2-1 限制性內切核酸酶 EcoRI 基本介紹
1972年時Boyer的實驗研究團隊從E. coli中發現了EcoRI這個限制 性內切核酸酶[12]，能把 GAATTC 序列不對稱地切開，切口會形成 黏端(sticky ends)。具有相同黏端的核酸片段，可以互相準確地黏在一 起，在基因重組技術上有很大貢獻。EcoRI的DNA辨識位點由一股 DNA的5'端至3'端的核苷酸序列為GAATTC，而另一股DNA由5'端至 3'端的核苷酸序列也為GAATTC，此特性稱為迴文(palindrome)如圖 2-1[13]。
圖 2-1 EcoRI 辨識 DNA 上的序列。圖中綠線為酶切 DNA 的序列位 置。
本實驗選用EcoRI來進行酶切DNA實驗是由於EcoRI對於DNA
上有五個辨識位點，而位點與位點間的距離又可清楚分辨，如圖2-2。
而圖2-3為EcoRI接合DNA的結構示意圖[14,15]。在這過程中可以很清 楚的了解到EcoRI如何對DNA作辨認，EcoRI螺旋部份會辨識到DNA
圖 2-2 DNA 上 EcoRI 所擁有的辨識位點。從左到右分別為在 21226 bp、25104 bp、31747 bp、39168 bp 以及 44972 bp 等五個辨識點。
圖 2-3 EcoRI 辨識位點結構示意圖。
2-2 高解析度雷射光鉗系統及位移檢測系統基本原理 2-2.1 高解析度雷射光鉗基本原理
雷射光自從被人類發明後，光學領域上的發展向前邁進一大步，
高強度的雷射光使光與物質作用所產生的各種現象更為明顯。若是將 一雷射由下而上入射，並使之聚焦，此時如果在聚焦點處放置一微米 等級的微粒，此微粒將受到雷射光的光子不斷的撞擊，只要雷射的強
度夠強，意即光子流的密度夠大，以及微粒的質量夠輕，那麼此微粒 將因為光子對微粒的作用力與微粒所受的重力大小一樣，方向相反，
則此微粒將會因力平衡而懸浮固定於空間中〃這個光子對微粒的作用 力又被稱為光壓。
1970 年時 Ashkin 認為聚焦之雷射光極有可能推動數奈米等及 大小的微粒，於是利用氬離子雷射聚焦至水中，並在水中置入直 徑 0.59 至 2.68μm 的微粒，發現微粒沿著光軸加速被推離[16]。除 了光軸方向上的推力，也發現在接近光束的微粒也會被橫向吸入 光束後再被推離。之後作者改用氣泡與液滴重新進行實驗，歸納 出光束對折射率比周圍介質高的微粒具有橫向吸力，但對折射率 比周圍介質低的微粒具有橫向推力的結論。
此種橫向作用力的存在，使 Ashkin 學者嘗詴將兩束雷射光相 對聚焦於同一處，希望在兩束雷射的軸向作用力相抵消之處，產 生一個可以將微粒橫向吸入並嵌住不動的位能井(potential well)。
實驗結果相當成功，成為日後雙光束光鉗(deal-beam trap)的雛形，
同時，這也是首次呈現出雷射光鉗。1986 年，又發現將單束雷射 光高度聚焦，也可以在焦點處產生與光進行方向相反的軸向吸 力，加上原有的橫向吸力，可將微粒穩定嵌住。這種單束雷射的 光學嵌住，又稱為光鉗 (optical tweezers)[17]。
圖 2-4 雷射光鉗基礎原理示意圖。
而雷射光鉗的基本概念則是將一道雷射光束經透鏡聚焦後，在雷 射聚焦處形成一穩定的位能井。於是，在此焦點周圍的微粒子就會被 吸引到焦點，而達到捕捉與操控的目的。利用簡單的幾何光學與動量 變化產生力的概念來解釋雷射光鉗的原理，如圖2-4[18]，此圖是修改 自Mameren 2002年的文章。當光線從一個介質中進入另一個不同的介 質時，光會發生偏折的現象，也就是所謂的折射，當光線發生偏折的 時候，光動量就會發生改變，動量改變即反應有作用力的存在，所以 當雷射光線經過乳膠珠後發生偏折，此偏折所產生的力就由乳膠珠提 供，也就是說乳膠珠對於雷射光施予一作用力使其偏折，又因為牛頓 第三運動定律所描述之作用力等於反作用力，因此雷射光也對乳膠珠 做一反作用力，而此作用力與反作用力就是雷射光鉗所擁有的捕捉
力。
而若當雷射光過於發散，雷射光會將物體稍微的推離聚焦光 束，因為由於物體受到雷射光束本身向上的推力，再加上物體本身移 動的力形成力的向量因素，因此物體不會被光鉗所捕獲，而是會稍微 的遠離光鉗中心，如圖2-5。因此可由以上描述所知，物體會網雷射 聚焦處移動，因而受到雷射光鉗所捕獲，而本實驗將運用雷射光鉗系 統結合高倍率的物鏡，達到操控DNA的目的。
圖 2-5 雷射光發散的作用力示意圖。
2-2.2 高解析度位移檢測雷射之原理
2002年Block研究團隊利用雷射光鉗系統搭配其位移檢測系統來 進行實驗[19]，此位移檢測方式可測得當雷射光經過物鏡射入載玻片 中此雷射光為一高斯光束(gaussian beam)。若微通道中被雷射光鉗所 捕獲的乳膠珠因為外力影響而產生移動時，乳膠珠本身的散射球面波
緣(wave front)與高斯光束的波緣交互作用後，將會形成干涉條紋，而 干涉條紋經過condenser後會呈像在condenser的背向焦平面(back focal plane)，此干涉條紋頭設置四象限光電感測器上，進而利用電腦程式 將其位移變化記錄下來，如圖2-6所示。[18]
本 實驗中 位移檢 測的 830nm雷 射 光 路設計 方面是 仿造 2002 年 Block研究團隊[19]，利用830雷射光打入四象限光電感測器(quadrant photodiode，又稱QPD)，以電腦程式做操控，擷取物體因為位移所產 生的電壓訊號。
圖 2-6 乳膠珠的波緣與高斯光束的波緣形成正交產生干涉條紋，再將 干涉條紋透過 condenser 成像於背向焦平面後，投射至四象限光電感 應器上，以便記錄其位移變化量。
2-3 量子點(Quantum dots)及單分子螢光觀測系統基本介紹 2-3.1 量子點的基本介紹
量子點(quantum dot)是準零維(quasi-zero-dimensional)的奈米材 料，由少量的原子所構成。巨觀來看量子點三個維度的尺寸都在100 奈米(nm)以下，外觀恰似一極小的點狀物。許多研究學者已發展出多 樣製備方式來製造量子點，且量子點會因不同種類的激發光會造成量 子點有不同的波長反應，如圖2-7[20]。因此認為量子點會有極大的生 物醫學應用潛力。而加州大學的研究團隊證明了CdSe/ZnS量子點具有 光量化的特性[21]，也讓量子點開始被廣泛的應用，其主要原因是由 於傳統有機染劑在經過光照射一段時間後，就會產生光漂白現象 (photobleaching)，使的染劑喪失了標定發光的作用，而量子點可接受 光源長時間的激發，故可用於長時間的螢光訊號觀測。有關量子點與 傳統有機染劑的差異性比較，如圖2-8所示[22]。
圖 2-7 量子點激發螢光之特性
圖 2-8 量子點與一般有機染劑的差異。有機染劑(Alexa 488)在經過光 源照射反應時間 180 秒後，已發生光漂白現象；然而相同照射時間內 量子點 608(QD-608)仍能維持的一定的亮度。
本實驗所使用的量子點為QD 565，選用此波段之量子點是由於量 子點本身具有較高的量子產率(quantum yield)，而量子產率越高，其 所產生的螢光訊號也越佳，較適合單分子螢光訊號的觀測。而圖2-9 所顯示，量子效應最好的效果為QD 655，但因螢光激發後QD 655會 發紅光，而本實驗所使用之乳膠珠在螢光激發下也為紅光，因此兩者 的激發光就會互相重疊，而影響實驗結果判讀；所以實驗最後選用了 量子產率大於50%且激發光非紅光的QD 565來進行實驗，並選擇適當 的濾光片以排除乳膠珠對量子點螢光訊號的干擾。
圖 2-9 量子點的量子效應的百分比。可藉由此圖中的表格來選用適當 之量子點以方便進行實驗。
2-3.2 單分子螢光觀測系統基本介紹
而本實驗所使用 QD565 的激發光源為汞燈，利用汞燈與 QD565 做搭配，配合特殊規格之濾光片，可便於濾除多餘的背景雜訊，使擷 取影像時可獲得較好的螢光訊號。實驗中所使用之濾光片如圖 2-10
所示。由於本實驗將限制性內切核酸酶 EcoRI 與 QD565 做結合 (conjugate)，搭配雷射光鉗系統與螢光顯微系統進行研究，可觀察 EcoRI 在微通道中的移動情形，此一觀測現象可以利用 MSD 系統來 進行分析，以期望可藉由此檢測方式計算出 EcoRI 擴散係數與空間移 動之位移路徑。
圖 2-10 濾光片盒示意圖及光譜圖。上圖為濾光片盒的示意圖，與下 圖相比對藍線為 excitation (EX)，綠線為 dichroic (D)以及紅線的 emission (EM)。