5-1 流速系統穩定性測詴
實驗中為了要清楚微量注射幫浦的穩定性，因此針對微量注射幫 浦設計一個流量分析模式(flow model)來進行系統穩定測詴。測詴的 方法示意圖如圖 5-1。首先利用微量天秤進行軟管端 (A) 的秤重後，
可得 A 端體積約為 18.4 ul；而玻片上微通道 (B) 體積經過微量天秤 進行秤量後，得 B 端體積約為 21.8 ul。因此從 A 至 B 的總體積計算 可得約為 40.2 ul。
流量穩定測詴是利用 1 CC 針筒進行抽取測詴，計算系統設定值 與實際測量值的誤差值。經過多次先期測詴後，可得當系統設定抽取 25 ul 時，其實際汲取體積量約等同 A 段體積；而系統設定抽取 50 ul 時，可得與 B 段相似的體積值。
圖 5-1 流量控制系統示意圖 移除溶液
A B
汲取溶液
V輸送 = 0.9751 V設定 - 2.226
V輸送 = 0.9751 V設定 - 2.226
輸送液體時乳膠珠的移動情形。得知微量注射系統在汲取或輸送乳膠 珠時微通道中流動的穩定性，顯示出微通道中不會出現暴衝的現象，
而由圖 5-4 中有四個乳膠珠，上面兩個為黏附在蓋玻片表面上的乳膠 珠；下面兩個為利用雷射光鉗系統捕獲住之乳膠珠。由時序圖中可以 發現，靠近玻片底層之區域，液體流動速度接近於零。因此可得知若 將乳膠珠黏於蓋玻片上，可以使乳膠珠不受液體流動的速度影響；而 利用光鉗將乳膠珠捕獲後往玻片底部靠近，因雷射光鉗箝制力較高，
使乳膠珠不因流速而脫離雷射光鉗。
圖 5-4 利用 Labview 透過 CCD 擷取微量注射幫浦輸送液體時的時序 影像圖，其中流體流動方向為由右往左輸送。(A) 0 秒時所拍攝的影 像；(B)為 200 毫秒時的影像；(C) 400 毫秒時的影像；(D) 600 毫秒時
5-3 微通道高度測詴
Chamber depth
sample Height (mm) SD (mm) N
5-4 QD-EcoRI 濃度及活性測詴 5-4-1 QD-EcoRI 濃度測詴
本節利用 QD-EcoRI 會黏附在蓋玻片表面上的特性，進行微通道 中 QD-EcoRI 濃度計算。當 QD-EcoRI 由原液稀釋 100 倍後通入微通 道，迨 QD-EcoRI 都黏附在底部時，經由 EMCCD 拍攝出來的量子點 螢光影像，如圖 5-6。
圖 5-6 利用 Luca CCD 擷取之 QD-EcoRI 影像圖。(A)微通道中心處；
(B)微通道靠近上方雙面膠處；(C)微通道靠近下方雙面膠處；(D)微通 道中間偏右 2 mm；(E)微通道中間偏左 2 mm。
利用圖 5-6 來進行 QD-EcoRI 個數計算，可得到在玻片中各個位置的 QD-EcoRI 個數(N)，如表 5-2。從表中可得 N 值約為 54 ± 4，將 N 值 帶入公式 5-1 中可得 QD-EcoRI 之濃度值。
表 5-2 統計特定位點上 QD-EcoRI 個數
點，由於量子點本身在空間中均會進行布朗運動，若無與 DNA 本身
公式 5-2 帶入數據計算具有λDNA 結合能力之 QD-EcoRI 含量結果 為：
QD-EcoRI binding DNA activity ≧ 79.1 %
以上實驗結果證明，QD-EcoRI 對於λDNA 上的特殊位點，至少有 79.1%的位點辨識度，而剩餘單獨存在的量子點，或許只是並無與λ DNA 進行結合。此結論是由於在實驗中觀察到單純單一的量子點，
在空間中的布朗運動是十分快速的，而若是與 DNA 有進行結合的量 子點，則會呈現較為緩慢的布朗運動。
另外藉由 EMCCD 影像顯示，當 QD-EcoRI 與λDNA 做結合後與 單純量子點時空間中的移動擴散速度相較之下，有與λDNA 做結合 之 QD-EcoRI 移動速度是較單純量子點緩慢。因此將來可藉由觀察量 子點的移動過散速度來進行 QD-EcoRI 活性估算。
5-5 λDNA 於不同外力作用下 QD-EcoRI 結合位點與移動軌跡的動態 時序觀測
本節利用對λDNA 施予不同的外力 (1 pN 以及 14 pN)觀察力量 對於 QD-EcoRI 結合位點後的位移變化量，透過 EMCCD 擷取時序影 像圖，來計算出 QD-EcoRI 在結合位點上的移動軌跡圖。
5-5-1 對λDNA 施加 1 pN 拉力時 QD-EcoRI 結合位點與移動軌跡的 動態時序觀測
實驗中利用高解析度雷射光鉗搭配螢光顯微系統，捕獲住λDNA 兩端的乳膠珠後施予低拉力，再將乳膠珠黏置於玻片底部，進行 QD-EcoRI 螢光訊號觀測，實驗結果如圖 5-8。
圖 5-8 (A)λDNA 拉伸長度與受力變化圖；(B) 乳膠珠黏至玻片底部 後，關閉雷射光顯示出的圖形，其亮點為 EcoRI 辨識到λDNA 上特 殊位點進行結合；(C) EcoRI 辨識到λDNA 上特殊位點的連續影像；
(D) λDNA 上 EcoRI 的辨識位點。
圖中觀察到在靠近左端乳膠珠有一螢光亮點，將此螢光亮點與λ DNA 辨識位點示意圖做比較後發現此螢光亮點與辨識位點 44972 bp 位置相符合，因此可認為此螢光亮點坐落於辨識位點 44972 bp 處。
圖結果顯示，此螢光亮點只進行小幅度的布朗運動，隨著λDNA 的 擺動而做小幅度的晃動，因此藉此關係確認螢光亮點結合於λDNA 上的螢光亮點。
5-5-2 對λDNA 施加 14 pN 拉力時 QD-EcoRI 結合位點與移動軌跡 的動態時序觀測
本節探討對λDNA 施予些微力量的拉力(14 pN)時，QD-EcoRI 結 合後的表現是否會與 1 pN 有所不同。實驗中將λDNA 結合乳膠珠之 溶 液 利 用 微 量 注 射 幫 浦 送 入 微 通 道 中 ， 找 尋 結 合 乳 膠 珠 後 的 λ DNA，透過雷射光鉗系統將乳膠珠固定於蓋玻片底部，此舉是由於 在實驗中需要調整物鏡上下觀測待測物質距離觀測點的距離，若利用 雷射光鉗箝制住乳膠珠，調整物鏡便會使原本箝制住之乳膠珠脫離光 鉗，徒增實驗之困難性。乳膠珠在固定於玻片底部後將 QD-EcoRI 溶 液送入微通道中與λDNA 做接觸，使其結合λDNA 上特殊位點。透 過 QD-EcoRI 觀察結合λDNA 後螢光亮點的移動軌跡，實驗結果如 圖 5-9。
從圖 5-9 中觀察當λDNA 受到 14 pN 的拉力時與受力 1 pN 的時
序影像圖比較後得知，當λDNA 受到 1 pN 的拉力時，QD-EcoRI 在 結合位點後，其位移軌跡有較為明顯的變化；而受到 14 pN 的拉力 時，QD-EcoRI 在與位點結合後的位移軌跡並無十分明顯的移動。而 透過影像分析程式進行分析後可得更詳細之 QD-EcoRI 向量位移軌跡 圖，如圖 5-10。圖中顯示 QD-EcoRI 剛接合λDNA 經過 180 秒後，
QD-EcoRI 雖已與位點結合，但仍沿著 X 軸方向左右擺盪，此時左右 擺盪之情形可參考圖(A)的一維移動示意圖，在 QD-EcoRI 結合到位 點上後，會先進行小幅度的 X 軸方向的移動。圖 5-10 的(A)圖可顯示 出其速度向量皆指向中心的結合位點；結合時間經過 420 秒鐘後，可 從圖 5-10 (B)的向量位移軌跡圖發現到 QD-EcoRI 的 X 軸方向的移動 量比起 180 秒時的還要少，此一現象可解釋為 EcoRI 結合λDNA 在 經過一段時間後結合反應完成，因此 X 軸方向的位移變化量就會減 少。而在圖 5-10 中可看到 Y 方向的位移不論時間長短幾乎是相同的，
這是由於 QD-EcoRI 結合上λDNA 後，便隨著 DNA 的擺盪進行位移 運動。因此 Y 方向之位移是源自於λDNA 的上下擺盪。圖 5-11 中更 能顯示出 QD-EcoRI 位置的時空變化關係，經過一段時間後，X 方向 的位移量會減少，使 QD-EcoRI 結合λDNA 的作用更穩固。而圖中 更能進一步的証實 QD-EcoRI 在結合上λDNA 後，Y 方向的位移表 現是隨著 DNA 的運動而移動著。
圖 5-9 (A) λDNA 拉伸長度與受力變化圖；(B) λDNA 上 EcoRI 的 辨識位點；(C) 利用雷射光鉗將乳膠珠箝制後粘著於玻片底部之影 像；(D) QD-EcoRI 結合λDNA 特殊位點；(E) QD-EcoRI 與λDNA 結合後之時序影像圖。
圖 5-10 QD-EcoRI 結合λDNA 後的向量位移軌跡圖。(A) QD-EcoRI QD-EcoRI 結合λDNA 經過 180 秒；(B)QD-EcoRI 結合λDNA 經過 420 秒。
QD-EcoRI 結合酶切λDNA 的反應需要 Mg2+，而在本實驗由於要 觀察 QD-EcoRI 的結合情形，因此將 Mg2+置換為 Ca2+避免發生酶切 反應。在 QD-EcoRI 和λDNA 結合的反應中意外發現，當溶液中含 有約 1 mM 的 EDTA 時，溶液中的二價離子會被 EDTA 所隔離，造成 QD-EcoRI 無法接合上λDNA。因此推測此結合反應為可逆。本實驗 利用已結合上λDNA 之 QD-EcoRI 來進行解離反應實驗。先準備濃 度為 5 mM 之 EDTA 溶液，利用微量注射幫浦送入微通道中觀察 QD-EcoRI 從λDNA 識別位點的解離過程。實驗結果如圖 5-12。
圖中可以清楚的看到當 5 mM 的 EDTA 溶液尚未到達微通道中 QD-EcoRI 位置時，QD-EcoRI 穩定的接合在λDNA 上(t = 0)。當 EDTA 溶液從微通道中經過時，QD-EcoRI 便快速的從λDNA 上掉落，這是 因為 EDTA 將環境中的二價離子移除，使原本穩定接合的 QD-EcoRI 因為二價離子被移除而造成脫離的現象(t = 2.0s 以及 t = 2.2s)。藉由上 述觀測，在 Ca2+離子條件下 QD-EcoRI 與λDNA 的結合與解離反應 為一可逆反應。
圖 5-12 EDTA 溶液 (5 mM)使 QD-EcoRI 從λDNA 解離脫落。