緒論

第一章 緒論

1-1 研究動機與實驗目的

人體中，有許多與疾病直接或間接相關的特定蛋白質，該蛋白質的濃度異常改變或是 結構上的變化，時常被作為檢驗疾病的重要指標，目前在臨床檢驗上，以免疫分析法為 主要的疾病檢測方式，免疫分析法之高靈敏度與高專一性使該方法被廣泛的應用在特定 蛋白質的濃度分析上

(詳見章節 1-3)

。然而，此方法亦存在著許多缺點，例如，免疫分 析法所需之儀器與試劑售價昂貴，操作繁瑣費時，實驗人員之技術需求較高……等因 素。另一方面，1960 年代起，生物感測器(Biosensor)之觀念逐漸萌芽，其主要以檢測 準確快速、操作簡便為訴求

(詳見章節 1-4)

，經過電路設計的改進與生物分子固定技術 的成熟，近十年來，生物感測器的相關研究報告數量呈現指數型的上昇，舉例來說，以

＂impedance spectroscopy"以及＂Biosensor＂為關鍵字的文獻數目由 1996 年個位數 目的篇數上升至 2006 年時，每年可有上百篇的文獻發表，見下

圖一.1

，至今仍在增加 當中。但儘管生物電感測器已是如此蓬勃的研究領域，也已經被廣泛地應用在商業檢測 儀器上，例如血糖計等，相關的電化學研究依然要依賴傳統商品化的電化學分析儀，其 外型巨大且售價昂貴；此外，相關配件耗材也受限於原機器之設計，如此即減慢了學生 的實驗進度以及阻礙了生醫議題發展的時間迫切性。本實驗室了解客製化，個別實驗差 異的重要，所以致力於：發展快速、操作容易、成本低廉的可攜式生物檢測器，作為本 實驗室與本論文重要之出發點與欲達成之目的。

  圖 一.1 近年來阻抗頻譜與生物感測器相關文獻之數目[1]

空心柱狀圖為＂ISI web of Science＂搜尋而得，實心部分來自＂PubMed＂之結果。

除此之外，本實驗室研究人類血紅素結合蛋白(Haptoglobin, Hp)之相關文獻，發現 其為一相當特別的蛋白質；舉例來說，一般蛋白質相關的疾病表現多與該蛋白之異常濃 度或結構有關，但 Hp 不只如此，人類 Haptoglobin 有三種不同的表現型(Phenotype)，

而該表現型的差異只有發生在人類上，其不同表現型之間的胺基酸組成近似，但分子量 與立體構型卻呈現明顯的差異[2]。再者，不同表現型的血紅素結合蛋白對於疾病會有 不一樣的臨床反應，其中，2-2 型 Hp 更被用來作為預測冠狀動脈血管疾病(coronary vascular disease)及其併發症的指標[3]

(見章節 1-6)

，所以，如果可以發展可辨識不 同 Hp 表現型與正確檢測 Hp 濃度的新方法，並符合上述所說對於生物檢測器的要求，則 可以大大增近醫療品質與縮短臨床研究的時間，也正是本論文欲研究之主要目標。

1-2 生物巨分子的自組織與自組裝

    生物巨分子之自組織(self-organization)、自組裝 (self-assembly)特性，已成為 操作此類生物分子形成特殊結構之重要步驟[4,5]。這些分子所形成之構形與其自組裝 成長環境有著密切的關聯。生物巨分子為碳、氫、氧、氮、硫等組成之複雜有機化合物。

雖然其結構複雜，但是此類生物巨分子在非均相系統中生物巨分子會受系統作用 力,entropically force，驅動下形成特定的構形及所謂之自組織，此外 entropically force 亦 會 驅 動 生 物 巨 分 子 排 列 出 特 殊 分 子 級 圖 形 與 結 構 此 即 為 自 組 裝

近數十年來，酵素免疫分析法 (ELISA:＂Enzyme Linked Immunosorbent Assay＂) [10-12]，漸漸取代了放射線免疫分析法(radio-immunoassay, RIA)[13]作為分析生物 樣品之免疫反應的主要方法與實驗設計。其原因始於以 RIA 作樣品分析時，對於放射線 標定物的操作、保存以及廢棄處理等都必須有較繁瑣的實驗規範與安全防護；使其漸漸 被 ELISA 之安全、易操作等特性所取代。而 ELISA 被大量應用來作為分析血液中各類抗 原或抗體濃度的工具，例如，HIV test, West Nile Virus test 等[14]。另外各式食品 中的過敏原含量檢測，例如：牛奶，花生，杏仁，雞蛋等檢驗，也常使用 ELISA 的方式 作檢測[15]。目前已知所使用的 ELISA 方式進行樣品分析，其靈敏度約高達 15 pg/ml[16]。

隨者 ELISA 分析方法的普及，利用＂生物感測器＂概念作為分析方法的實驗設計也漸 漸顯現其多樣性與可行性[17]，不同類型的實驗以嘗試取代 ELISA 生物膜微量培養盤試

驗(Biofilm microtiter plate test)的操作與節省 ELISA 實驗時間而設計。其策略大 致為，一端將可與待測物反應之物質(偵測物質)，以各種不同的實驗設計固定於 (immobilized)某固態基質上，且通常該基質與待測物極為接近，以增進偵測靈敏度與 速度；另外，設計可更換的偵測物質，以達到同一感測器可用於多樣待測物的分析，其 分析之訊號可為電子、離子、氣體分子、熱能、光子及質量改變等轉換之訊號；最後，

縮小固定基質的體積並且與電路設計作整合，以達到可攜體積與可量產之成本。一般生 物感測器之設計概念簡述如下:

  圖 一.2 一般生物感測器之設計原理簡圖[18]

待測物，例如蛋白質、病毒、細菌等，經過過濾、離心等方式作初步的純化後，與生物感測器上的固定 分子（例如：抗體）發生反應，藉由電、熱或光等訊號傳遞至感測器的電路接收器（例如：工作電極）

上，再經由一定的轉換、放大與計算後，表達為感測器之電訊號。

1-3-1 各式生化反應之生物感測器設計

Christiane Ziegler

et al.

在 1998 年 Curr Opin Chemi Biol 中的 review 文章中[18]，

將不同偵測介面設計的生物感測器歸納為下列幾項：

A. 生物親和吸附感測器 (Bioaffinity sensors)

以生物親和吸附為設計基礎的感測器為目前設計變化性最大的一個類別，其中，

以 DNA 感測器最引人注目，其設計原理為利用帶有固定單股 DNA 的感測器，被待測 物中的另一股鹼基片段或酵素所辨認進行結合，利用電訊號或光訊號的改變進行偵 測，此類型的感測器發展對於鑑識科學與相關酵素研究有極大的潛在貢獻。目前該 類型研究正致力於提高靈敏度至欲克服辨認單一鹼基的不同，已知可利用電中性 (neutral aminoethyl-glycine based)的仿 DNA 骨架(peptide nucleic acid,PNAs) 作取代，以降低電性耦合所形成錯位接合(mismatch)的機率[19]。另外，利用抗原 抗體或是酵素辨認結合的生物感測器則是另一大宗，其複合體在生物感測器上結合

後，藉由質量、光學訊號或電阻訊號的改變

(詳見章節 1-3-2)

，來作生物偵測的應

C. 膜通透感測器 (Transmembrane sensors)

膜通透感測器最大的挑戰即是如何固定生物膜在感測器上並且維持它的活性，再 者，如何分離並放大的膜上的離子訊號也是另外一個待克服的問題，目前研究團隊 利用黑雙層脂膜(black lipid membranes, BLMs)與磷脂(phospholipids)作為基質 模擬膜通道的開關等[22]，並利用離子電訊號或表面電漿共振(surface plasmon resonance,SPR)的方法進行訊號量測，用以觀察各類型生物分子，如 antiboies、

  圖 一.3 不同生化反應之生物感測器設計示意圖[18]

(a).生物親和吸附感測器 Bioaffinity sensors。(b).酵素催化感測器 Enzyme biosensors。(c).膜通 透感測器 Transmembrane sensors。(i)表示一般鹽類或小分子藉由蛋白質通道進入細胞內，(ii)表示抗 原分子與通道蛋白質作用以填空膜通道的開合，(iii)表示抗原分子與通道蛋白質作用後以啟動細胞內的 酵素催化反應。(d).細胞作用感測器 Cell biosensors。(i)表示細胞對反應物(分析物)產生轉換(convert) 式的反應，(ii)細胞與反應物產生鍵結(bind)式的反應。

＂A＂表示欲分析物~Analyte。＂R＂表示固定的辨識分子~Recognition。＂T＂表示電訊號轉換器

~Transducer。＂S＂表示訊號~Signal。＂E＂表示酵素~Enzyme。＂P＂表示反應產物~Product。＂M＂表 示生物雙層膜~Membrane。＂C＂表示細胞~Cell。詳細圖示代表意義:見內文 1-3-1。

, ：分別表示抗原與抗體分子； , ：分別表示與酵素反應前後之反應物。

   

1-3-2 不同物理量偵測之生物感測器設計

相同的生化反應，在不同設計的生物感測器中，可能被轉換成不同的物理量被改測器 接收與記錄。以下以最常見的生物親合吸附感測器(Bioaffinity sensors)為例，就不 同的物理量偵測原理作分類，對各類型生物感測器作介紹[17,18]，以利於讀者對於本 實驗選擇之實驗設計有更多的認識：

A. 石英晶體微天平儀 (Quartz crystal microbalance, QCM)

QCM 設計原理是藉由將抗原與抗體固定於某壓電材料表面上(piezo-electric

material)。藉由基質本身(quartz)的振動頻率在生物反應後發生調變，以頻率差 乳膠顆粒(latex beads)[27]、奈米金球(gold nanoparticles)[28]等方法來加大 待測物的質量，用以改善感測器之靈敏度，則是目前 QCM 常用的樣品製備模式。

B. 電化學感測器 (Electrochemical sensors)

利用電化學的氧化還原現象來作為生物感測器的偵測方式，為目前最為廣泛使用

C. 光柵耦合式感測器 (Grating coupling sensors)

光柵耦合式感測器可分為反射式、進光式與出光式等數種，反射式原理為將光束 線聚焦至帶有欲反應抗體之光柵，反射光的波長與強度分佈，對照於未與抗原反應 之波長與強度分佈會發生改變，將此改變以光電偵測器紀錄之，用以計算介質折射 系數(refractive index)的變化，來推測抗原之濃度[34]。另外一類型設計為利用 對全反射表面的倏逝波(evanescence wave)吸收，在距離焦平面(反射面)約 200 nm 的高度內，其能量足以將抗原表面修飾之螢光分子作激發，用此原理來觀測免疫反 應 的 發 生 ， 其 設 計 類 似 於 內 全 反 式 螢 光 顯 微 鏡 (Total Internal Reflection Fluorescence spectroscopy, TIRF)[35]。

D. 表面電漿共振感測器 (Surface Plasmon Resonance sensors)

在奈米尺寸的金屬表面產生電磁波的傳遞時，特定波長且滿足特定入射角度的電 磁波，該能量正好可以被奈米金屬粒子吸收進而產生電子共振(resonance)效應，

稱作表面電漿共振效應(SPR)；影響 SPR 中＂可反應激發光＂的入射角度的因素有 波長、光偏振(polarization)等，也與金屬粒子的表面環境有關，藉由不同的金屬 表面的抗原抗體修飾步驟，與光束線角度的變化，可以用來觀測免疫反應的程度

[36-38]。詳細原理如下圖所示：

  圖 一.4 SPR 類型感測器之偵測原理[17]

當有待測物(抗原)與抗體(Y 型表示)反應時，SPR 感測器上的奈米金屬粒子表面環境產生改變，使得可激 發表面電漿共振的入射光吸收產生角度(或波長)偏移，如右半圖所示。(θ)表示尚未與抗原結合時之 SPR 吸收反射角度，(θ＇)表示接上抗原後，改變後的 SPR 吸收反射角度。n 表示不同物值之折射系數 (Refrection Index)。R 表示在接收器(receptor)觀察到的訊號強弱大小。

   

E. 反射式干涉儀 (Reflectometric Interference Spectroscopy, RIfS)

利用光在不同介面與介面之間的反射，互相產生干涉效應形成亮暗紋，當有免疫 反應發生時，及最上層薄膜發生厚度(optical thickness, ＂n＂× ＂d＂)的改變，

因此，干涉條紋的亮暗紋位置也會偏離(shift)，藉此原理，即可以觀測基質上是 否有免疫作用的發生及其程度[39,40]。

因此，干涉條紋的亮暗紋位置也會偏離(shift)，藉此原理，即可以觀測基質上是 否有免疫作用的發生及其程度[39,40]。

在文檔中 生物高感度偵測技術快速鑑別人類血紅素結合蛋白之表現型 (頁 15-33)