利用單分子操控術進行限制性內切核酸酶EcoRI之力化學反應速率定量量測

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(1)臺北醫學大學口腔醫學院生醫材料暨工程研究所碩士論文 Graduate Institute of Biomedical Materials and Engineering Collage of Oral Medicine Taipei Medical University. 利用單分子操控術進行限制性內切核酸酶 EcoRI 之力化學反應速率定量量測 Quantifying the Mechanochemical Reaction Rates of the Restriction Endonuclease EcoRI by Single Molecule Techniques. 研究生：蔡靜欣撰 (Ching-Shin Tsai). 指導教授：楊自森博士 (Advisor: Tzu-Sen Yang , Ph.D.) 中華民國九十八年十二月 December, 2009.

(2) 中文摘要限制性內切核酸酶 (restriction endonuclease) 是由細菌體內所發現，可將外源入侵的 DNA 片段精準地切除。因此利用限制性內切核酸酶的特性來酶切雙股 DNA (double-stranded DNA) 特殊序列，是近年來重要的分子技術。由於傳統的分子生物技術無法直接觀察限制性內切酶酶切 DNA 的過程，本研究將利用單分子生物技術搭配螢光顯微系統，觀察限制性內切核酸酶 EcoRI 在空間中如何移動尋找DNA 上的特殊位點。當 DNA 兩端分別與乳膠珠結合後，使用光鉗系統將乳膠珠箝制並將乳膠珠向下拉至蓋玻片表面固定。再利用微量注射幫浦將與量子點(quantum dots)結合的限制性內切核酸酶(EcoRI)送入觀測區，即可用倒立式螢光顯微鏡觀察 EcoRI 在空間中移動的行為。從實驗結果中得知，對DNA 施予 1 pN 以及 14 pN 的拉力來觀察 QD-EcoRI 的移動軌跡，發現施予 1 pN 的力量時，QD-EcoRI 結合上辨識位點後所產生的位移變化量較大，DNA 仍可在兩個乳膠珠間進行小幅度的擺盪。而施予 14 pN 的力量時所產生的位移變化量較小。從 14 pN 的 X-Y-T 圖中可很清楚的觀察到當 QD-EcoRI 結合至位點後，會對於所處的位置進行 X 方向小幅度的移擺盪，並隨著結合時間的增加而減少擺盪；Y 方向的位移變化量則是 QD-EcoRI 隨著DNA 擺盪而產生的位移量。實驗中又利用 EDTA 溶液進入 QD-EcoRI 的微. I.

(3) 通道後，成功可觀察到 QD-EcoRI 與DNA 由結合狀態過渡到解離狀態的反應過程。. II.

(4) 英文摘要 Restriction endonuclease is found in bacteria and can precisely cut off the DNA sequence specificity invaded from outside. Nowadays, using the restriction endonuclease to cleavage the double-stranded DNA (dsDNA) at specific recognition nucleotide sequences is regarded as an important biotechnology. However, the traditional approaches cannot directly observe the process of specific cleavage of DNA by the restriction endonuclease. In this thesis, we presented single molecule biotechnology, together with the single molecule fluorescence detection system, to directly observe how the EcoRI find the recognition binding site. After the biotinylated ends of the bacteriophage. DNA were. attached to streptavidin-coated beads, these two beads were then stuck on the cover glass surface via optical tweezers, followed by delivering the QD-EcoRI into the observation region. In this study, we found that the distributions of the QD-EcoRI trajectory are significantly different under different extension forces exerted on DNA. On the other hand, we found that the dissociation of QD-EcoRI occurred while delivering EDTA buffer into the observation region, this suggested that the association is an reversible process. III.

(5) 目錄中文摘要..................................................................................................... I 英文摘要...................................................................................................III 目錄.......................................................................................................... IV 圖目錄..................................................................................................... VII 表目錄...................................................................................................... IX 符號表........................................................................................................ X 第一章. 序論 ...........................................................................................1. 1-1. 前言 ...........................................................................................1. 1-2. 研究動機 ...................................................................................2. 1-3. 文獻回顧 ...................................................................................3. 1-4. 章節回顧 .................................................................................13. 第二章實驗原理 ....................................................................................14 2-1. 限制性內切核酸酶 EcoRI 基本介紹 ....................................14. 2-2. 高解析度雷射光鉗系統及位移檢測系統基本原理 .............15. 2-3. 2-2.1. 高解析度雷射光鉗基本原理 .......................................15. 2-2.2. 高解析度位移檢測雷射之原理 ...................................18. 量子點(Quantum dots)及單分子螢光觀測系統基本介紹..20 2-3.1. 量子點的基本介紹 .......................................................20. IV.

(6) 2-3.2. 單分子螢光觀測系統基本介紹 ...................................22. 第三章：系統介紹 ..................................................................................24 3-1. 雷射光鉗系統光路與元件介紹 .............................................24. 3-2. 加熱及溫控系統 .....................................................................26. 3-3. 微量流速控制系統 .................................................................27. 第四章：實驗流程與方法 ......................................................................28 4-1. 實驗流程 .................................................................................28. 4-2. 實驗材料與方法 .....................................................................29 4-2.1. 實驗所使用材料與儀器 ...............................................29. 4-2.2. DNA 端點修飾法 ...................................................29. 4-2.3. 量子點表面標定限制性內切核酸酶 EcoRI 的製備與. 純化. ………………………………………………………...31. 4-2.4. QD-EcoRI 活性及濃度測詴.......................................32. 4-2.5. 微通道厚度測詴法 .......................................................34. 第五章實驗結果與討論 ........................................................................35 5-1 流速系統穩定性測詴 ................................................................35 5-2 流體穩定性詴驗 ........................................................................37 5-3 微通道高度測詴 ........................................................................39 5-4 QD-EcoRI 濃度及活性測詴 ......................................................40. V.

(7) 5-4-1 QD-EcoRI 濃度測詴 ........................................................40 5-4-2 QD-EcoRI 活性測詴 .......................................................41 5-5. λDNA 於不同外力作用下 QD-EcoRI 結合位點與移動軌跡. 的動態時序觀測................................................................................43 5-5-1. 對 λDNA 施加 1 pN 拉力時 QD-EcoRI 結合位點與移. 動軌跡的動態時序觀測.............................................................44 5-5-2. 對 λDNA 施加 14 pN 拉力時 QD-EcoRI 結合位點與移. 動軌跡的動態時序觀測.............................................................45 5-6 QD-EcoRI 與 λDNA 結合與解離反應觀測 .............................48 第六章結論.............................................................................................50 第七章未來方向 ....................................................................................52 第八章參考文獻 ....................................................................................53. VI.

(8) 圖目錄圖 1-1 液體表面張力使 DNA 伸展開..……………………………….3 圖 1-2 雷射光鉗示意圖………………………………………………..4 圖 1-3 DNA 力量與拉伸長度的圖形……………………………….....5 圖 1-4 DNA 受力的結構變化圖…………………………………….....6 圖 1-5 雷射光鉗示意圖………………………………………………..7 圖 1-6 EcoRV 酶切時間路徑圖………………………………………..7 圖 1-7 DNA 拉伸的力化學模式…………………………………….....9 圖 1-8 限制性內切核酸酶於 DNA 上的移動情形…………………..11 圖 1-9 DNA 在 500 Mm 的 NaCl 下，溫度與力量的變化圖……….12 圖 2-1 EcoRI 辨識 DNA 上的序列……………………..……………14 圖 2-2 DNA 上 EcoRI 所擁有的辨識位點…………..……………..15 圖 2-3 EcoRI 辨識位點結構示意.……………………………………15 圖 2-4 雷射光鉗基礎原理示意圖……………………………………17 圖 2-5 雷射光發散的作用力示意圖…………………………………18 圖 2-6 QPD 原理示意圖……………………………...………………19 圖 2-7 量子點激發螢光之特性………………………………………21 圖 2-8 量子點與一般有機染劑的差異………………………………21 圖 2-9 量子點的量子效應的百分比…………………………………22. VII.

(9) 圖 2-10 濾光片盒示意圖及光譜圖……………………………………23 圖 3-1 1064 nm 與 830 nm 雷射光路的整合圖…..…………………25 圖 3-2 溫度控制系統及微量注射系統………………………………26 圖 3-3 高階微量注射幫浦……………………………………………27 圖 4-1 DNA – loigo 結構示意圖……………………………………..30 圖 4-2 QD-EcoRI 活性及濃度計算實驗示意圖……………………33 圖 4-3 微通道厚度測詴示意圖………………………………………34 圖 5-1 流量控制系統示意圖…………………………………………35 圖 5-2 微量注射系統設定及實際汲取溶液的體積關係……………36 圖 5-3 微量注射系統設定及實際輸送溶液的體積關係……………37 圖 5-4 利用 Labview 透過 CCD 擷取時序影像圖…………………..38 圖 5-5 微通道高度測詴結果圖………………………………………39 圖 5-6 利用 Luca CCD 擷取之 QD-EcoRI 影像圖………………….40 圖 5-7 DNA 結合 QD-EcoRI 所呈現之影像圖…………………….42 圖 5-8 對DNA 施加 1 pN 拉力時的結合位點及軌跡圖…………..44 圖 5-9 對DNA 施加 14 pN 拉力時的結合位點及軌跡圖…………47 圖 5-10 QD-EcoRI 結合DNA 後的向量位移軌跡圖……………….48 圖 5-11 QD-EcoRI 結合DNA 後 X – Y 方向移動軌跡圖………….48 圖 5-12 EDTA 溶液 (5 mM) 使 QD-EcoRI 從 lDNA 解離脫落……50. VIII.

(10) 表目錄表 5-1 微通道厚度測詴數值結果……………………………………39 表 5-2 統計特定位點上 QD-EcoRI 個數……………………………41. IX.

(11) 符號表 kc：酶切結合常數 kdif：限制內切酶擴散速率(s-1) kind(F)：限制內切酶誘導構型變化速率(s-1) khydr：限制內切酶水解速率(s-1) khydr：水解速率常數(s-1) kon[EcoRV]：結合速率常數(s-1) l ：DNA 相鄰鹼基對的距離(0.34nm). a：EcoRV 結合 DNA 時的序列大小 θ：EcoRV 誘導 DNA 構型變化的角度 kB :波茲曼常數(常溫下為 1.38x10-23 J/K) T：凱氏溫度. X.

(12) 第一章. 序論. 1-1 前言利用單分子操控術控制第二類型限制性內切核酸酶 (Type II restriction enzyme)來酶切 DNA 是近年來所興起的一種生物單分子研究途徑。在過去研究結果中，傳統分子生物檢測酶切反應需大量的樣品才能透過膠體電泳獲得分析結果。而近年來興起的雷射光鉗系統結合顯微鏡系統用來操控單一雙股 DNA 分子，可作為生物單分子酶切 DNA 的操控及觀測平臺。更進一步可結合螢光顯微技術，觀察單一分子在空間中的移動情形。此技術改善普通光學方法無法直接觀測到奈米等級的分子的問題，而從中發展出一種以螢光分子標記於生物單分子上，用來觀察分子在空間中的移動情形。而在過去的實驗中顯示運用限制性內切核酸酶 EcoRI 在酶切 DNA 的同時，發現 EcoRI 會對 DNA 上的識別位點造成 50˚彎曲角度 (bending angle)的構型改變[1]，讓許多學者開始利用第二類型限制性內切核酸酶來觀察酶切 DNA 的影響。而 2005 年 Wuite 研究團隊利用單分子操控術對單一 DNA 分子施予不同拉力，計算出第二類型限制性內切核酸酶 EcoRV 對 DNA 分子的酶切反應速率 kc(F)，其中 kc(F) = (1/kdif+1/kind(F)+1/khydr)-1，kdif：限制內切酶擴散速率(s-1)；kind(F)：限制內切酶誘導構型變化速率(s-1)；khydr：限制內切酶水解速率(s-1)[2]。但. 1.

(13) 由於上述實驗只能依靠力量與時間的關係圖來觀察得知限制性內切核酸酶何時酶切 DNA，因此本實驗將進一步的利用單分子操控術搭配螢光顯微系統來分析當DNA 在不同外力作用下第二類型限制內切核酸酶 EcoRI 結合位點的位移軌跡之時序影像，藉由此實驗期望未來可更進一步觀察 QD-EcoRI 結合DNA 的動態結合過程，獲得精準的酶切反應速率定量量測。. 1-2 研究動機在傳統的分子生物實驗中用來觀察酶切後的 DNA 片段，通常使用 DNA 膠體電泳分析，DNA 在經過電泳後，將凝膠利用染劑作色後，在紫外線下會顯現發光的片段，利用染色而顯現出來的片段得知 DNA 片段的分子大小，這樣的方法是簡便。古語說：眼見為憑！但是透過電泳分析方法是無法直接觀測 DNA 與限制性內切核酸酶之間的反應過程，因此無法提供限制性內切核酸酶何時結合 DNA 以及酶切時的力化學反應情形。本實驗將第二類型限制性內切核酸酶 EcoRI 結合量子點，以單分子操控術利用倒立式顯微鏡以單分子的角度，進行 QD-EcoRI 結合DNA 解離過程動態行為研究之觀察，利用DNA 以及 QD-EcoRI 來探討當DNA 在不同外力作用下 QD-EcoRI 結合後的位移軌跡之時序影像，未來就可就此實驗之研究結果更進一步觀察 QD-EcoRI 結合DNA 的動態結合過程，可望 2.

(14) 獲得精準的酶切反應速率定量量測。 1-3 文獻回顧針對以往膠體電泳分析方法只能觀察巨觀實驗結果的缺憾，1994 年時Bensimon研究團隊將DNA的一端固定於玻片表面上，利用水滴的表面張力使得DNA緩慢的張開而能將蛋白內嵌至DNA上，如圖 1-1[3]。這種實驗方式的優點是因便於操作且DNA在玻片表面上可以互相平行，並不需使用高濃度DNA；但此種方式容易出現DNA不受控制的情形，因為是利用液體的表面張力來張開捲曲的DNA結構，無法使用力量進行控制，而置換液體的速度頗為緩慢。. 圖 1-1 DNA 一端固定於玻片表面，用液體表面張力使 DNA 伸展開。. 為了可對DNA上施予一定的作用力量，Bustamante的研究團隊於 1996年將雷射光鉗(optical trapping)運用在顯微系統下，在DNA兩側端點結合乳膠珠，使乳膠珠被高度聚焦的雷射力場中鉗住，藉此可以觀察在不同力量的作用下，單一DNA分子(single molecular)的反應，如. 3.

(15) 圖1-2[4]。圖中：雷射是使用兩把100 mW的800 nm雷射光從玻片的上下兩方聚焦於同一點，使其雷射力場可捕獲乳膠珠，用來固定DNA 的一端，另一端的乳膠珠則使用吸量管(pipette)來固定，再使用微量幫浦將液體送入通道中，使液體可充滿通道。而藉由移動平台的方式，使玻片達到位移變化，達到拉伸DNA的目的。而此方法改善1994 年無法對DNA施以拉力，再者由於光鉗力量穩定便可以快速的更換微通道中的液體，再藉由顯微鏡來觀察DNA上細微的反應變化。. 圖 1-2 將 DNA 兩端接合乳膠珠後，一端利用 pipette 抓住乳膠珠，另一端利用雷射光鉗系統鉗住，藉此可施予 DNA 力量來進行實驗。. 此實驗證實對 DNA 施予 60pN 力量使其產生過度拉伸 (overstretches)的情形後，在緩慢的釋放所施予的力量，此可讓 DNA 修復其鍵結，使其恢復至原本的結構上(relaxing)，如圖 1-3[5]。利用兩種不同的蠕蟲鍊模型(worm-like chain model)來摸擬當對 DNA 施予 0~60pN 的力量時模型參數的結果變化。可以從圖 1-3 中觀察到當施予 DNA 0~15pN 的力量時，所施加的作用力，可克服 DNA 呈現捲曲 4.

(16) 的狀態；對 DNA 施予 15~60pN 的情形下，此時所施加的作用力，可將 B-form DNA 拉直；而受力超過 60pN 的 DNA 則呈現一種過度拉伸的關係。另外受力後結構的變化圖就如圖 1-4[5]。. 圖 1-3 DNA 力量與拉伸長度的圖形。圖中：大虛線部分及小虛線部分為作者使用蠕蟲鍊模型所作之推導線，其中大虛線所使用的模型是針對於低力量的時候，推演的較為符合，小虛線部分所使用的模型是針對高力量時候所推演的結果較為符合。拉伸箭頭(stretching→)所指之方向為 DNA 受力拉伸時長度變化方向，而在收回對 DNA 所施予之外力後，DNA 則會進行結構的恢復(relaxing)直到恢復至起始的 B 形式 DNA (B-form DNA)。. 5.

(17) 圖 1-4 DNA 受力的結構變化圖。(A) DNA 未受力之結構型態；(B)受力後產生變化 DNA 結構型態；(C) 受力後，DNA 鹼基外翻的情形。. 而2005年Wuite的研究團隊更利用雙雷射光鉗系統鉗住DNA兩端的乳膠珠，研究施以不同力量對單一DNA分子被第二類型限制性內切核酸酶EcoRV酶切的力化學影響，如圖1-5[2]。在這個實驗中，Wuite 的研究團隊利用了光鉗可施予DNA力量的特性，觀察了DNA從被光鉗捕獲後，到注入含有限制性內切核酸酶EcoRV的液體，到酶切DNA 階段的力量變化，並製作時間與力量的關係圖，如圖1-6。. 6.

(18) 圖 1-5 雷射光鉗實驗示意圖。圖中紅色表示雷射光鉗；藍色為乳膠珠；綠色為限制性內切核酸酶；橘色為 DNA。. 1. T4-T3 ≡ k ( F ) c. 圖 1-6 EcoRV 酶切時間路徑圖。1：光鉗捕獲住 DNA 後，對 DNA 施予 50 pN 的作用力將之拉伸開；2：利用微量注射幫浦將限制性內切酶 EcoRV 輸送至微通道內；3：停止輸送 EcoRV；4：EcoRV 酶切造成 DNA 雙股斷裂，使 DNA 受力為 0 pN。. 7.

(19) Wuite 的研究團隊也利用圖 1-6 所記錄的作用力隨時間的變化關係，運用公式 1-1 來計算限制性內切核酸酶接合 DNA 中的各種不同反應速率常數。  1 1 1  kc ( F )     k   dif kind ( F ) k hydr . 1. 1-1. 在公式(1)中 kdif：限制內切酶擴散速率(s-1) kind(F)：限制內切酶誘導構型變化速率(s-1) khydr：限制內切酶水解速率(s-1) 這三個參數即說明了限制性內切核酸酶接合 DNA 的不同變化的代表值。其研究團隊利用施予的力量(F)的不同，運用蠕蟲鍊模型的公式 [6,7]來計算出拉伸係數(K)[8]，用已知的 F 值以及 K 值，來計算出當 EcoRV 誘導 DNA 構型變化時的速率值(kind(F))，參考圖 1-7。其中公式： F E1  l  a  F K    E2  l  a  1  cos   F  2   E3 . 2 4. Lp. 1-2 1-3 1-4. kB T F. 公式 1-2、1-3、1-4 中， l 為 DNA 相鄰鹼基對的距離(0.34nm)；a 為 EcoRV 結合 DNA 時的序列大小；θ 為 EcoRV 誘導 DNA 構型變化的角度；kB 為波茲曼常數(常溫下為 1.38x10-23 J/K)；T 為凱氏溫度。. 8.

(20) △△G(kBT) 圖 1-7 DNA 拉伸的力化學模式。圖中：△E1：DNA 剛受力拉伸時的能量變化(長虛線)；△E2：DNA 受到 EcoRV 接合時，結構產生扭曲時的能量變化(短虛限)；△E3：DNA 被 EcoRV 完全結合後所產生的能量變化(中心線)。. Wuite 的研究團隊對 EcoRV 濃度進行改變，使 DNA 處於高濃度的環境中，並且將拉伸 DNA 的力量降到一定的程度，使力量不會對於 DNA 本身構型造成太大的影響，因此 DNA 在低作用力的實驗條件下(F＜10 pN)，作者運用公式 1-1 將誘導構型變化速率的參數忽略不計，因此在具有酶切結合常數(kc)，高單位的 EcoRV 濃度影響下， 9.

(21) 第二類型限制式內切核酸酶 EcoRV 的酶切反應速率看的即為酶切的水解過程(khydr)。其中公式 1-5 中：khydr 為水解速率常數(s-1)；kon[EcoRV] 為結合速率常數(s-1)。 1.   1 1  ; k  k EcoRV  kc    dif on k    k EcoRV hydr on  . 1-5. 2008 年，Bonnet 的研究團隊則是運用了內全反射螢光顯微系統 (total internal reflection fluorescence microscopy，又稱 TIRF)，將 DNA 貼附於玻片底層，再使用微量注射幫浦將第二類型限制性內切核酸酶 EcoRV 送入 DNA 所在的位置，觀察 EcoRV 尋找 DNA 辨識位點的路徑[9]。實驗中最特別的地方為 Bonnet 的研究團隊所使用的 DNA 並無 EcoRV 所能辨識到的特殊位點，此一動機是為了要觀察 EcoRV 在一維滑動(silding)與三維的跳躍(jumping)動作時於 DNA 結構中移動擴散尋找結合位點的情形，其一維滑動與三維跳躍的運動模式如圖 1-8[10]。與 2005 年 Wuite 的研究團隊的方法相較之下，雖然 Bonnet 的研究團隊利用不具 EcoRV 辨識位點的 DNA 分子，但使用 EcoRV 與有機染劑做結合，透過 TIRF 系統觀察單一 EcoRV 在 DNA 上的運動途徑；但此一方法也有缺點，雖然可以肉眼來觀看限制性內切核酸酶的反應途徑，但卻無法施予力量來檢測 EcoRV 與 DNA 的力化學反應機制。. 10.

(22) 圖 1-8 限制性內切核酸酶於 DNA 上的移動情形。上圖：為限制性內切核酸酶於 DNA 上做一維滑動(silding)的情形；下圖：為限制性內切酶於 DNA 上進行三維跳躍(jumping)的動作圖形。. 2001 年時 Williams 的研究團隊也將雷射光鉗系統應用於研究溫度效應對 DNA 力學形成的影響[11]。該研究所使用的系統是與 1996 年 Bustamante 的研究團隊的系統相近，利用兩道雷射聚焦於一點的能量捕獲乳膠珠，運用加熱系統，將玻片通道中的溫度從 11℃增加至 52℃，藉以觀察 DNA 在不同溫度下的變化，如圖 1-9 所示。由於 DNA 在過度拉伸區域會出現作用力誘導 DNA 雙股分離的結果改變，因此增加 DNA 所處的環境溫度將更易於雙股分離，使 DNA 本身能承受之拉利降低。而環境溫度變化在 40℃以下且作用力小於 50. 11.

(23) pN 時，DNA 拉伸曲線與室溫下的拉伸曲線並無太大的變化。但在此實驗中，圖 1-9 所顯示的拉伸力是從 40pN 開始，因此無法得知其在 40pN 以下時拉伸長度的變化量，因此本實驗將利用雷射光鉗系統，完整的呈現出在不同的溫度下，力量的變化對於拉伸長度的變化量。. 圖 1-9 DNA 在 500mM 的 NaCl 下，溫度與力量的變化圖。其中：11°C (□)，21°C (■)，28°C (◇)，31°C (◆)，35°C (△)，40°C (▲)，45°C (○)，與 52°C(●)。. 也因此本實驗將運用第二類型限制性內切核酸酶 EcoRI 接合量子點，以單分子操控術利用倒立式顯微鏡以單分子的角度觀察，當 DNA 在不同外力作用下第二類型限制內切核酸酶 EcoRI 結合位點的位移軌跡之時序影像，藉由此實驗期望未來可更進一步觀察 QD-EcoRI 結合DNA 的動態結合過程，獲得精準的酶切反應速率定量量測。. 12.

(24) 1-4 章節回顧第一章先簡介利用雷射光鉗系統來測詴第二類型限制性內切核酸酶的問題，並說明本實驗想要研究 DNA 與限制性內切核酸酶之間作用參數。藉由文獻回顧來說明 DNA 操作手法從巨觀至微觀的演進，以及相關的研究。第二章則要介紹本實驗將會使用的 EcoRI 與限制性內切核酸酶酶切 DNA 的基礎原理，以及單分子量測的基本介紹。第三章則是實驗系統的介紹，內容包含雷射光鉗的各部元件，加熱系統以及所使用的流速系統的介紹以及原理說明。第四章是實驗設計與方法，除了說明了實驗的流程與步驟之外，擷取影像的方式以及後續數據分析的方法都會做一個詳盡的介紹第五章為本實驗結果的呈現並同時討論實驗中所發生的現象。第六章為本實驗所得之結論說明。第七章為未來實驗中可繼續探討之方向。. 13.

(25) 第二章實驗原理限制性內切核酸酶 EcoRI 基本介紹. 2-1. 1972年時Boyer的實驗研究團隊從E. coli中發現了EcoRI這個限制性內切核酸酶[12]，能把 GAATTC 序列不對稱地切開，切口會形成黏端(sticky ends)。具有相同黏端的核酸片段，可以互相準確地黏在一起，在基因重組技術上有很大貢獻。EcoRI的DNA辨識位點由一股 DNA的5'端至3'端的核苷酸序列為GAATTC，而另一股DNA由5'端至 3'端的核苷酸序列也為GAATTC，此特性稱為迴文(palindrome)如圖 2-1[13]。. 圖 2-1 EcoRI 辨識 DNA 上的序列。圖中綠線為酶切 DNA 的序列位置。. 本實驗選用EcoRI來進行酶切DNA實驗是由於EcoRI對於DNA 上有五個辨識位點，而位點與位點間的距離又可清楚分辨，如圖2-2。而圖2-3為EcoRI接合DNA的結構示意圖[14,15]。在這過程中可以很清楚的了解到EcoRI如何對DNA作辨認，EcoRI螺旋部份會辨識到DNA 上的鹼基對，使其確認是否為EcoRI自身所辨識的特殊位點。 14.

(26) 圖 2-2 DNA 上 EcoRI 所擁有的辨識位點。從左到右分別為在 21226 bp、25104 bp、31747 bp、39168 bp 以及 44972 bp 等五個辨識點。. 圖 2-3 EcoRI 辨識位點結構示意圖。. 2-2. 高解析度雷射光鉗系統及位移檢測系統基本原理. 2-2.1 高解析度雷射光鉗基本原理雷射光自從被人類發明後，光學領域上的發展向前邁進一大步，高強度的雷射光使光與物質作用所產生的各種現象更為明顯。若是將一雷射由下而上入射，並使之聚焦，此時如果在聚焦點處放置一微米等級的微粒，此微粒將受到雷射光的光子不斷的撞擊，只要雷射的強 15.

(27) 度夠強，意即光子流的密度夠大，以及微粒的質量夠輕，那麼此微粒將因為光子對微粒的作用力與微粒所受的重力大小一樣，方向相反，則此微粒將會因力平衡而懸浮固定於空間中〃這個光子對微粒的作用力又被稱為光壓。 1970 年時 Ashkin 認為聚焦之雷射光極有可能推動數奈米等及大小的微粒，於是利用氬離子雷射聚焦至水中，並在水中置入直徑 0.59 至 2.68μm 的微粒，發現微粒沿著光軸加速被推離[16]。除了光軸方向上的推力，也發現在接近光束的微粒也會被橫向吸入光束後再被推離。之後作者改用氣泡與液滴重新進行實驗，歸納出光束對折射率比周圍介質高的微粒具有橫向吸力，但對折射率比周圍介質低的微粒具有橫向推力的結論。此種橫向作用力的存在，使 Ashkin 學者嘗詴將兩束雷射光相對聚焦於同一處，希望在兩束雷射的軸向作用力相抵消之處，產生一個可以將微粒橫向吸入並嵌住不動的位能井(potential well)。實驗結果相當成功，成為日後雙光束光鉗(deal-beam trap)的雛形，同時，這也是首次呈現出雷射光鉗。1986 年，又發現將單束雷射光高度聚焦，也可以在焦點處產生與光進行方向相反的軸向吸力，加上原有的橫向吸力，可將微粒穩定嵌住。這種單束雷射的光學嵌住，又稱為光鉗 (optical tweezers)[17]。. 16.

(28) 圖 2-4 雷射光鉗基礎原理示意圖。. 而雷射光鉗的基本概念則是將一道雷射光束經透鏡聚焦後，在雷射聚焦處形成一穩定的位能井。於是，在此焦點周圍的微粒子就會被吸引到焦點，而達到捕捉與操控的目的。利用簡單的幾何光學與動量變化產生力的概念來解釋雷射光鉗的原理，如圖2-4[18]，此圖是修改自Mameren 2002年的文章。當光線從一個介質中進入另一個不同的介質時，光會發生偏折的現象，也就是所謂的折射，當光線發生偏折的時候，光動量就會發生改變，動量改變即反應有作用力的存在，所以當雷射光線經過乳膠珠後發生偏折，此偏折所產生的力就由乳膠珠提供，也就是說乳膠珠對於雷射光施予一作用力使其偏折，又因為牛頓第三運動定律所描述之作用力等於反作用力，因此雷射光也對乳膠珠做一反作用力，而此作用力與反作用力就是雷射光鉗所擁有的捕捉. 17.

(29) 力。而若當雷射光過於發散，雷射光會將物體稍微的推離聚焦光束，因為由於物體受到雷射光束本身向上的推力，再加上物體本身移動的力形成力的向量因素，因此物體不會被光鉗所捕獲，而是會稍微的遠離光鉗中心，如圖2-5。因此可由以上描述所知，物體會網雷射聚焦處移動，因而受到雷射光鉗所捕獲，而本實驗將運用雷射光鉗系統結合高倍率的物鏡，達到操控DNA的目的。. 圖 2-5 雷射光發散的作用力示意圖。. 2-2.2 高解析度位移檢測雷射之原理 2002年Block研究團隊利用雷射光鉗系統搭配其位移檢測系統來進行實驗[19]，此位移檢測方式可測得當雷射光經過物鏡射入載玻片中此雷射光為一高斯光束(gaussian beam)。若微通道中被雷射光鉗所捕獲的乳膠珠因為外力影響而產生移動時，乳膠珠本身的散射球面波. 18.

(30) 緣(wave front)與高斯光束的波緣交互作用後，將會形成干涉條紋，而干涉條紋經過condenser後會呈像在condenser的背向焦平面(back focal plane)，此干涉條紋頭設置四象限光電感測器上，進而利用電腦程式將其位移變化記錄下來，如圖2-6所示。[18] 本實驗中位移檢測的 830nm雷射光路設計方面是仿造 2002 年 Block研究團隊[19]，利用830雷射光打入四象限光電感測器(quadrant photodiode，又稱QPD)，以電腦程式做操控，擷取物體因為位移所產生的電壓訊號。. 圖 2-6 乳膠珠的波緣與高斯光束的波緣形成正交產生干涉條紋，再將干涉條紋透過 condenser 成像於背向焦平面後，投射至四象限光電感應器上，以便記錄其位移變化量。. 19.

(31) 量子點(Quantum dots)及單分子螢光觀測系統基本介紹. 2-3 2-3.1. 量子點的基本介紹. 量子點(quantum dot)是準零維(quasi-zero-dimensional)的奈米材料，由少量的原子所構成。巨觀來看量子點三個維度的尺寸都在100 奈米(nm)以下，外觀恰似一極小的點狀物。許多研究學者已發展出多樣製備方式來製造量子點，且量子點會因不同種類的激發光會造成量子點有不同的波長反應，如圖2-7[20]。因此認為量子點會有極大的生物醫學應用潛力。而加州大學的研究團隊證明了CdSe/ZnS量子點具有光量化的特性[21]，也讓量子點開始被廣泛的應用，其主要原因是由於傳統有機染劑在經過光照射一段時間後，就會產生光漂白現象 (photobleaching)，使的染劑喪失了標定發光的作用，而量子點可接受光源長時間的激發，故可用於長時間的螢光訊號觀測。有關量子點與傳統有機染劑的差異性比較，如圖2-8所示[22]。. 20.

(32) 圖 2-7 量子點激發螢光之特性. 圖 2-8 量子點與一般有機染劑的差異。有機染劑(Alexa 488)在經過光源照射反應時間 180 秒後，已發生光漂白現象；然而相同照射時間內量子點 608(QD-608)仍能維持的一定的亮度。. 21.

(33) 本實驗所使用的量子點為QD 565，選用此波段之量子點是由於量子點本身具有較高的量子產率(quantum yield)，而量子產率越高，其所產生的螢光訊號也越佳，較適合單分子螢光訊號的觀測。而圖2-9 所顯示，量子效應最好的效果為QD 655，但因螢光激發後QD 655會發紅光，而本實驗所使用之乳膠珠在螢光激發下也為紅光，因此兩者的激發光就會互相重疊，而影響實驗結果判讀；所以實驗最後選用了量子產率大於50%且激發光非紅光的QD 565來進行實驗，並選擇適當的濾光片以排除乳膠珠對量子點螢光訊號的干擾。. 圖 2-9 量子點的量子效應的百分比。可藉由此圖中的表格來選用適當之量子點以方便進行實驗。. 2-3.2 單分子螢光觀測系統基本介紹而本實驗所使用 QD565 的激發光源為汞燈，利用汞燈與 QD565 做搭配，配合特殊規格之濾光片，可便於濾除多餘的背景雜訊，使擷取影像時可獲得較好的螢光訊號。實驗中所使用之濾光片如圖 2-10. 22.

(34) 所示。由於本實驗將限制性內切核酸酶 EcoRI 與 QD565 做結合 (conjugate)，搭配雷射光鉗系統與螢光顯微系統進行研究，可觀察 EcoRI 在微通道中的移動情形，此一觀測現象可以利用 MSD 系統來進行分析，以期望可藉由此檢測方式計算出 EcoRI 擴散係數與空間移動之位移路徑。. 圖 2-10 濾光片盒示意圖及光譜圖。上圖為濾光片盒的示意圖，與下圖相比對藍線為 excitation (EX)，綠線為 dichroic (D)以及紅線的 emission (EM)。. 23.

(35) 第三章：系統介紹雷射光鉗系統光路與元件介紹. 3-1. 雷射光鉗系統的光路約分為兩部份：第一部分為雙光束雷射光鉗系統(1064 nm)；第二部份為雷射位移偵測平台系統(830 nm)，如圖 3-1。由圖 3-1 中可以發現，1064 雷射光從雷射出口射出時，會先經過 L7 與 L8 兩個透鏡，通過這兩個透鏡會將雷射做 1:1 的擴束，再經由反射鏡導入第一個分光鏡(polarizing beam splitter，簡稱 PBS)進行分光的作用，將光路分為水平分量及垂直分量，本實驗利用焦距 50 mm (L4、L6) 與焦距 250 mm 的透鏡 (L3、L5) 將水平分量及垂直分量的光擴束為五倍，再以兩個焦距 150 mm 的透鏡兩個作 1:1 的擴束，再利用雙色分光鏡 (dchroic mirror) 引導光束至顯微鏡物鏡中，而圖中的掃瞄鏡 (scan)，可運用電腦程式來輔助操作掃描鏡轉動的動作，以控制 DNA 的拉伸長度以及拉伸速度。另外在實驗中所使用的四象限位移感測器對於波長在 830 nm 的波段有最佳的靈敏度，因此進入 QPD 前利用濾片將 1064 nm 雷射光濾除，使得 QPD 僅接收到波長為 830 nm 的位移檢測雷射訊號。實驗中利用掃描鏡與 L2 透鏡做共軛成像，而 L2 透鏡與物鏡也同時為共軛成像之關係，因此掃描鏡與物鏡便為共軛成像的關係。當實. 24.

(36) 驗利用 Labview 來控制掃描鏡轉動時，在物鏡上所呈現出來的影像，也會跟著作明顯的位移運動。. 圖 3-1 1064 nm 與 830 nm 雷射光路的整合圖。紅線為 1064 nm 雷射光鉗的路線圖；綠色虛線部份則為 830 nm 雷射位移檢測路線圖。圖中：L1、L2 以及 L9 為焦距 150 mm 的透鏡；L3 與 L5 為焦距 250 mm 的透鏡；L4、L6、L7、L8 以及 L10 為焦距 50 mm 之透鏡，D1 為反射 1064 nm 與 830 nm 之雙色分光鏡， QPD 則為四象限位移感測器. 25.

(37) 3-2. 加熱及溫控系統加熱系統為本實驗中一項重要的系統，利用四根加熱棒與玻片方. 向平行解等間格擺放，且由對稱設計來進行生物樣本的恆溫控制，同時運用溫度感測器來進行溫度的即時監控。圖 3-2 顯示實驗使用的加熱平台的設計，中間挖槽的部份是為了要放置玻片，使玻片放置於薄板的兩端，以此與加熱板作連接後進行加熱的效果，而加熱板的溫度最高溫可加熱至 400℃。本實驗中所使用的加熱板是商請愉樺工程公司代為製作。. 圖 3-2 溫度控制系統及微量注射系統。. 而溫度控制系統上，可使用的溫度操作範圍為室溫至 400℃，加熱的範圍由外向內加溫，會造成一個溫度梯度的差異性，因此最後利用一單點溫度感測器，來測量實驗使用之微通道內部的溫度是否已達到所需之要求，方便於實驗的進行。 26.

(38) 3-3. 微量流速控制系統本實驗中另一個重要環節就是微量注射幫浦系統的建立，在本實. 驗中需將含有乳膠珠以及 DNA 還有 EcoRI-QD 溶液分次送入微通道中，因此，本實驗中所使用的微量注射幫浦選購自天勝股份有限公司自製的 SP-M2，如圖 3-3 所示。此幫浦優點具有抽取與推進的功能，控制流量的範圍從 0.074 ul / sec 至 0.735 ml / sec。本實驗可以選擇利用抽取或推進的方式來將液體穩定的送入微流體通道。. 圖 3-3 高階微量注射幫浦. 27.

(39) 第四章：實驗流程與方法 4-1. 實驗流程. 配置溶液：  4℃下將DNA 與乳膠珠放入微量離心管中反應 30 分鐘。  配置高濃度酪蛋白 (5mg/mL casein) 及低濃度酪蛋白 (0.5 mg/mL)。  稀釋 QD-EcoRI 溶液比例為 1：50。  配置 5 mM EDTA 溶液。實驗流程： 1. 利用微量注射系統將 0.5 g / mL 酪蛋白溶液送入微通道中等待 5 分鐘後排出微通道。此舉是為利用酪蛋白本身有具有的黏性，將 0.5 g / mL 的酪蛋白溶液輸入微通道內，對通道表面進行處理，以減少實驗過程中有過多的 QD-EcoRI、DNA 與乳膠珠黏著於通道底部。 2. 再將反應後之DNA 溶液利用微量注射幫浦以 0.5 uL/sec 的速度送入微通道中。 3. 利用雷射光鉗系統將一組接合DNA 的乳膠珠鉗住後粘著於蓋玻片底部後移除其餘 DNA 。由於乳膠珠表面鍍有卵白素 (streptavidin)，而卵白素本身具有黏性，因此可利用此一特性將乳. 28.

(40) 膠珠黏著於玻片表面。 4. 通入 5 g / mL 酪蛋白溶液等待 5 分鐘後排除。其作用與第一步驟之酪蛋白溶液相同。 5. 經由微量注射幫浦將 QD-EcoRI 送入微通道中，觀察結合DNA 的螢光影像。 6. 將 EDTA 溶液送至微通道，觀察 QD-EcoRI 解離時的螢光影像。 4-2. 實驗材料與方法. 4-2.1 實驗所使用材料與儀器  噬菌體DNA. (細胞科技有限公司).  T4 連接酶. (New England Biolaabs).  DNA oligonucleotide. (Integrated DNA Technologies).  YM-30 微量濃縮離心管. (Millpore).  倒立式螢光顯微鏡. (TE2000-U, Nicon).  工業用鏡頭. (XC-ST 70, Sony).  冷卻式顯微鏡專用數位攝影機. (Luca-S EMCCD, Andor). 4-2.2 DNA 端點修飾法 1. 從DNA 原液中取出 100 λ 的 DNA，並各加入 14.3 λ 的 0.5M EDTA、5 M 的 NaCl 與 1 M 的 pH 值為 7.5 的 Tris。 2. 由步驟 1 取出 40 λ 的含有DNA 的溶液，加入 168 λ TE 溶液中，. 29.

(41) 在 65 ℃下加熱 30 分中，此舉是為了將DNA 從環形轉變為線形。. 圖 4-1 DNA - oligo 結構示意圖。. 3. 開環後 DNA 兩端會產生截面 (overhand) ，因此需用 DNA oligonucleotide 使其具有 Biotin 的端點，如圖 4-1。再加入兩種 Bio-oligo 溶液與 4.5 λ 的 10 倍 anneal buffer(內含 pH 7.5 的 100 mM 的 HEPES、1 M 的 NaCl 與 10 mM 的 EDTA)後取出溶液，放置於 YM-30 的上層空間中，再加入 pH 7.5 60 λ 50mM 的 Tris，利用 10000 轉的轉速再 4 ℃下離心 30 分鐘。此一動作重覆兩次，第二次離心時加入 105 λ 的 Tris 後運用相同轉速與溫度進行第二次離心。 4. 反轉 YM-30 的薄膜，置入 105 λ 的 Tris，利用 7000 轉的轉速在 4℃ 下離心 30 分鐘。利用離心過程將薄膜上的 DNA 洗下備用。 5. DNA 兩端點在與兩種 Bio-oligo 結合後，具有 Biotin 的端點，在 Bio-oligo 和 DNA 連接的地方會產生缺口 (nick) ，因此利用 T4-ligase 的特性來修補因 Bio-oligo 而產生之缺口。加入 105 λ 的 DNA、12 λ 的 T4-ligase 溶液與 1 λ 的 T4-ligase 後，放置於 4 ℃下靜置隔夜。 6. 靜置隔夜後的溶液加入 8 λ 的 EDTA 與 372 λ 的 30mM 混合液 (內 30.

(42) 含 HEPES 與 5mM 的 EDTA)於 YM-30 中，運用 10000 轉的轉速在 4℃下離心 30 分鐘。此一動作重覆兩次，是為了要將溶液中 Mg2+ 徹底的移除。 7. 反轉 YM-30 薄膜後加入 88λ 的混合液，在 7000 轉的轉速下於 4℃ 中離心 30 分鐘。 8. 最後取出 88 λ 含有DNA 之溶液，加入 2 λ 的 0.5M EDTA 與 10 λ 的 5M NaCl 後，保存於 4℃中備用。. 4-2.3 量子點表面標定限制性內切核酸酶 EcoRI 的製備與純化 1. 取出 10 λ 的 QD-565 加入 988 λ 的 10mM MES 與 2 λ 的 5M NaCl，配置成為 1000 λ。 2. 為了活化量子點表面的官能基，在 1000 λ 加入 5mg 的 EDCA 與 5mg 的 S-NHS 後，在室溫下震盪 90 分鐘後，離心器置上清液，在加入 1000 λ 10 mM 的 MES，利用 10000 轉在 4℃下離心 30 分鐘，此動作重複兩次。 3. 棄置上清液體，取出 EcoRI 溶液 15.4 λ 加入管中，再加入 485.6 λ 的 PBS 溶液，在室溫下靜置三小時，每 30 分攪拌一次。 4. 再以 10000 轉的轉速在 4℃下離心 30 分鐘，離心後棄置上清液體，此步驟重複兩次，而最後一次離心時加入之 PBS 溶液由 500 λ 減少至 100 λ，避免量子點因離心作用力而黏附管壁上造成損失。 31.

(43) 5. 最後保存於 100 λ 的 PBS 中，將 100 λ 的 QD-EcoRI 溶液以每 10 λ 分裝於微量離心管中備用。. 4-2.4 4-2.4.1. QD-EcoRI 活性及濃度測詴 QD-EcORI 活性測詴. 利用與量子點接合(conjugate)完成的限制性內切核酸酶 EcoRI 來觀察在單分子條件下，以 QD-EcoRI 與DNA 的結合能力，來評估 QD-EcoRI 的活性。實驗的方法為擷取 DNA. 4.35 3.71 . QD-EcoRI 於 37℃下反應 30 分鐘後. 加入. 4.89 . CaCl2 溶液(C buffer) 7.34 mM DTT. 2 . 5 mg per mL casine. 1 2.4 . 10 mM Tris. 總體積為 混合均勻後送入微通道中，利用 UV 光在倒立式顯微鏡下作觀察。利用顯微鏡進行觀察時，本實驗在微通道中之特定範圍內觀察量子點的動態分布，評估 EcoRI 在與量子點進行接合後，活性是否有受到其影響。圖 4-2 為實驗示意圖。 32.

(44) 100 μ m. Blocking by casein. Slide. 100 μ m. 110 nm 82.3 nm. QD-EcoRI sticking. Cover glass. on cover glass. 60 x magnificatio n. Objectiv. QD - EcoRI concentrat ion (M ). 60X. N QD  EcoRI     (6.02 10 23 mole 1 )   16 3   8.23 1.10 1.00 10 dm  N QD  EcoRI  10 8 M 5.45. Nikon. e. Tube lens 4.94 mm EMCCD sensor chip 6.58 mm. 圖 4-2 QD-EcoRI 活性及濃度計算實驗示意圖. 4-2.4.2. QD-EcoRI 濃度計算. 為了定量空間中量子點的濃度將：. 不含酪蛋白之 QD-EcoRI 溶液. 3.71 m. EcoRI 保存溶液 (E buffer). 14.64m. 混合後反應 30 分鐘，再輸送至雙面膠製作之微通道，如圖 4-2。靜候 30 分鐘等待量子點沉降至玻片底部後，透過 Luca CCD 來擷取影像計算量子點的濃度。. 33.

(45) 4-2.5. 微通道厚度測詴法. 本實驗利用雙面膠 (ScotcH, 1/2 IN x 250 IN, 6.9YD)將蓋玻片固定於載玻片上後形成微通道。將製作好的微通道倒立於載台上。通道內的兩面做一特殊記號，利用物鏡(40x, Nicon)調整焦距至蓋玻片記號區，讀取物鏡鼻輪刻度紀錄下來，再將物鏡聚焦點調整至看到蓋玻片上的記號區後再讀取刻度，以此計算微通道的高度，實驗示意圖如圖 4-3。. 圖 4-3 (A) 微通道高度測詴記號示意圖；(B) 微通道高度測詴法示意. 34.

(46) 第五章實驗結果與討論 5-1 流速系統穩定性測詴實驗中為了要清楚微量注射幫浦的穩定性，因此針對微量注射幫浦設計一個流量分析模式(flow model)來進行系統穩定測詴。測詴的方法示意圖如圖 5-1。首先利用微量天秤進行軟管端 (A) 的秤重後，可得 A 端體積約為 18.4 ul；而玻片上微通道 (B) 體積經過微量天秤進行秤量後，得 B 端體積約為 21.8 ul。因此從 A 至 B 的總體積計算可得約為 40.2 ul。流量穩定測詴是利用 1 CC 針筒進行抽取測詴，計算系統設定值與實際測量值的誤差值。經過多次先期測詴後，可得當系統設定抽取 25 ul 時，其實際汲取體積量約等同 A 段體積；而系統設定抽取 50 ul 時，可得與 B 段相似的體積值。. 汲取溶液移除溶液. A. B. 圖 5-1 流量控制系統示意圖. 35.

(47) 實際輸送體積 (L). 95 85 V輸送 = 0.9751 V設定 - 2.226 75. 2. R =1. 65 55 45 35 35. 45. 55. 65. 75. 85. 95. 微量注射幫浦設定值 (L). 圖 5-2 微量注射系統設定及實際汲取溶液的體積關係。. 反覆進行測詴後可得系統設定及實際汲取溶液量之關係圖，如圖 5-2。由圖 5-2 可知此微量幫浦系統在實驗實際會用到的汲取體積範圍(19~40 uL)內，其設定的汲取容積和實際抽取的體積呈線性關係。此關係可用線性方程式來表示( V 汲取 = 0.9059V 設定 – 2.953 )。根據此關係式，可推得在 19~40L 的體積範圍內抽取溶液時，系統應當設定的體積為 25~50 L。另一方面同時測詴輸送功能的穩定性。與汲取相同模組的設計方式，將系統輸送之設定值設定為 A 端加上 B 端的總體積 45 ul 與雙倍體積 90 ul 兩個範圍，進行輸送體積誤差的詴驗。反覆進行測詴後可得系統設定及實際輸送溶液量之關係圖，如圖 5-3。 36.

(48) 實際輸送體積 (L). 95 85 V輸送 = 0.9751 V設定 - 2.226 75. 2. R =1. 65 55 45 35 35. 45. 55. 65. 75. 85. 95. 微量注射幫浦設定值 (L). 圖 5-3 微量注射系統設定及實際輸送溶液的體積關係。. 由圖 5-3 可知此微量幫浦系統在實驗中實際會用到的輸送體積範圍(40~80 L)內，其設定的汲取容積和實際抽取的體積呈線性關係。此關係可用線性方程式來表示( V 輸送 = 0.9751V 設定 – 2.226 )。根據此關係式，可推得在 40~80L 的體積範圍內抽取溶液時，系統應當設定的體積為 45~90 L。. 5-2 流體穩定性詴驗分析當 DNA-bead 經由微量注射幫浦的汲取方式進入玻片上的微通道後，經由 CCD 觀察乳膠珠在微通道中移動的情形。圖 5-4 為利用 Labview 來控制 CCD 所拍攝的時序影像圖，每 50 毫秒擷取一張影像，獲取影像時序圖。圖中黃色箭頭為微量注射幫浦 37.

(49) 輸送液體時乳膠珠的移動情形。得知微量注射系統在汲取或輸送乳膠珠時微通道中流動的穩定性，顯示出微通道中不會出現暴衝的現象，而由圖 5-4 中有四個乳膠珠，上面兩個為黏附在蓋玻片表面上的乳膠珠；下面兩個為利用雷射光鉗系統捕獲住之乳膠珠。由時序圖中可以發現，靠近玻片底層之區域，液體流動速度接近於零。因此可得知若將乳膠珠黏於蓋玻片上，可以使乳膠珠不受液體流動的速度影響；而利用光鉗將乳膠珠捕獲後往玻片底部靠近，因雷射光鉗箝制力較高，使乳膠珠不因流速而脫離雷射光鉗。. 圖 5-4 利用 Labview 透過 CCD 擷取微量注射幫浦輸送液體時的時序影像圖，其中流體流動方向為由右往左輸送。(A) 0 秒時所拍攝的影像；(B)為 200 毫秒時的影像；(C) 400 毫秒時的影像；(D) 600 毫秒時的影像 38.

(50) 5-3 微通道高度測詴實驗中在不同玻片上製作微通道，每個微通流道進行三次高度測詴後，結果顯示於表 5-1 及圖 5-5。從實驗結果中可得知利用雙面膠製作微通道時，通道內部高度平均為 100 (± 0.5) m。結果顯示使用雙面膠製作微通道時的高度是穩定。在確定高度後，將進行 QD-EcoRI 於微通道中的濃度估算。表 5-1 微通道厚度測詴數值結果。 Chamber depth Height (mm). SD (mm). N. 1. 100.23. 0.55. 5. 2. 99.40. 0.53. 5. 3. 100.53. 0.50. 5. mean. 100.05. 0.59. 15. 微通道高度 (m). sample. 101.5 101 100.5 100 99.5 99 98.5 98 97.5 1. 2 玻片編號. 圖 5-5 微通道高度測詴結果圖。. 39. 3.

(51) 5-4 QD-EcoRI 濃度及活性測詴 5-4-1 QD-EcoRI 濃度測詴本節利用 QD-EcoRI 會黏附在蓋玻片表面上的特性，進行微通道中 QD-EcoRI 濃度計算。當 QD-EcoRI 由原液稀釋 100 倍後通入微通道，迨 QD-EcoRI 都黏附在底部時，經由 EMCCD 拍攝出來的量子點螢光影像，如圖 5-6。. 圖 5-6 利用 Luca CCD 擷取之 QD-EcoRI 影像圖。(A)微通道中心處； (B)微通道靠近上方雙面膠處；(C)微通道靠近下方雙面膠處；(D)微通道中間偏右 2 mm；(E)微通道中間偏左 2 mm。. 利用圖 5-6 來進行 QD-EcoRI 個數計算，可得到在玻片中各個位置的 QD-EcoRI 個數(N)，如表 5-2。從表中可得 N 值約為 54 ± 4，將 N 值帶入公式 5-1 中可得 QD-EcoRI 之濃度值。. 40.

(52) 表 5-2 統計特定位點上 QD-EcoRI 個數位置個數. (A). (B). (C). (D). (E). 50. 55. 60. 51. 52. 平均標準差 54. 4. (N) QD - EcoRI concentrat ion (M ) N QD  EcoRI     (6.02  1023 mole 1 )   10 3   8.23  1.10  1.00  10 dm  N QD  EcoRI   1014 M 5.45. 5-1. 利用公式 5-1 計算濃度，可得 QD-EcoRI 濃度為 9.83 ± 0.74 × 10-14 M，又因微通道中的 QD-EcoRI 濃度為稀釋 100 倍之濃度，因此需將 9.83 × 10-14 M 乘以 100 倍後所得數據：9.83 ± 0.74 × 10-12 M，方為原始溶液中 QD-EcoRI 濃度。. 5-4-2 QD-EcoRI 活性測詴在比對λDNA 的序列後，可得知λDNA 上有 5 個 EcoRI 的辨識位點。EcoRI 本身是利用 Mg2+的作用來酶切 DNA，因此本實驗利用 Ca2+取代 Mg2+使 EcoRI 不會進行酶切作用，使 QD-EcoRI 與λDNA 進行結合，在 37℃下反應 30 分鐘，利用 QD-EcoRI 與λDNA 的結合能力，來評估單分子條件下 QD-EcoRI 的活性。利用倒立式螢光顯微鏡觀測空間中具有許多成對分佈的量子點，單一存在的量子點次之，並存在有極少數三顆以上分布之量子 41.

(53) 點，由於量子點本身在空間中均會進行布朗運動，若無與 DNA 本身進行結合，則會由於本身的布朗運動而不會出現成對分佈亦或三顆以上分佈的量子點存在。圖 5-7 說明λDNA 與 QD-EcoRI 結合時的影像圖。但由於三顆以上分佈的量子點在空間中十分稀少，因此本實驗評估 QD-EcoRI 活性時僅考慮量子點出現單一存在或是成對分佈之兩種量子點存在的情況。. 圖 5-7 λDNA 結合 QD-EcoRI 所呈現之影像圖。. 而評估具有λDNA 結合能力之 QD-EcoRI 含量為：  QDm  2     100% ≧ QD-EcoRI binding DNA activity  QDm  2  QDs . 5-2. QDs：單一存在量子點的組數 QDm：成對分布量子點的組數而實驗在特定範圍內觀察量子點的動態分布約搜尋到單一存在的量子點(QDs)約有 20 組；成對分布之量子點組數(QDm)約有 38 組。利用 42.

(54) 公式 5-2 帶入數據計算具有λDNA 結合能力之 QD-EcoRI 含量結果為： QD-EcoRI binding DNA activity ≧ 79.1 % 以上實驗結果證明，QD-EcoRI 對於λDNA 上的特殊位點，至少有 79.1%的位點辨識度，而剩餘單獨存在的量子點，或許只是並無與λ DNA 進行結合。此結論是由於在實驗中觀察到單純單一的量子點，在空間中的布朗運動是十分快速的，而若是與 DNA 有進行結合的量子點，則會呈現較為緩慢的布朗運動。另外藉由 EMCCD 影像顯示，當 QD-EcoRI 與λDNA 做結合後與單純量子點時空間中的移動擴散速度相較之下，有與λDNA 做結合之 QD-EcoRI 移動速度是較單純量子點緩慢。因此將來可藉由觀察量子點的移動過散速度來進行 QD-EcoRI 活性估算。. 5-5 λDNA 於不同外力作用下 QD-EcoRI 結合位點與移動軌跡的動態時序觀測本節利用對λDNA 施予不同的外力 (1 pN 以及 14 pN)觀察力量對於 QD-EcoRI 結合位點後的位移變化量，透過 EMCCD 擷取時序影像圖，來計算出 QD-EcoRI 在結合位點上的移動軌跡圖。. 43.

(55) 5-5-1 對λDNA 施加 1 pN 拉力時 QD-EcoRI 結合位點與移動軌跡的動態時序觀測實驗中利用高解析度雷射光鉗搭配螢光顯微系統，捕獲住λDNA 兩端的乳膠珠後施予低拉力，再將乳膠珠黏置於玻片底部，進行 QD-EcoRI 螢光訊號觀測，實驗結果如圖 5-8。. 圖 5-8 (A)λDNA 拉伸長度與受力變化圖；(B) 乳膠珠黏至玻片底部後，關閉雷射光顯示出的圖形，其亮點為 EcoRI 辨識到λDNA 上特殊位點進行結合；(C) EcoRI 辨識到λDNA 上特殊位點的連續影像； (D) λDNA 上 EcoRI 的辨識位點。. 44.

(56) 圖中觀察到在靠近左端乳膠珠有一螢光亮點，將此螢光亮點與λ DNA 辨識位點示意圖做比較後發現此螢光亮點與辨識位點 44972 bp 位置相符合，因此可認為此螢光亮點坐落於辨識位點 44972 bp 處。圖結果顯示，此螢光亮點只進行小幅度的布朗運動，隨著λDNA 的擺動而做小幅度的晃動，因此藉此關係確認螢光亮點結合於λDNA 上的螢光亮點。. 5-5-2 對λDNA 施加 14 pN 拉力時 QD-EcoRI 結合位點與移動軌跡的動態時序觀測本節探討對λDNA 施予些微力量的拉力(14 pN)時，QD-EcoRI 結合後的表現是否會與 1 pN 有所不同。實驗中將λDNA 結合乳膠珠之溶液利用微量注射幫浦送入微通道中，找尋結合乳膠珠後的 λ DNA，透過雷射光鉗系統將乳膠珠固定於蓋玻片底部，此舉是由於在實驗中需要調整物鏡上下觀測待測物質距離觀測點的距離，若利用雷射光鉗箝制住乳膠珠，調整物鏡便會使原本箝制住之乳膠珠脫離光鉗，徒增實驗之困難性。乳膠珠在固定於玻片底部後將 QD-EcoRI 溶液送入微通道中與λDNA 做接觸，使其結合λDNA 上特殊位點。透過 QD-EcoRI 觀察結合λDNA 後螢光亮點的移動軌跡，實驗結果如圖 5-9。從圖 5-9 中觀察當λDNA 受到 14 pN 的拉力時與受力 1 pN 的時 45.

(57) 序影像圖比較後得知，當λDNA 受到 1 pN 的拉力時，QD-EcoRI 在結合位點後，其位移軌跡有較為明顯的變化；而受到 14 pN 的拉力時，QD-EcoRI 在與位點結合後的位移軌跡並無十分明顯的移動。而透過影像分析程式進行分析後可得更詳細之 QD-EcoRI 向量位移軌跡圖，如圖 5-10。圖中顯示 QD-EcoRI 剛接合λDNA 經過 180 秒後， QD-EcoRI 雖已與位點結合，但仍沿著 X 軸方向左右擺盪，此時左右擺盪之情形可參考圖(A)的一維移動示意圖，在 QD-EcoRI 結合到位點上後，會先進行小幅度的 X 軸方向的移動。圖 5-10 的(A)圖可顯示出其速度向量皆指向中心的結合位點；結合時間經過 420 秒鐘後，可從圖 5-10 (B)的向量位移軌跡圖發現到 QD-EcoRI 的 X 軸方向的移動量比起 180 秒時的還要少，此一現象可解釋為 EcoRI 結合λDNA 在經過一段時間後結合反應完成，因此 X 軸方向的位移變化量就會減少。而在圖 5-10 中可看到 Y 方向的位移不論時間長短幾乎是相同的，這是由於 QD-EcoRI 結合上λDNA 後，便隨著 DNA 的擺盪進行位移運動。因此 Y 方向之位移是源自於λDNA 的上下擺盪。圖 5-11 中更能顯示出 QD-EcoRI 位置的時空變化關係，經過一段時間後，X 方向的位移量會減少，使 QD-EcoRI 結合λDNA 的作用更穩固。而圖中更能進一步的証實 QD-EcoRI 在結合上λDNA 後，Y 方向的位移表現是隨著 DNA 的運動而移動著。. 46.

(58) 圖 5-9 (A) λDNA 拉伸長度與受力變化圖；(B) λDNA 上 EcoRI 的辨識位點；(C) 利用雷射光鉗將乳膠珠箝制後粘著於玻片底部之影像；(D) QD-EcoRI 結合λDNA 特殊位點；(E) QD-EcoRI 與λDNA 結合後之時序影像圖。. 47.

(59) 圖 5-10 QD-EcoRI 結合λDNA 後的向量位移軌跡圖。(A) QD-EcoRI 接結合λDNA 經過 180 秒；(B)QD-EcoRI 結合λDNA 經過 420 秒。. (A). (B) 40. 70. 30. 60 50. 20. 40. 10. 30. Y (nm). Y (nm). 20 10 0. 0 -10. -10. -20. -20. -30. -30. -40. -40 -50 -60 40. 20. X (nm0 ). -20. 0. 1. 2. 3. 4. 6. e (s e Tim 5. 7. 8. 9. 10. -50. c). 20. 0. X (nm ). -20. 0. 1. 2. 3. 4. 5. e Tim. 6. (s ec. 7. 8. 9. ). 圖 5-11 QD-EcoRI 結合 λ DNA 後 X-Y 方向移動軌跡圖。 (A) QD-EcoRI 結合λDNA 經過 180 秒；(B)QD-EcoRI 結合λDNA 經過 420 秒。. 5-6 QD-EcoRI 與λDNA 結合與解離反應觀測 48. 10.

(60) QD-EcoRI 結合酶切λDNA 的反應需要 Mg2+，而在本實驗由於要觀察 QD-EcoRI 的結合情形，因此將 Mg2+置換為 Ca2+避免發生酶切反應。在 QD-EcoRI 和λDNA 結合的反應中意外發現，當溶液中含有約 1 mM 的 EDTA 時，溶液中的二價離子會被 EDTA 所隔離，造成 QD-EcoRI 無法接合上λDNA。因此推測此結合反應為可逆。本實驗利用已結合上λDNA 之 QD-EcoRI 來進行解離反應實驗。先準備濃度為 5 mM 之 EDTA 溶液，利用微量注射幫浦送入微通道中觀察 QD-EcoRI 從λDNA 識別位點的解離過程。實驗結果如圖 5-12。圖中可以清楚的看到當 5 mM 的 EDTA 溶液尚未到達微通道中 QD-EcoRI 位置時，QD-EcoRI 穩定的接合在λDNA 上(t = 0)。當 EDTA 溶液從微通道中經過時，QD-EcoRI 便快速的從λDNA 上掉落，這是因為 EDTA 將環境中的二價離子移除，使原本穩定接合的 QD-EcoRI 因為二價離子被移除而造成脫離的現象(t = 2.0s 以及 t = 2.2s)。藉由上述觀測，在 Ca2+離子條件下 QD-EcoRI 與λDNA 的結合與解離反應為一可逆反應。. 49.

(61) 圖 5-12 EDTA 溶液 (5 mM)使 QD-EcoRI 從λDNA 解離脫落。. 第六章結論本實驗利用高解析度雷射光鉗系統搭配螢光顯微技術觀察限制性內切核酸酶 EcoRI 酶切 λDNA 反應情形，目前實驗已成功利用系統來進行以下實驗： 50.

(62) 1. 結合微量注射系統，觀察利用微量注射幫浦將 QD-EcoRI 送入微通道中與λDNA 結合後，所產生不同的移動軌跡，來證明對λ DNA 施予不同力量，會影響 EcoRI 接合λDNA 移動反應。實驗中對λDNA 施予 1 pN 以及 14 pN 的拉力，來觀察 QD-EcoRI 的移動軌跡，發現當對λDNA 施予 1 pN 的力量時，QD-EcoRI 結合上辨識位點後所產生的位移變化量較大，顯示出λDNA 由於受到外力的影響小，因此在兩個乳膠珠之間仍可進行小幅度的擺盪。然而對 DNA 施予 14 pN 的力量時，QD-EcoRI 結合上辨識位點後所產生的位移變化量較小。而從 14 pN 的 X-Y-T 圖中可很清楚的觀察到當 QD-EcoRI 結合至位點後，會對於所處的位置進行 X 方向小幅度的移擺盪，並隨著結合時間的增加而減少擺盪；Y 方向的位移變化量則是 QD-EcoRI 隨著λDNA 擺盪而產生的位移量。 2. 利用 EDTA 溶液進入 QD-EcoRI 的微通道後，成功觀察到 QD-EcoRI 與DNA 由結合狀態過渡到解離狀態的反應過程。實驗結果顯示，當 5 mM 的 EDTA 溶液經由微量注射幫浦送入微通道後，實驗中 QD-EcoRI 結合λDNA 的樣品，在 EDTA 溶液通過後從結合位點上解離掉落，並隨著流體移動至觀測區域外。. 51.

(63) 第七章未來方向 1. 本實驗了解 QD-EcoRI 接合 λ DNA 後的移動軌跡，也證實 QD-EcoRI 接合λDNA 的反應是可利用 EDTA 溶液來進行可逆反應。目前尚未觀察到 QD-EcoRI 是如何接合到λDNA 上的位點，. 52.

(64) 因此將來要控制 Ca2+在微通道中的濃度，此方式可以增加溶液中 QD-EcoRI 的量，實驗中才有機會以 QD-EcoRI 的擴散移動行為，增加 QD-EcoRI 接合λDNA 的成功率，進而觀察 QD-EcoRI 與λ DNA 的動態結合過程，藉以計算 QD-EcoRI 酶切 DNA 時力化學反應參數。 2. 實驗將加入溫度控制系統，觀察當溫度設定改變時λDNA 被 QD-EcoRI 酶切時的力化學反應參數有何差異性。 3. 本實驗中所用之微量注射幫浦所帶來的液體流動速度，帶走從λ DNA 上解離的 QD-EcoRI，使此可逆反應的現象並無法觀測清楚，未來來將控制溶液中 Ca2+ 觀測解離動態反應行為，計算 QD-EcoRI 從λDNA 解離之反應速率參數。. 第八章參考文獻 1.. 2.. Kim, K., Modrich, P. and Kim, S-H.. 'Interactive' recognition in EcoK1 restriction enzyme-DNA complex. Nucleic Acids Research, 12, 7285-7202 (1984) Bram van den Broek, Maarten C. Noom and Gijs J. L. Wuite DNA-tension dependence of restriction enzyme activity reveals mechanochemical properties of the reaction pathway. Nucleic Acids 53.

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