5-1 實驗室自製電極
本論文主要論述之一遍為以較低價，較方便的方式製備生物電感測器，其中，取代傳 統昂貴的金柱狀電極便是本論文欲達成的目標之一，在本系所助理研究員曾信華博士的 設計指導下，我們利用金線來取到一般使用的柱狀電極，以節省成本，可大量製造，以 利實驗進行，如上一章節實驗步驟中所敘述的，將金線聯接導線後，灌入壓克力膠，真 空下緩慢加熱使之固化，退出模具後，將表面拋光，即初步完成自製金電極的製備，如 下圖所示。其電極柱高度約為 2.5~3.0 公分高，表面約為直徑 4.5 公釐，中央金線截面 約為直徑 0.5 公釐。
圖 五.1 實驗室自製電極實物
上圖左為側拍工作電極之實物，如圖所示，金線與銅線藉由銅環片相連接，外面再以壓克力膠作包覆，
其圓柱高度約 3 公分，直徑約 1 公分，金屬截面積則約 4.5 公釐。右圖為其工作電極截面實物圖。
5-2 電極之化學研磨與清洗
在電極以 Al2O3粒子完成機械研磨後，將工作電極置於硫酸溶液中，以循環伏安法進 行化學研磨與清洗，實驗結果可發現反應初期：以循環伏安法清洗一個回合（藍色），
可見上半部伏安圖在進行氧化反應時，並無明顯的氧化電位峰值產生，推測可與硫酸發 生氧化反應之金電極晶相排列組態眾多(Poly crystalline gold)。在數次稀硫酸清洗 研磨後（紅色），可發現兩個明顯的氧化峰電位值分別為 1.02 與 1.18(V)，推測分別為 Au(100)與 Au(111)之氧化反應電位，而下半部則有明顯的還原電位分別為 0.86 V：
Au(111)與 0.73 V：Au(100)，由此四個電位峰值可推斷：第一，金電極表面並無明顯的 雜質覆蓋，所以氧化還原反應值明顯，為一潔淨之工作電極。第二，氧化電位由數個縮
Potential (V vs Ag/AgCl)
Round 12 組態眾多(Poly crystalline gold)；而＂紅色＂則為化學研磨完成之金電極表面，其 Au(100)與 Au(111) 之氧化還原電位分別為 Au(111): 1.18, 0.86 V 與 Au(100):1.02, 0.73 V (詳見章節 4.2.2)，可視為化 學研磨完成之指標。
為了進一步觀測並驗證化學研磨之效果，我們使用掃描式電子顯微鏡(Hitachi S-4000 FESEM)觀測電極表面在化學研磨前後的改變，如圖 5.3 所示，在同樣放大１萬倍的倍率 下，可見未進行化學研磨之電極其表面大多平坦，但仍有少數明顯機械研磨留下之刮 痕；而在化學研磨後(以 0.5 M 硫酸清洗 15 個回合)，可觀察到長條形之機械研磨刮痕 變少，但新生成許多圓形的侵蝕孔洞於電極表面，推測為硫酸對非 Au(111)與 Au(100) 晶相進行研磨而成。
收值，確認其在 525 nm 附近有明顯的吸收峰，推測原因為表面電漿(surface Plasmon) 所產生的吸收效應[125]，其可視為金奈米粒子的特偵訊號。AuMCPs 則為尺寸太小所以 其吸收峰不明顯。
300 400 500 600 700 800
0.00
0.1x AuNPs (Sodium Citrate) 525 nm
則約為 7 nm。
Relative Number AuNPs (by Sodium Citrate)
Mean Diameter: 30.2 nm
Diameter (nm) Mean Diameter: 7.1 nm
當作為氧化還原溶液(redox probe)。設定掃瞄電壓範圍為-0.2 ~ +0.6 V，掃描速率為 100 mV/sec。待訊號穩定後記錄之。由 CV 圖可以觀察到，在每一個修飾步驟後，氧化 還原電位與反應電流值皆會發生變化，見
圖 五.7
與表格 五.1
，電位差值自 0.079 V 增大至 0.174 V，電流變化也自單純的金電極約 17 nA 左右減少至接上抗體時的 7 nA。即代表氧化還原的難易程度與反應的分子數量發生改變。由此現象可推估，本實驗化學
官能基修飾步驟與抗體分子固定的程序確實完成。另外在接上金奈米粒子時，可見其電
Potential (V vs Ag/AgCl)
Bare - Au
之 Hp-BEA，其訊號反應值皆為尚未接上抗原分子之訊號（Rct=6150 ohm）的一點五倍以 上，差異極大，可有效判斷抗原抗體分子是否接合，並且比較電荷傳遞阻抗即可分辨三
型之 Hp。(圖中數據點均為實際實驗數據；實線則為使用 Randles＇等校電路經由 Zsimpwin 軟體所模擬 之數據)
表格 五.2 以阻抗分析軟體模擬 Hp-BEA 對三種不同表現型 Hp 之偵測結果
5-6 檢視 Hp-BEA 基本性質 5-6-1 重複使用性質
將電化學分析儀應用在實際的生物感測上，以未來的商業應用來說，壓低成本與可重 複使用性質必定是最重要的發展方向，也左右了此類型商品的普及程度，本部分實驗欲 探討此類型的實驗設計是否可以重複使用以及是否依然可辨識三種表現型作實驗。
將修飾過後的金電極浸泡至血清樣品約 120 μl，置於 4∘C 中等待約 90 分鐘後，以 大量 1x PBS buffer(pH=7.2)潤洗，以去除物理吸附之 Hp，之後放入至三電極氧化還原 反應槽中，以作 EIS 分析。反應槽中加入 2.5 mM K3Fe(CN)6 與 K4Fe(CN)6 當作為氧化還 原溶液(redox probe)。設定固定直流偏壓為 0.23 V，以利 Fe(CN)6
3-/4-離子至氧化電極 反應。掃描頻率為 105~0.1Hz，交流偏壓為 10 mV，詳細儀器設定
見表格四.1
。待其掃描 完成後，以 pH=12 的緩衝溶液清洗數次，欲使抗體結構變性，將抗原(Hp)釋放，再用中 性緩衝溶液潤洗使其活性恢復，放入另外一樣品中，如此重複，作完不同表現型之 Hp。由結果可驗證 Hp-BEA 之可重覆使用性，並且其不會受樣品測試順序之影響，其模擬 出來的電荷傳遞阻抗值，見
表格五.3
，依照樣品測試的順序(Hp 2-2 →Hp 1-1→Hp 2-1) 分別為 12140， 6625，8417 (ohm)。符合我們對於＂不同分子量所造成的工作電極遮蔽 效應不同＂的預期，分子量越大所造成的阻抗越大，不受測試順序所影響。由此實驗可 證明 Hp-BEA 至少可以重複使用三次，並且樣品偵測順序之影響並不存在。 (見下頁)。
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 0
1 2 3 4 5 6
-Z im (kΩ)
Zre (kΩ)
Ab/AuNPs/SAM/Au
1st: Hp 2-2
3rd : Hp 2-1
2nd : Hp 1-1
圖 五.9 以 Hp-BEA 重覆檢測不同表現型之 Hp
由 Nyquist plot 圖中可觀察到三種不同表現型之 Hp 以不同順序分別與 Hp-BEA 反應 90 分鐘，在 EIS 量 測中有明顯相異的反應圖譜。為了避免抗原殘留效應影響實驗電阻量測，本實驗將分子量最大的 2-2 表 現型先行量測，再量測分子量最小的 1-1 表現型，發現其電荷傳遞阻抗值(Rct, 半圓直徑)依然有明顯的 差異與正確的趨勢（半圓直徑:Hp 2-2>Hp 2-1>Hp 1-1），也因此本實驗證明 Hp-BEA 可重覆使用並成功分 辨三種不同表現型之 Hp。(圖中數據點均為實際實驗數據；實線則為使用 Randles＇等校電路經由 Zsimpwin 軟體所模擬之數據)
表格 五.3 以阻抗分析軟體模擬 Hp-BEA 對不同表現型 Hp 之重複使用性偵測
5-6-2 專一性程度
此部分實驗在於驗證 Hp-BEA 之專一程度，實驗方法為配置不同濃度的 Lysozyme from(序列稀釋)，將修飾過後的金電極浸泡至最稀樣品約 120 μl，置於 4∘C 中等待約 90 分鐘後，以大量 1x PBS buffer(pH=7.2)潤洗，以去除物理吸附效應，之後放入至三
電極氧化還原反應槽中，以作 EIS 分析。反應槽中加入 2.5 mM K3Fe(CN)6 與 K4Fe(CN)6 當
將 Hp-BEA 依序插入至序列稀釋過後的 Lysozyme 樣品中，作對照組實驗，發現在 Nyquist plot 圖譜中，高濃度之對照組樣品(Lysozyme)有小幅度的波動，皆位於 0 附近 震盪，但幅度(~0.2)與趨勢不若 Hp 明顯正確，將電荷傳遞阻抗值(Rct, 半圓直徑)作整
0 1 2 3 4 5 6 7 0.0
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
180 sec 120 sec 60 sec
Hp2-2/Ab/AuNPs/SAM/Au
-Z im (kΩ)
Zre (kΩ)
Ab/AuNPs/SAM/Au 30 sec
圖 五.12 Hp-BEA 對於 Hp 2-2 作不同反應時間之檢測 (EIS)
由 Nyquist plot 圖譜可觀察到，相同樣品，不同抗體抗原反應時間之 Hp-BEA 訊號，其值有所不同，並 且電荷傳遞阻抗值(Rct, 半圓直徑)在反應 60 秒後差值漸漸變小，推測其穩定訊號時間值並不長約落在 數百秒之間。(圖中數據點均為實際實驗數據；實線則為使用 Randles＇等校電路經由 Zsimpwin 軟體所模 擬之數據)
表格 五.4 以阻抗分析軟體模擬 Hp-BEA 對 Hp 樣品有效反應時間之偵測
於此推論，將 Rct作整理並標準化作圖，以 Sigmoidal model 作分析，結果如下圖所示：
20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
Reaction time (Sec)
在進行當中。焓改變量(enthalpy change)，Hp 2-1 為 212 kcal/kmol，Hp 2-2=146 kcal/kmol 。由此推估 Hp 2-1 之次單位組成之鍵結能力較 Hp 2-2 來的強。
35 40 45 50 55 60 65 70 75 0
5 10 15 20 25 30
61.5 oC Hp 2-1
Temperature (oC)
ΔCp (k cal/k mol) Hp 2-2
59.5 oC
圖 五.14 以 DSC 來量測不同表現型之 Hp
溫度掃描範圍：25~100℃，溫度掃描速率：1℃/min，樣品濃度: [Hp 2-1]=0.39 mg/ml ；[Hp 2-2]=0.9 mg/ml。蛋白質變性溫度(Melting temperature)：Hp 2-1=61.5℃ ；Hp 2-2=59.5℃。焓改變量(Enthalpy change)：Hp 2-1=212 kcal/kmol；Hp 2-2=146 kcal/kmol 。
5-8 以 DLS 分辨三種不同表現型之 Hp
本實驗目的之一為希望有別於傳統電泳的方法鑑別三種不同表現型之 Hp，其中，應用 動態光散射儀來量測三種不同表現型之 Hp，來實際觀測印證 Hp 之立體結構在大小上的 歧異程度，取個別濃度約為 0.5 mg/ml 之純化 Hp，測得分子水合直徑大小為 Hp 1-1：
8.19±0.34 nm，Hp 2-1：10.41±1.67 nm，Hp 2-2：16.90±1.52 nm，與分子量之大小順 序相同，數據符合預期，在 DLS 中分佈圖如以下所示:
7.43 7.8 8.18 8.58 9.01 9.45 0
20 40 60 80 100
8.19 +/- 0.34 nm
Rela tiv e Numbe r
Diameter (nm)
Hp 1-1
圖 五.15 Hp 1-1 的粒徑大小量測 (DLS)
9.19 11.1 13.4
0 20 40 60 80
100 10.41 +/- 1.67 nm Hp 2-1
Rel a ti v e Number
Diameter (nm)
圖 五.16 Hp 2-1 的粒徑大小量測 (DLS)
13.4 15.3 17.4 19.8 22.6
一未知血液樣品的 Hp 表現型。
5-10 Hp 濃度變化之於 Hp-BEA 訊號變化
[Hp] increase in 10 times per line
-Z
im(k
Ω)
Zre (k Ω )
圖 五.20 Hp-BEA 對於 Hp 2-2 濃度作檢測 (EIS)
10-8 10-7 10-6 10-5 10-4 10-3 10-2
5-11-1 Non-AuNPs based Hp-BEA
本實驗起初以單純的金電極直接使用 cross linker (EDC/sulfo-NHS) 連結抗體作 EIS 的量測，目的為更簡化修飾的步驟，但是其穩定性並不如金奈米粒子修飾來的好，再現 設計，non-AuNPs based Hp-BEA 也相同的可以見得其 Rct 值在電極於抗原反應後，至少 有兩倍以上的阻抗變化反應(5649→16490 ohm)，見
表格五.5
，也因此本實驗證明 non-AuNPs based Hp-BEA 亦可成功分辨三種不同表現型之 Hp，但就操作者經驗來說，再現性較低，推測其分子固定較不穩定，亦可能反應面積不若有奈米金粒子修飾之 Hp-BEA 來的大。
0 5 10 15 20 25 30 35 0
2 4 6 8 10 12 14
Hp 2-2 Hp 2-1
Hp 1-1 Ab(Block)/3MPA/Au
圖 五.22 以無金粒子修飾之 Hp-BEA 偵測不同表現型之 Hp
由 Nyquist plot 圖中亦可觀察到三種不同表現型之 Hp 在 EIS 量測中有相當不同的反應圖譜。如前述實 驗設計所預測，在電荷傳遞阻抗(Rct, 半圓直徑)有相當明顯的差異。(圖中數據點均為實際實驗數據；
實線則為使用 Randles＇等校電路經由 Zsimpwin 軟體所模擬之數據)
表格 五.5 以阻抗分析軟體模擬 non-AuNPs Hp-BEA 對不同表現型 Hp 之偵測
5-11-2 Poly o -aminophenol based Hp-BEA
本 實 驗 以 溶 膠 - 凝 膠 (sol-gel) 的 形 式 來 固 定 感 測 分 子 ， 以 簡 單 的 鄰 - 胺 基 苯 酚 (o-aminophenol)單體與帶有抗體之酸根金奈米粒子(Au@Tiopronin)一同產生電聚合反 應(electro-copolymerization)以產生 HpAb-AuMCPs-POAP 聚合物。目的為一步驟製備
完成工作電極的感測分子(Hp 抗體)固定。以下為製備之 CV 圖，製備步驟
見章節 4-3-3
: 由以上製備之循環伏安圖可見，通以循環電壓越多回時，其反應電流越小且位於 0.31 V 之氧化電位也趨於平緩，此現象為聚合物(Poly-o-Aminophenol)大量附著於工作電極表 面之結果，可將此視為 POAP based Hp-BEA 製備完成之指標。0.0 0.2 0.4 0.6 0.8
-0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5
Current (μA)
Potential (V vs Ag/AgCl)
1st
3rd 5th 0.311 V
圖 五.23 以伏安法製備並觀測電極表面之 Electro-copolymerization
上圖中，分別記錄通以循環伏安電位第一，第三與第五次訊號之電流記錄；可見圖中在 0.311 V 的 OAP 氧化電位，因為 POAP 生成覆蓋電極的關係，使得電流反應趨於平緩，成為一不可逆反應之循環伏安圖。
上圖中，分別記錄通以循環伏安電位第一，第三與第五次訊號之電流記錄；可見圖中在 0.311 V 的 OAP 氧化電位，因為 POAP 生成覆蓋電極的關係，使得電流反應趨於平緩，成為一不可逆反應之循環伏安圖。