序論

1-1 前言

利 用 單 分 子 操 控 術 控 制 第 二 類 型 限 制 性 內 切 核 酸 酶 (Type II restriction enzyme)來酶切 DNA 是近年來所興起的一種生物單分子研 究途徑。在過去研究結果中，傳統分子生物檢測酶切反應需大量的樣 品才能透過膠體電泳獲得分析結果。而近年來興起的雷射光鉗系統結 合顯微鏡系統用來操控單一雙股 DNA 分子，可作為生物單分子酶切 DNA 的操控及觀測平臺。更進一步可結合螢光顯微技術，觀察單一 分子在空間中的移動情形。此技術改善普通光學方法無法直接觀測到 奈米等級的分子的問題，而從中發展出一種以螢光分子標記於生物單 分子上，用來觀察分子在空間中的移動情形。

而在過去的實驗中顯示運用限制性內切核酸酶 EcoRI 在酶切 DNA 的同時，發現 EcoRI 會對 DNA 上的識別位點造成 50˚彎曲角度 (bending angle)的構型改變[1]，讓許多學者開始利用第二類型限制性 內切核酸酶來觀察酶切 DNA 的影響。而 2005 年 Wuite 研究團隊利用 單分子操控術對單一 DNA 分子施予不同拉力，計算出第二類型限制 性內切核酸酶 EcoRV 對 DNA 分子的酶切反應速率 kc(F)，其中 kc(F) = (1/kdif+1/kind(F)+1/khydr)^-1，kdif：限制內切酶擴散速率(s^-1)；kind(F)：限制 內切酶誘導構型變化速率(s^-1)；khydr：限制內切酶水解速率(s^-1)[2]。但

由於上述實驗只能依靠力量與時間的關係圖來觀察得知限制性內切 核酸酶何時酶切 DNA，因此本實驗將進一步的利用單分子操控術搭 配螢光顯微系統來分析當DNA 在不同外力作用下第二類型限制內 切核酸酶 EcoRI 結合位點的位移軌跡之時序影像，藉由此實驗期望未 來可更進一步觀察 QD-EcoRI 結合DNA 的動態結合過程，獲得精準 的酶切反應速率定量量測。

1-2 研究動機

在傳統的分子生物實驗中用來觀察酶切後的 DNA 片段，通常使 用 DNA 膠體電泳分析，DNA 在經過電泳後，將凝膠利用染劑作色 後，在紫外線下會顯現發光的片段，利用染色而顯現出來的片段得知 DNA 片段的分子大小，這樣的方法是簡便。

古語說：眼見為憑！但是透過電泳分析方法是無法直接觀測 DNA 與 限制性內切核酸酶之間的反應過程，因此無法提供限制性內切核酸酶 何時結合 DNA 以及酶切時的力化學反應情形。本實驗將第二類型限 制性內切核酸酶 EcoRI 結合量子點，以單分子操控術利用倒立式顯微 鏡以單分子的角度，進行 QD-EcoRI 結合DNA 解離過程動態行為研 究之觀察，利用DNA 以及 QD-EcoRI 來探討當DNA 在不同外力作 用下 QD-EcoRI 結合後的位移軌跡之時序影像，未來就可就此實驗之

獲得精準的酶切反應速率定量量測。

1-3 文獻回顧

針對以往膠體電泳分析方法只能觀察巨觀實驗結果的缺憾，1994 年時Bensimon研究團隊將DNA的一端固定於玻片表面上，利用水滴 的表面張力使得DNA緩慢的張開而能將蛋白內嵌至DNA上，如圖 1-1[3]。這種實驗方式的優點是因便於操作且DNA在玻片表面上可以 互相平行，並不需使用高濃度DNA；但此種方式容易出現DNA不受 控制的情形，因為是利用液體的表面張力來張開捲曲的DNA結構，

無法使用力量進行控制，而置換液體的速度頗為緩慢。

圖 1-1 DNA 一端固定於玻片表面，用液體表面張力使 DNA 伸展開。

為了可對DNA上施予一定的作用力量，Bustamante的研究團隊於 1996年將雷射光鉗(optical trapping)運用在顯微系統下，在DNA兩側端 點結合乳膠珠，使乳膠珠被高度聚焦的雷射力場中鉗住，藉此可以觀 察在不同力量的作用下，單一DNA分子(single molecular)的反應，如

圖1-2[4]。圖中：雷射是使用兩把100 mW的800 nm雷射光從玻片的上 下兩方聚焦於同一點，使其雷射力場可捕獲乳膠珠，用來固定DNA 的一端，另一端的乳膠珠則使用吸量管(pipette)來固定，再使用微量 幫浦將液體送入通道中，使液體可充滿通道。而藉由移動平台的方 式，使玻片達到位移變化，達到拉伸DNA的目的。而此方法改善1994 年無法對DNA施以拉力，再者由於光鉗力量穩定便可以快速的更換 微通道中的液體，再藉由顯微鏡來觀察DNA上細微的反應變化。

圖 1-2 將 DNA 兩端接合乳膠珠後，一端利用 pipette 抓住乳膠珠，另 一端利用雷射光鉗系統鉗住，藉此可施予 DNA 力量來進行實驗。

此 實 驗 證 實 對 DNA 施 予 60pN 力 量 使 其 產 生 過 度 拉 伸 (overstretches)的情形後，在緩慢的釋放所施予的力量，此可讓 DNA 修復其鍵結，使其恢復至原本的結構上(relaxing)，如圖 1-3[5]。利用 兩種不同的蠕蟲鍊模型(worm-like chain model)來摸擬當對 DNA 施予 0~60pN 的力量時模型參數的結果變化。可以從圖 1-3 中觀察到當施

的狀態；對 DNA 施予 15~60pN 的情形下，此時所施加的作用力，可 將 B-form DNA 拉直；而受力超過 60pN 的 DNA 則呈現一種過度拉 伸的關係。另外受力後結構的變化圖就如圖 1-4[5]。

圖 1-3 DNA 力量與拉伸長度的圖形。圖中：大虛線部分及小虛線部 分為作者使用蠕蟲鍊模型所作之推導線，其中大虛線所使用的模型是 針對於低力量的時候，推演的較為符合，小虛線部分所使用的模型是 針對高力量時候所推演的結果較為符合。拉伸箭頭(stretching→)所指 之方向為 DNA 受力拉伸時長度變化方向，而在收回對 DNA 所施予 之外力後，DNA 則會進行結構的恢復(relaxing)直到恢復至起始的 B 形式 DNA (B-form DNA)。

圖 1-4 DNA 受力的結構變化圖。(A) DNA 未受力之結構型態；(B)受 力後產生變化 DNA 結構型態；(C) 受力後，DNA 鹼基外翻的情形。

而2005年Wuite的研究團隊更利用雙雷射光鉗系統鉗住DNA兩端 的乳膠珠，研究施以不同力量對單一DNA分子被第二類型限制性內 切核酸酶EcoRV酶切的力化學影響，如圖1-5[2]。在這個實驗中，Wuite 的研究團隊利用了光鉗可施予DNA力量的特性，觀察了DNA從被光 鉗捕獲後，到注入含有限制性內切核酸酶EcoRV的液體，到酶切DNA 階段的力量變化，並製作時間與力量的關係圖，如圖1-6。

圖 1-5 雷射光鉗實驗示意圖。圖中紅色表示雷射光鉗；藍色為乳膠珠；

綠色為限制性內切核酸酶；橘色為 DNA。

圖 1-6 EcoRV 酶切時間路徑圖。1：光鉗捕獲住 DNA 後，對 DNA 施 予 50 pN 的作用力將之拉伸開；2：利用微量注射幫浦將限制性內切 酶 EcoRV 輸送至微通道內；3：停止輸送 EcoRV；4：EcoRV 酶切造 成 DNA 雙股斷裂，使 DNA 受力為 0 pN。

T4-T3 ≡ _{k (}¹_F)

c

Wuite 的研究團隊也利用圖 1-6 所記錄的作用力隨時間的變化關

圖 1-7 DNA 拉伸的力化學模式。圖中：△E1：DNA 剛受力拉伸時的 能量變化(長虛線)；△E2：DNA 受到 EcoRV 接合時，結構產生扭曲 時的能量變化(短虛限)；△E3：DNA 被 EcoRV 完全結合後所產生的 能量變化(中心線)。

Wuite 的研究團隊對 EcoRV 濃度進行改變，使 DNA 處於高濃度 的環境中，並且將拉伸 DNA 的力量降到一定的程度，使力量不會對 於 DNA 本身構型造成太大的影響，因此 DNA 在低作用力的實驗條 件下(F＜10 pN)，作者運用公式 1-1 將誘導構型變化速率的參數忽略 不計，因此在具有酶切結合常數(k )，高單位的 EcoRV 濃度影響下，

△△ G(k

T)

第二類型限制式內切核酸酶 EcoRV 的酶切反應速率看的即為酶切的

2008 年，Bonnet 的研究團隊則是運用了內全反射螢光顯微系統 (total internal reflection fluorescence microscopy，又稱 TIRF)，將 DNA 貼附於玻片底層，再使用微量注射幫浦將第二類型限制性內切核酸酶 EcoRV 送入 DNA 所在的位置，觀察 EcoRV 尋找 DNA 辨識位點的路 徑[9]。實驗中最特別的地方為 Bonnet 的研究團隊所使用的 DNA 並 無 EcoRV 所能辨識到的特殊位點，此一動機是為了要觀察 EcoRV 在 一維滑動(silding)與三維的跳躍(jumping)動作時於 DNA 結構中移動 擴散尋找結合位點的情形，其一維滑動與三維跳躍的運動模式如圖 1-8[10]。與 2005 年 Wuite 的研究團隊的方法相較之下，雖然 Bonnet 的研究團隊利用不具 EcoRV 辨識位點的 DNA 分子，但使用 EcoRV 與有機染劑做結合，透過 TIRF 系統觀察單一 EcoRV 在 DNA 上的運 動途徑；但此一方法也有缺點，雖然可以肉眼來觀看限制性內切核酸 酶的反應途徑，但卻無法施予力量來檢測 EcoRV 與 DNA 的力化學反 應機制。

圖 1-8 限制性內切核酸酶於 DNA 上的移動情形。上圖：為限制性內 切核酸酶於 DNA 上做一維滑動(silding)的情形；下圖：為限制性內切 酶於 DNA 上進行三維跳躍(jumping)的動作圖形。

2001 年時 Williams 的研究團隊也將雷射光鉗系統應用於研究溫 度效應對 DNA 力學形成的影響[11]。該研究所使用的系統是與 1996 年 Bustamante 的研究團隊的系統相近，利用兩道雷射聚焦於一點的 能量捕獲乳膠珠，運用加熱系統，將玻片通道中的溫度從 11℃增加 至 52℃，藉以觀察 DNA 在不同溫度下的變化，如圖 1-9 所示。由於 DNA 在過度拉伸區域會出現作用力誘導 DNA 雙股分離的結果改 變，因此增加 DNA 所處的環境溫度將更易於雙股分離，使 DNA 本 身能承受之拉利降低。而環境溫度變化在 40℃以下且作用力小於 50

pN 時，DNA 拉伸曲線與室溫下的拉伸曲線並無太大的變化。但在此 實驗中，圖 1-9 所顯示的拉伸力是從 40pN 開始，因此無法得知其在 40pN 以下時拉伸長度的變化量，因此本實驗將利用雷射光鉗系統，

完整的呈現出在不同的溫度下，力量的變化對於拉伸長度的變化量。

圖 1-9 DNA 在 500mM 的 NaCl 下，溫度與力量的變化圖。其中：11°C (□)，21°C (■)，28°C (◇)，31°C (◆)，35°C (△)，40°C (▲)，45°C (○)，

與 52°C(●)。

也因此本實驗將運用第二類型限制性內切核酸酶 EcoRI 接合量子 點，以單分子操控術利用倒立式顯微鏡以單分子的角度觀察，當

DNA 在不同外力作用下第二類型限制內切核酸酶 EcoRI 結合位點的

位 移 軌 跡 之 時 序 影 像 ， 藉 由 此 實 驗 期 望 未 來 可 更 進 一 步 觀 察 QD-EcoRI 結合DNA 的動態結合過程，獲得精準的酶切反應速率定 量量測。

1-4 章節回顧

第一章先簡介利用雷射光鉗系統來測詴第二類型限制性內切核酸 酶的問題，並說明本實驗想要研究 DNA 與限制性內切核酸酶之間作

第一章先簡介利用雷射光鉗系統來測詴第二類型限制性內切核酸 酶的問題，並說明本實驗想要研究 DNA 與限制性內切核酸酶之間作