4-1 實驗流程 配置溶液：
4℃下將DNA 與乳膠珠放入微量離心管中反應 30 分鐘。
配 置 高 濃 度 酪 蛋 白 (5mg/mL casein) 及 低 濃 度 酪 蛋 白 (0.5 mg/mL)。
稀釋 QD-EcoRI 溶液比例為 1：50。
配置 5 mM EDTA 溶液。
實驗流程：
1. 利用微量注射系統將 0.5 g / mL 酪蛋白溶液送入微通道中等待 5 分鐘後排出微通道。此舉是為利用酪蛋白本身有具有的黏性，將
0.5 g / mL 的酪蛋白溶液輸入微通道內，對通道表面進行處理，
以減少實驗過程中有過多的 QD-EcoRI、DNA 與乳膠珠黏著於通 道底部。
2. 再將反應後之DNA 溶液利用微量注射幫浦以 0.5 uL/sec 的速度送 入微通道中。
3. 利用雷射光鉗系統將一組接合DNA 的乳膠珠鉗住後粘著於蓋玻 片 底 部 後 移 除 其 餘DNA 。 由 於 乳 膠 珠 表 面 鍍 有 卵 白 素 (streptavidin)，而卵白素本身具有黏性，因此可利用此一特性將乳
膠珠黏著於玻片表面。
4. 通入 5 g / mL 酪蛋白溶液等待 5 分鐘後排除。其作用與第一步驟 之酪蛋白溶液相同。
5. 經由微量注射幫浦將 QD-EcoRI 送入微通道中，觀察結合DNA 的 螢光影像。
6. 將 EDTA 溶液送至微通道，觀察 QD-EcoRI 解離時的螢光影像。
4-2 實驗材料與方法
4-2.1 實驗所使用材料與儀器
噬菌體DNA (細胞科技有限公司)
T4 連接酶 (New England Biolaabs)
DNA oligonucleotide (Integrated DNA Technologies)
YM-30 微量濃縮離心管 (Millpore)
倒立式螢光顯微鏡 (TE2000-U, Nicon)
工業用鏡頭 (XC-ST 70, Sony)
冷卻式顯微鏡專用數位攝影機 (Luca-S EMCCD, Andor)
4-2.2 DNA 端點修飾法
1. 從DNA 原液中取出 100 λ 的 DNA，並各加入 14.3 λ 的 0.5M EDTA、5 M 的 NaCl 與 1 M 的 pH 值為 7.5 的 Tris。
2. 由步驟 1 取出 40 λ 的含有DNA 的溶液，加入 168 λ TE 溶液中，
在 65 ℃下加熱 30 分中，此舉是為了將DNA 從環形轉變為線形。
圖 4-1 DNA - oligo 結構示意圖。
3. 開 環 後 DNA 兩 端 會 產 生 截 面 (overhand) ， 因 此 需 用 DNA oligonucleotide 使其具有 Biotin 的端點，如圖 4-1。再加入兩種 Bio-oligo 溶液與 4.5 λ 的 10 倍 anneal buffer(內含 pH 7.5 的 100 mM 的 HEPES、1 M 的 NaCl 與 10 mM 的 EDTA)後取出溶液，放置於 YM-30 的上層空間中，再加入 pH 7.5 60 λ 50mM 的 Tris，利用 10000 轉的轉速再 4 ℃下離心 30 分鐘。此一動作重覆兩次，第二次離心 時加入 105 λ 的 Tris 後運用相同轉速與溫度進行第二次離心。
4. 反轉 YM-30 的薄膜，置入 105 λ 的 Tris，利用 7000 轉的轉速在 4℃
下離心 30 分鐘。利用離心過程將薄膜上的 DNA 洗下備用。
5. DNA 兩端點在與兩種 Bio-oligo 結合後，具有 Biotin 的端點，在 Bio-oligo 和DNA 連 接 的 地 方 會 產 生 缺 口 (nick) ， 因 此 利 用 T4-ligase 的特性來修補因 Bio-oligo 而產生之缺口。加入 105 λ 的 DNA、12 λ 的 T4-ligase 溶液與 1 λ 的 T4-ligase 後，放置於 4 ℃下 靜置隔夜。
含 HEPES 與 5mM 的 EDTA)於 YM-30 中，運用 10000 轉的轉速在 4℃下離心 30 分鐘。此一動作重覆兩次，是為了要將溶液中 Mg2+
徹底的移除。
7. 反轉 YM-30 薄膜後加入 88λ 的混合液，在 7000 轉的轉速下於 4℃
中離心 30 分鐘。
8. 最後取出 88 λ 含有DNA 之溶液，加入 2 λ 的 0.5M EDTA 與 10 λ 的 5M NaCl 後，保存於 4℃中備用。
4-2.3 量子點表面標定限制性內切核酸酶 EcoRI 的製備與純化
1. 取出 10 λ 的 QD-565 加入 988 λ 的 10mM MES 與 2 λ 的 5M NaCl，
配置成為 1000 λ。
2. 為了活化量子點表面的官能基，在 1000 λ 加入 5mg 的 EDCA 與 5mg 的 S-NHS 後，在室溫下震盪 90 分鐘後，離心器置上清液，
在加入 1000 λ 10 mM 的 MES，利用 10000 轉在 4℃下離心 30 分 鐘，此動作重複兩次。
3. 棄置上清液體，取出 EcoRI 溶液 15.4 λ 加入管中，再加入 485.6 λ 的 PBS 溶液，在室溫下靜置三小時，每 30 分攪拌一次。
4. 再以 10000 轉的轉速在 4℃下離心 30 分鐘，離心後棄置上清液體，
此步驟重複兩次，而最後一次離心時加入之 PBS 溶液由 500 λ 減 少至 100 λ，避免量子點因離心作用力而黏附管壁上造成損失。
5. 最後保存於 100 λ 的 PBS 中，將 100 λ 的 QD-EcoRI 溶液以每 10 λ 分裝於微量離心管中備用。
4-2.4 QD-EcoRI 活性及濃度測詴 4-2.4.1 QD-EcORI 活性測詴
利用與量子點接合(conjugate)完成的限制性內切核酸酶 EcoRI 來 觀察在單分子條件下，以 QD-EcoRI 與DNA 的結合能力，來評估
QD-EcoRI 的活性。
實驗的方法為擷取 DNA 4.35
QD-EcoRI 3.71
於 37℃下反應 30 分鐘後
加入 CaCl2溶液(C buffer) 4.89 7.34 mM DTT 2
5 mg per mL casine 1 10 mM Tris 2.4
總體積為
混合均勻後送入微通道中，利用 UV 光在倒立式顯微鏡下作觀察。
利用顯微鏡進行觀察時，本實驗在微通道中之特定範圍內觀察量子點 的動態分布，評估 EcoRI 在與量子點進行接合後，活性是否有受到
4-2.4.2 QD-EcoRI 濃度計算
EMCCD sensor chip Slide
Cover glass
100 μ m Blocking by casein
110 nm 82.3 nm
100 μ m
QD-EcoRI sticking on cover glass
M
4-2.5 微通道厚度測詴法
本實驗利用雙面膠 (ScotcH, 1/2 IN x 250 IN, 6.9YD)將蓋玻片固 定於載玻片上後形成微通道。將製作好的微通道倒立於載台上。通道 內的兩面做一特殊記號，利用物鏡(40x, Nicon)調整焦距至蓋玻片記號 區，讀取物鏡鼻輪刻度紀錄下來，再將物鏡聚焦點調整至看到蓋玻片 上的記號區後再讀取刻度，以此計算微通道的高度，實驗示意圖如圖 4-3。
圖 4-3 (A) 微通道高度測詴記號示意圖；(B) 微通道高度測詴法示意