4-1 自製三電極電化學反應槽
傳 統 二 電 極 的 量 測 系 統 測 定 了 工 作 電 極 (working electrode, WE) 與 輔 助 電 極 (counter electrode, CE)之間的電壓-電流訊號，為了瞭解工作電極是在何種電位下進 行反應，這時即會加入另一電極，稱作參考電極(reference electrode, RE)，作為量 測氧化還原反應的基準電極，即稱為三電極量測，其個別功能皆有所不同，輔助電極主 要是與工作電極形成一迴路，因此其面機通常都要比工作電極大上許多，使得電化學反 應之電子都能經由此迴路作為傳遞，本實驗使用穩定性高的白金線作為輔助電極；參考 電極主要為提供一基準電位，故其電位不隨電流增大而有所改變，目前常使用的參考電 極有 Ag/AgCl, H2(Pt), SCE 等，本實驗使用前者(Ag/AgCl)作為標準電極[102,116]，其 方式為利用銀線浸泡至漂白水中，使其表面反應為 AgCl，並將銀線插入至玻璃毛細管 內；將玻璃管內注入 3N KCl，前端並以 5% 的 agarose 封口，作為與電解液接觸的介質。
其實驗配置如下圖：
圖 四.1 實驗室自製之三電極反應槽之配置圖
圖 四.2 實驗室自製之三電極反應槽之實體相片
4-2 工作電極之研磨與清洗
工作電極(Working electrode, WE)之製備分為電極灌模組裝(molding)、機械研磨、
化學研磨(polish)與
章節 4-3
所介紹之官能能機修飾(surface modification)等步驟。圖 四.3 工作電極之製備步驟
4-2-1 金電極組裝與機械研磨
步驟一: 取 0.5 公分長、純度 99.99、直徑 0.5 公釐之金線約與約 3 公分長之 銀線(或銅線)以薄銅環相連接，並以三用電錶測試電流是否可導 通。將製備之電極置入直徑約 1.3 公分之鐵氟龍模具中，下端固定。
↓
步驟二: 以三比一之比例配製編號為 174 之壓克力樹酯(AB 膠形式)，充分混 合，去除產生之氣泡後，灌入上述所說之鐵氟龍模具，放入真空反 應槽中。
↓
步驟三: 將反應槽抽高真空至約 1×10-5 pa，去除未反應之高揮發性溶劑，中 間反覆真空破真空以抑制氣泡凝固成型，約 30 分鐘後回復常壓，加 熱至攝氏 85 度約 120 分鐘，使其固化。退出模具取出電極備用。
↓
步驟四: 將金電極表面先依序使用 2000、3000 目水砂紙(Silicon Carbide) 作初步拋光，以超音波震盪器清洗殘餘粉末後，使用八吋鑽石砂紙 依 10、5、3、1 毫微米(μm)尺寸研磨之，各約 15 分鐘，再次以超音 波震盪器清洗，最後使用研磨用絨布配合 0.3、0.05 毫微米(μm)進 行細部拋光，各約 30 分鐘。電極以二次水，無水酒精，二次水之順 序震盪清洗備用之，或充填氮氣保存。
4-2-2 金電極之化學研磨
Potential (V vs Ag/AgCl)
C u rrent (
μA)
I II
圖 四.4 以循環伏安法進行化學研磨 (in H2SO4)
上圖中＂I＂代表的是 Au(100)的氧化電位值，＂II＂代表的是 Au(111)的氧化電位值，循環伏安圖下半 部則為還原電位值。由圖可知工作電極表面以兩種晶相為主要排列，其於雜晶相都可視為被研磨而消失。
4-3 工作電極表面之感測分子固定
本實驗欲在工作電極上固定生物分子以利後續生物感測之功能，其步驟就方法不同分 為下列三種：
4-3-1 含奈米金粒子之官能基修飾
本實驗操作之含奈米金粒子之電極修飾步驟詳參見文獻[117,118]與附錄六：
圖 四.5 含奈米金粒子之電極修飾步驟
4-3-2 不含奈米金粒子之官能基修飾
本實驗操作之不含奈米金粒子之電極修飾步驟詳參見文獻[119,120]與附錄七：
圖 四.6 不含奈米金粒子之電極修飾步驟
V
I III
IV
V II
III I II
IV
4-3-3 含奈米金粒子之官能基修飾(以聚合物包覆)
本實驗操作之以 2-胺基苯酚包覆奈米金粒子之電極修飾步驟詳參見文獻[32,121]與附 錄八:
圖 四.7 含奈米金粒子之電極修飾步驟(以聚合物包覆)
4-4 生物樣品之製備
本部分由實驗室博士後研究員鄭財木博士與姜芳馨同學完成製備工作： Hp 抗體分子 來自鄭財木博士於實驗室以小鼠腹水所製備之 monoclonal antibodies，其過程詳述於 鄭博士於 2007 年發表在 Clinical Biochemistry 的文獻中[57]，取部分測其濃度約為 2 mg/ml。測試表現型之 Hp 分子為健康自願者禁食抽血後，以低轉速離心(~3000 rpm)後，
取上清血漿並去除漂浮之脂質。正常人體血液內之 Hp 濃度皆在 0.5 mg/ml 以上。Hb 分 子則為離心後之血球破裂後即可取得 95%濃度以上之 Hemoglobin。
4-5 奈米金粒子之製備
4-5-1 水溶液奈米金粒子之製備(Colloidal AuNPs)
30 nm 檸檬酸鈉還原之水溶液金粒子製備步驟[122,123]:步驟一: 以二次去離子水配製 4%的 HAuCl4 溶液 1 ml。
↓
I
II
4-5-2 單分子層包覆奈米金粒子之製備(AuMPCs)
7 nm Tiopronin 包覆之奈米金粒子(Au@Tiopronin)之製備步驟[124]：
圖 四.8 Au@Tiopronin 合成示意圖[124]
步驟二: 取 0.5 ml 上述配置之溶液加入製 200 ml 二次去離子水中加熱至沸 騰並充分攪拌。
↓
步驟三: 劇烈攪拌上，緩慢加入濃度為 1%的 Sodium citrate 溶液 3 ml 至上 述沸騰溶液中，迴流冷凝(Reflux)加熱反應 30 分鐘。
↓
步驟四: 觀察溶液顏色由藍黑色轉變為酒紅色後即告反應完全，關閉加熱袁 使其回溫至室溫，放至攝氏四度冰箱保存備用。
步驟一: 取 0.31 克 HAuCl4 (>45 %) 與 0.38 克之 Tiopronin 一同溶解於 35 毫升之甲醇/乙酸 (6:1)溶液中，生成寶石紅色水溶液。
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步驟二: 現配製 0.6 g 克 NaBH4 15 mL 水溶液緩慢加入至劇烈攪拌之上述溶 液中，於４℃環境下待其反應 30 分鐘。
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步驟三: 以冷凍乾燥方式去除溶液並收集上層懸浮之黑藍色乾燥固體。取該 粗製之 Au@Tiopronin 固體 150 毫克溶解至 75 毫升之 dd-H2O 中，以 鹽酸調控其酸鹼度至 pH 值為 1。
↓
步驟四: 將上述溶液以分子量孔洞約為 3000 之透析袋以大量 dd-H2O (4 L)緩 慢進行透析約 72 小時，並更換水溶液五次以完整去除殘餘鹽類。收 集並置於 4℃保存，如此即可得帶有酸根包覆之奈米金粒子。
4-6 CV 與 EIS 量測之儀器設定
Tennessee, USA.)作為分析 Nyquist plot 之工具，所有數據皆帶入至簡單 Randles' Equivalent Circuit 作模擬，得各電阻電容值，主要利用 Rct值作為實驗結果分析用，其介面操作如下圖所示：(紅色為實際測量值，綠色為軟體模擬趨近數值)
表格 四.2 ZSimpWin 軟體分析之數據格式