離的完整過程，
如圖 1-4 所示。
在開始的狀態，感應晶片表面已固定有某一鍵合物的存在，但並 未與任何待測物反應，故在緩衝溶液(buffer)下，感應圖形顯示平緩面 而無變化狀態，亦即在 t=0~100 秒時，RU 值是維持在基礎的狀態；
在 t=100~350 秒，開始注入待測分子，而待測分子與表面鍵合物結合 後 RU 值隨著兩者的結合而急劇上升，當曲線上升到一穩定狀態即表 示表面鍵合物接受分子的結合已趨於飽和，因此可以研究即時的結合 反應；其後在 t=350~430 秒，整個待測物注射結束後，系統會自動切 換至緩衝溶液的流動狀態，此時感應圖上 RU 值下降是表示整個結合 分子已由溶液沖洗，因此可以研究即時解離反應之過程；在 t=430~520 秒，注入解離劑，解離劑會在不影響表面鍵合物活性的情況下，完全 而快速移除感應晶片表面上與鍵合物作用的結合物：而 t=520 秒以後 是經過解離劑作用後的感應晶片，反應恢復於緩衝溶液中，RU 值也
回到起始平衡狀態，即表示感應晶片可以進入另一循環樣品分析的開 始。
圖 1-4 典型 BIA 感應圖
另外在整個反應的開始與結束時常伴隨著一個溶液背景值不同 造成之影響特稱為 Bulk effect（23）(如圖 1-5)，這樣 Bulk effect 的產生 是由於系統從緩衝溶液狀態轉換至待測物注射反應時，因為整個晶片 表面溶液的突然變換而發生的瞬間變化，故實驗時應入考慮。
圖 1-5 Bulk effect 圖示
Regeneration Dissociation
Concentration Resonance
signal ( kRU )
Association
Kinetic
第五節 B I A 之應用
BIAcore 是用來探討分子之間相互作用的感應器，BIA 的技術可 在無標記的條件下快速的從樣品中將適用之分子鑑定出來，因此可以 廣泛運用於藥物的篩選作用、細胞訊息傳遞上的抑制效應、以及分子 結構及功能的關聯性分析等等，總之，在生物分子研究領域中，BIA 技術運用於篩選，分析已成為極佳之利器。
本研究對於 BIA 應用於不同試驗之實驗設計與結果，分別詳述於 第二、三、四章。
第二章 BIA 應用於癌細胞酵素-MAT 抑制活性之篩選
第一節 研究動機與目的
MAT（Methionine adenosyl transferase）具有生物催化的功能，
會幫助 Met（Methionine, 甲硫胺酸）和 ATP 形成 SAM（S-adenosyl methionine）（24~26）。SAM 在細胞內具有甲基化的功能，進行核酸甲基 化。甲基化的異常與許多疾病有關（27~28），尤其與癌症的關係最為密 切。由於 MAT 複合物之異常與癌症有密切關係，因此抑制異常 MAT 複 合物或許能提供治療癌症的途徑（29~30）。
Paukovitis（ 31 ）等人由成熟的顆粒細胞中所分離出來的酸性 peptides-Hemovegulatory peptide（HP）可抑制細胞增生的作用，
因此，設計合成一系列 HP 衍生物，並測試其生物活性以從事結構活 性的研究，而我們期望的是可以建立一初步篩選的方式，也就是運用 表面薄膜共振的技術（SPR technology）來研究抑制物與癌細胞酵素
因此，設計合成一系列 HP 衍生物，並測試其生物活性以從事結構活 性的研究，而我們期望的是可以建立一初步篩選的方式，也就是運用 表面薄膜共振的技術（SPR technology）來研究抑制物與癌細胞酵素