實驗原理

3-1 循環伏安法 (Cyclic Voltammetry, CV)

    對於不同之分析物，其分子軌域與能階變化均不盡相同，亦即其氧化還原電位也不盡 相同。循環伏安法主要藉由其對可氧化還原物(redox probe)施加一偏壓(bias)後，藉 由工作電極提供一三角波形的電位掃描，當電位掃描到一特定的伏特數時，溶液中開始 發生氧化或還原反應的現象產生，偵測其電流的變化並作圖，藉由改變電位與電流變化 的關係圖，可以得到相關電化學資訊。電流的產生，主要是由於電子轉移所造成的，因 此對於不同的分析物而言，發生反應的電位也有所不同。另外，使用相同氧化還原物而 工作電極表面狀況不同時(例：電極表面修飾官能基)，其發生反應的電位與電流也會有 所不同，並且對應電極表面的穩定度而有可逆與不可逆的反應差異。而循環伏安法之原 理，則是藉由工作電極提供一三角波型式的電位掃描，當電位掃描到一特定的伏特數 時，溶液中開始發生氧化或還原反應的現象。

  圖 三.1 循環伏安法中電位與時間變化之示意圖[102]

 

得到的電流電壓對應曲線，包含兩個分支，如果上半部分電位改變向陰極方向遞增，

氧化還原物質在電極上還原，產生還原波，下半部分電位元向陽極方向遞增時，還原產 物又會重新在電極上氧化，產生氧化波。因此一次三角波型的電位掃描，完成一個還原 和氧化過程的循環，故該法稱為循環伏安法，其電流電壓曲線稱為循環伏安圖。

  Randles–Sevčik equation 解釋[102,103]:

2

  圖 三.3 循環伏安法中峰電流與峰電位之表示圖(美式)

循環伏安圖中，通常以峰電流(ip)、峰電位(Ep)之變化來表是每個階段電極的化學修飾情形，其中 ipc、

Epc 用以表示陰極(cathode)的峰電流、電位值；同樣的，ipa、Epa 用以表示陽極(anode)的峰電流、電 位值。其電流變化值計算與氧化反應方向有關。

另外，依據對循環伏安圖座標軸定義的不同，常見有以下兩種不同的作圖格式，其一 為＂American style＂其將工作電極(陽極, anodic)產生的電子流以其電性定義為負電 流，且電壓向＂左＂加大使得循環伏安圖下半部的氧化反應發生，此類型表現優點為符 合電子流的通用定義為：負(-)。相反的，依據＂國際純粹與應用化學聯合學會(IUPAC)＂

的定義，其將陽極反應所產生的電流定義為正(+)，上半部循環伏安圖像＂右＂增大電 壓使得氧化反應發生，以符合一般對於作標Ｘ軸右邊為大，左邊為小的觀念。

  圖 三.4 美式(左) 與 IUPAC 式(右) 循環伏安圖表示法[103]

 

3-2 Randles＇等效模擬電路 (Randles＇ Equivalent Circuit)

    電化學反應之物理量(訊號)通常可用數個電阻與電容表示之，Randles＇等效模擬電 路為最常用來解釋簡單電化學反應系統的模擬方式[104]，其中，R^ct為電極表面氧化還 原反應產生之電荷傳遞阻抗(charge transfer resistance)，其數值與電荷傳遞速率成

正比；C^dl為電雙層的電容值(double-layer capacitance)，表示電極表面上儲存之電荷 量；Rs 為溶液項的阻抗值；Zw 則為 Warburg impedance，其代表電極表面與溶液之間產 生的擴散效應所產生的阻抗值[53]。其電路配置如下圖。

R

_s

R

_ct ^Zw

C

_dl

  圖 三.5 一簡單電化學系統之 Randles＇等效模擬電路圖

以標準 Randles＇等效電路圖來模擬電化學反應槽之各種物理量，其中 Rct 為工作電極之電荷傳遞阻抗；

Cdl 為電雙層的電容值，上述兩者經常被用來作為感測器之觀察物理量；Rs 為溶液相的阻抗值，電解質 環境中通常極小；Zw 則為 Warburg impedance，表示電極表面上的擴散效應，通常在 EIS 頻譜的低頻區 可以觀察到。

3-3 電化學阻抗頻譜 (Electrochemical Impedance Spectroscopy, EIS)

    電化學阻抗頻譜 (Electrochemical Impedance Spectroscopy, EIS)，長期被用來研 究 各 類 型 的 電 化 學 系 統 ， 例 如 ： 腐 蝕 效 應 (corrosion) 、 電 解 沉 積 效 應 (electro-deposition)、電池(batteries)與燃料電池(fuel cell)等。在 1980 年代後 期，EIS 方法漸漸被應用於生物偵測之上，其主要原因為利用電阻抗的差異不但可取代 傳統的螢光標定（fluorescence dyes）與放射物標定(radioactive labels)的方式亦 可 取 代 氧 化 還 原 物 質 的 固 定 ( 為 電 流 式 偵 測 器 之 必 要 步 驟 ) ， 成 為 一 不 需 標 定 (label-free)物的偵測方式。其中原理為利用一微小的(2~10 mV)正弦波交流電訊號 (sinusoidal AC voltage)擾動作為偵測電壓，量測系統反應之電流訊號。

  圖 三.6 以 EIS 原理設計之生物感測器示意圖

從以上標準示意圖中得知，當電極表面產生抗體抗原結合反應時，電極的電阻、電容產生變化；此時，

輸入的擾動電壓會得到與沒有產生抗原抗體結合反應時之不同(電流大小、相位差)反應電流。

 

已知電阻遵守歐姆定律(ohm＇s law, E=IR)，但在交流電系統中(frequency≠0)，則 下列關係式成立(E=IZ)，其中 Z 表示為阻抗，阻抗與電阻都代表著抗拒電流的能力，在

shift)，其 Z 值於向量坐標平面上表示時，可將 in-phase(x 軸)電阻反應(R, resistive) 視為實部(real component)電阻(Z^re, Z^R)，而 out-of-phase(y 軸)的電容反應(C or C^d,capacitance)可視為虛部(imaginary component)電阻(Z^im, Z^I)。

  圖 三.8 EIS 阻抗與相位差之向量圖表示[1]

ZR 表示實部電阻，ZI 則表示虛部電阻

 

  表格 三.1 阻抗元素之定義與其物理意義[1]

ω為角速度(rad/s)；j 為虛數相的向量值；CPE 可視為不理想之電容值(imperfect capacitor)；A 為阻 抗(Z)之倒數；a 表示複數平面之角度，定義為–(90*a)=φ；σ為 Warburg coefficient：其中，D 為擴 散常數(diffusion coefficient)；C 表示為濃度(bulk concentration)；下標 R 與 O 分別表示還原態與 氧化態；R 為氣體常數；T 為絕對溫度；F 為法拉第常數；n 為其當量。

 

    綜合以上物理量之定義與推導，可得實部電阻與虛部電阻如下列方程式所示[103]：

另外，將實部電阻與虛部電阻以複數平面表示時，可得 EIS 常使用之表示法:極座標 圖示法(Nyquist plot, polar plot)[1,102,103]，可得各 Randles＇ plot 所標示之物 理量:

  圖 三.9 標準 Nyquist plot 表示法與其代表之物理量

由 Nyquist plot 之 x 軸截距即可得知溶液之阻抗(Rs, RΩ)，在半圓形之頂點對照頻率值可求得電容值 (C, Cd, Cdl)，再者，由半圓圖形之直徑可求得 R 值(Rs+Rct)，最後於低頻區可求得 Warburg Coefficient。

3-4 微溫差掃描熱卡路里計 (Differential Scanning Calorimetry, DSC)

    蛋白質摺疊通常是由高構型能階態往低構型能階態進行，大部分自然態的蛋白質，皆 處於構型能量最低態。所以接近自然結構的蛋白質，對熱的穩定性就越高。加熱使蛋白 質變性，可觀察其三級結構的穩定性。加熱會使蛋白質產生變性，也就是形成相變，蛋 白質變性後，其比熱會發生變化。我們利用微溫差掃描熱卡路里計 (Differential Scanning Calorimeter) 觀察蛋白質的比熱變化，即可得到蛋白質對熱的穩定性。微溫 差 掃 描 熱 卡 路 里 計 可 分 為 熱 流 式 (Heat flux DSC) 與 熱 補 償 式 (Compensation Calorimeters) 兩種，熱流式是對樣品端 (sample) 及參考端 (reference) 提供相同

的功率的能量將兩端同時加熱，當樣品達到相變點時，會吸收或釋放出額外的熱量，使 得兩端溫度產生了溫度差，再使用熱電偶 (thermocouple) 將此溫度差轉換成熱量差，

由此計算出樣品的相變點以及比熱變化。而補償式的則是提供不同功率的熱量，去維持 樣品端以及參考端的溫度相同，根據所提供的熱量不同，也可以計算出樣品的相變點及 比熱變化[105]。本實驗所使用儀器為 CSC 公司所出產的 N-DSC-II (Lindon, UT, USA)，

可測量的溫度範圍從-10℃到 130℃，升溫度速率可從 0.125℃/min 到 2℃/min；cell 容 量為 0.33ml；靈敏感為 0.2μcal。

3-5 動態光散射儀 (Dynamic Light Scattering, DLS)

    雷射光射入含有懸浮粒子的溶液中時，雷射光因粒子而產生散射光，散射的雷射光會 隨時間改變，再由散射光的變化計算出平均粒徑大小。因為粒子所處的環境並非絕對零 度，本身含有動能而進行布朗運動 (Brownian Motion) ，粒子大小不同會造成不同的 擴散運動，因為粒子隨時在移動而相對位置不斷變化，各個粒子的散射光互相干涉也隨 時在變化，因此散射光強度也隨時間在變化，粒子越小，擴散運動速度越快，粒子越大，

擴散運動越慢，利用雷射光穿透溶液時，粒子會產生散射光，粒子因為大小及位置的不 同，產生的散射光到達檢測器時會有光程差。不同時間粒子位置會改變，散射光也跟著 改變，可利用 Stokes-Einstein equation 可計算出粒徑大小[106]。

3-6 自組裝單層膜 (Self-Assembly Monolayer, SAM)

    如何將生物分子固定至感測器表面之上，已達到偵測目標物之目的，為一生物感測器 之關鍵製備步驟。奈米技術的多樣性發展對於生物感測器有相當大的助益[9]，其中，

利用自組裝單層膜（self-assembly monolayer, SAM）技術用以固定欲修飾之生物分子，

為最為重要的製備方法[107,108]，此技術之特點為[109]：(1) 單分子層厚度約數十個 Å，(2) 單分子曾以化學共價鍵為其鍵結力，(3)單分子層排列緻密且具有方向性，(4) 可依不同基質或不同待測物更換單層膜之官能基作應用。其作用原理與方是多是藉由將 電極置於硫醇或矽烷類之中，藉硫醇與白金、金、銀、鎳等的化學吸附作用，或矽烷於 表面氫氧根(-OH)間的化學鍵結，而形成一單分子層。又此類型反應在熱力學上屬於自 發性反應，故形成之單分子層稱為＂自組裝＂單層膜。

  圖 三.10 硫醇烷鏈分子於金電極表面之反應機制示意圖[110]

如圖所示，分子因為受熱力學的驅動，在低濃度時，烷鏈分子平鋪於電極上，並且隨意移動，但當濃度 漸漸提高時，其分佈位置逐漸固定，待其濃度更高時，烷鏈分子欲尋求更高的穩定性便直立排列於電極 上；由此示意圖可知，當硫醇烷鏈分子濃度過量時，即可視為其可直立排列於電極上修飾。

SAM 技術始於 1946 年 Zisman 發現長鏈胺類可以吸附在白金上，1980 年代後始有大量 文獻指出長碳鏈硫醇分子與雙硫醇分子穩定的鍵結於金分子表面[111,112]。

  表格 三.2 SAM 常見之配位分子與其基材[113]

此處 R 表示長烷鏈(Alkane)；Ar 表示芳香類(Aromatic)；Silane 則是指矽烷類(SiH4)

 

SAM 技術可歸納為三個部分[114]，分別為與基質鍵結的接觸分子(Head group):此類 型分子以共價鍵結鍵結於基質表面上，以硫醇吸附於金電極表面上而言，S-Au 的鍵結強 度約為 40~45 kcal/mol。烷基碳鏈(alkyl chain):連接接觸分子與官能基分子的部分，

通常為烷基組成之長鏈，烷基碳鏈間產生的凡得瓦力約小於 10 kcal/mol，故接觸分子 可不受影響。官能基分子(functional group, terminal functionality):此端為官能 基最具變化性的部分，常見的鍵結官能基為-CH3、-COOH、-NH2、-OH 等，多用來與生物 分子或是奈米金屬粒子作鍵結。

~ 30∘

Headgroup Functional group

Alkyl chain

Surface

  圖 三.11 自組裝單層膜組成示意圖[114]

一般自組裝單層膜組成可分為三部分：接觸分子(Head group)，烷基碳鏈(Alkyl chain)與官能基分子 (Functional group)

 

SAM 技術應用中以 Au (111) 為最常見之工作電極，上述之 Alkylthiol 會形成 ( 3 x 3 )R30∘的結構[103,115]，見圖表四.5，實心圓表示硫原子，空心圓代表金原 子。

 

 

圖 三.12 乙硫醇(ethanethiolate) 鍵結於 Au(111) 之掃描穿隧式(STM)顯微圖[115]

圖中白色影像為硫醇分子；上圖右則為其截面圖。

 

  圖 三.13 硫醇分子單層膜與金表面排列之示意圖[115]

黑色圓圈為硫醇分子，空心圓圈為 Au(111)之表面 

在文檔中 生物高感度偵測技術快速鑑別人類血紅素結合蛋白之表現型 (頁 35-46)