2-1 DNA 聚合酶連鎖反應 (Polymerase Chain Reaction,PCR)
1983 年 Kary B. Mullis 博士則想出 PCR 技術－現今所發展出來的 PCR 技術放大 選殖DNA 的片段，並且在 1993 年獲得諾貝爾化學獎[130]。PCR 是放大特定 DNA 片段的實驗技術，使欲放大的目標DNA 序列兩端分別合成能與其形成緩冷配對反應 (annealing) 的前置引子 (forward primer) 和反置引子 (reverse primer)，再利用 DNA 聚合酵素(DNA polymerase)以目標 DNA 的兩股分別做為模板(template)來合成新的 DNA 股。
在理想的PCR 反應條件下，每執行 PCR 一次其 DNA 產物增加為原來的兩倍，
故PCR 公式為 DNA 增加的量將會是 2n，n 是代表 PCR 執行的次數。在本實驗中採 用的是Tag DNA 聚合酶(Taq DNA polymerase)是個耐高溫的酵素，在 95℃ 中其活性 的半衰期 (half life) 長達 40 分鐘，故可供 PCR 操作使用。其酵素有效作用溫度為 72℃，此溫度下分鐘可合成 2000-4000 個核甘酸(nucleotidees)。但 Taq 聚合酵素因為 缺乏3'至 5'端外切酵素 (exonuclease)，所以在 DNA 合成時沒有校對(proofreading) 的 功能，在每一個循環中錯誤配對的頻率可高達1/6000 個核甘酸。
影響PCR 的 DNA 合成時的精確性之因素:1.核甘酸在 PCR 合成時的濃度，核甘 酸的量應控制在 10pg~1ug 之間，過多或過少都會影響 PCR 之精確性; 2.DNA 的長 度：以1kb 以下為宜; 3.循環數:越多時精確度越低; 4.DNA 聚合酶的種類:有校對能力 者為佳; 5. Mg2+ 的含量：建議在0.5-2.5 mM 之間，其會影響引子黏合、DNA 雙股打 開時所需之溫度、引子形成二聚物等 。
2-2 DNA 定序
DNA 定序有兩種方法，分別是 Sanger 法及 Maxam-Gilbert 法。而 Sanger 法 是目前市面上所用的定序法，以 DNA 為模板，加入四種不同螢光標示的核甘酸的 類似物ddNTPs (ddATP、ddTTP、 ddCTP、 ddGTP)及適當比例的 dNTPs 和聚合酵 素，同時進行聚合酵素鏈鎖反應。因為核甘酸類似物缺少3'-hydroxyl group，因此無 法與下一個核甘酸的5'-Phosphate group 形成 phosphodiester bond，使得 DNA 複製終 止在這些類似核甘酸的位置上，造成各種長短不一的DNA 片段。再以高解析度的毛 細管電泳技術將這些長短不一的DNA 片段 分離，最後透過雷射光激發，並利用 CCD 偵測每一片段不同螢光的組合來判讀DNA 序列。
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2-3誘導劑 IPTG
養菌時使用IPTG 誘導目標蛋白質產生，且 IPTG 其結構式類似乳糖 (lactose) 的 誘導劑，其誘導的目標是乳糖操作因子(lac promotor)的抑制蛋白(repressor)，所以 IPTG 或乳糖會使抑制蛋白失活，達到誘導基因的目的。在細菌(E.coli) 培養中，添 加 IPTG 可有效地在短時間內快速誘導外來重組基因，產生目標蛋白質，但會對細 胞新陳代謝能力的產生影響，相對於不帶有質體的菌體，對帶有質體的菌體有較大 的抑制作用，使得帶有質體的菌體比生長速率降低，即使沒帶有質體的菌體也會受 到影響[131]。一般使用方式多半為先培養菌體到高濃度，再利用誘導劑誘導外來蛋 白質，以取得最大量的目標蛋白質。改變 IPTG 的濃度也會使得內涵體形成的位置 產生改變，在IPTG 濃度較低(0.025 ~ 0.1 mM)時內涵體(inclusion body) 會只在細胞 間質(periplasm)形成，但如果 IPTG 濃度提高(0.1 mM)，則在細胞間質和細胞質 (cytoplasm) 內都會產生[132]。
2-4內涵體 (Inclusion body)
在本實驗中用MTGFP 基因或 MTekGFP 基因以 E.coli 為宿主，大量表現目標重 組蛋白，使蛋白質過量生產產生內涵體。內涵體是一種不可溶、密度較大、顆粒狀 的無活性蛋白質[133]，內涵體不一定只在受損、突變、生長溫度偏高才會出現在細 胞內，當表現蛋白質為有毒蛋白或微生物在細胞內大量表現重組蛋白質時，也會在 其內形成不可溶的蛋白質堆積，即為內涵體[134,135]。
形成內涵體的原因有兩種，一種是因為高濃度的重組聚胺基酸鏈(recombinant polypeptide chains) 因疏水性作用力而發生聚集(aggration)且形成無定型的聚合物在 細胞內或細胞間質[136] ;另一種則為原本應在蛋白質分子內形成的雙硫鍵(disulfide bond) ，卻形成在兩個蛋白質分子間，使得蛋白質分子串聯形成密度較原本單一蛋 白質分子為大的巨型分子。然而內涵體的形成不一定都是雙硫鍵的原因，但是經過 研究內涵體之所以不能行逆反應變回原來的蛋白質分子，應該與雙硫鍵形成後增加 分子的穩定度有關[137]。
以 產 量 及 純 化 的 觀 點 看 內 涵 體 ， 其 實 利 用 內 涵 體 獲 得 蛋 白 質 有 許 多 好 處 [138-140]：1.可獲高產量的蛋白質，因為內涵體佔全部細胞蛋白質 30% 以上，且內 涵體內有 95 % 皆是重組的目標蛋白質，或是每公升菌液可產 8.5 克蛋白質 [141,142]2.內涵體因為在分子間有雙硫鍵形成，且可被分解的胺基酸序列都被包埋在 內涵體內部，所以不易被蛋白質水解脢 (protease) 水解，3.內涵體為不可溶的蛋白 質，可藉由此特性將破菌後的內涵體，利用離心、重複洗滌、膜過濾等方式[143]，
分離可溶性蛋白（例如：核酸、磷脂、及其他水溶性蛋白質），減少純化步驟[144]。
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有研究建議洗滌內涵體時，可依狀況添加低濃度的尿酸或胍鹽酸或 EDTA 等，可移 除可能會吸附在內涵體表面或疏水性區域上的雜蛋白，增加復性的效率[145]。
2-5 蛋白質變性與沈澱
蛋白質發生變性時，其多胜鏈的共價鍵並沒有斷裂，被破壞的只有蛋白質的二 級、三級、四級結構。然而蛋白質變性時，常會造成蛋白質溶解度降低而產生沉澱。
常見的蛋白質沉澱法︰
強酸(強鹼)沉澱法:在中性蛋白質溶液中加入強酸（或強鹼），使羧基（或胺基）
變成未解離之羧基 (或已質子化之胺基），而可接電子之氮原子，因質子化造成蛋 白質帶有正電荷（或去質子化而不帶電荷），導致蛋白質受到離子鍵（鹽橋鍵） 及 氫鍵等破壞，使蛋白質溶水性變差而沉澱。
有機溶劑沉澱法:加入水溶性有機溶劑 (如: 酒精、丙酮等) 因為其具有低介電常 數，所以會造成蛋白質間正負電荷結合力增加，形成厭水性膠體使水與蛋白質間作 用力減低，而蛋白質溶解度下降隨即發生沉澱而沉澱。
重金屬離子沉澱法:蛋白質在水溶液中是酸鹼兩性電解質，在 pH 7.0 或以上溶 液中，蛋白質分子大部分帶負電荷，故能與正電荷的重金屬離子結合，中和蛋白質 其負電荷，形成蛋白質鹽沉澱出來，此種沉澱稱為蛋白化重金屬。
植物鹼沉澱法:利用生物鹼之酸根與蛋白質之陽離子電荷結合形成難溶性鹽類 而沉澱。常用的生物鹼有鞣酸、三氯醋酸(trichloroacetic acid) 、磷鉬酸、苦味酸及 sulfosalicylic acid 等。當 pH 小於蛋白質等電點時，沉澱最明顯。
鹽析法(salting out):於蛋白質溶液中加入多量輕金屬鹽類，改變溶劑介電常數，
使蛋白質間作用力增加而沉澱。一般常用硫酸銨鹽((NH4)2SO4)沉澱蛋白質。
加熱沉澱法:幾乎所有的蛋白質都會因為加熱變性而凝固，產生不可逆的沈澱。
蛋白質在等電點時，加熱凝固最完全且迅速。但在酸性或鹼性溶液中，蛋白質帶有 正電或負電時，雖加熱蛋白質也不會凝固，除非同時有足量的中性鹽存在，則蛋白 質即可因加熱而凝固。
2-6 各種常見的化學變性劑
一般常用的化學變性劑溶解內涵體，或將糾結聚集在一起的蛋白質質結構解 開，其作用原理簡單介紹如下：
尿素 (Urea)：
一般建議使用高濃度的尿素 9 M，破壞分子內氫鍵及疏水性作用力，而在本實
驗中，我們使用4.5M 的濃度來達到蛋白質的變性[146]。
胍鹽酸 (Guanidine hydrochloride，GuHCl)：
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一般建議濃度 6 M，主要可破壞分子內疏水性作用力及離子性作用力。和尿素
一樣是和蛋白質分子間形成氫鍵鍵結且其作用力大於穩定蛋白質結構之力量，因而 將蛋白質拉開至鬆散的構形。此外亦可伴隨著添加少量氯化鋰（LiCl）或氯化鈉
（NaCl）等鹽類，以加強破壞離子性作用力[146]。
鹽類：
常用氯化鈉(NaCl)、氯化鉀(KCl)、氯化鋰(NaLi)，主要破壞離子性作用力[147]。
還原劑 (reducing agent)：
一般常用二硫代酥糖醇 (dithiothreitol，DTT)[148]、DTE (dithioerythritol)、半胱 胺酸(cysteine)、β－氫硫基乙醇(β- Mercaptoethanol)[110]等，主要作用是破壞雙硫 鍵，並加入還原劑將雙硫鍵還原成氫硫鍵。由於雙硫鍵為共價鍵結，為穩定蛋白質 結構最主要力量，因此要完整破壞其結構還需要尿素或胍鹽酸的協助方可達成。另 外無雙硫鍵的蛋白質，像 Bacillus subtilus α-amylase 則不需添加此種還原劑。
清潔劑 (detergents)：
常用的清潔劑有包括十二烷基硫酸鈉 (sodium dodecylsulfate, SDS)[149]、n-cetyl trimethlammonium chloride[150]、sarkosy[151]、sodium n-laurosyl sarcosine[152]等，
利用清潔劑本身親水性基將蛋白質的立體結構解開成直鏈，使蛋白質疏水性區域裸 露出來，並帶負電荷。可將蛋白質立體結構拉開並帶負電荷[110]。最有名的例子，
就是用在跑蛋白質變性電泳時，用SDS 使蛋白質變性。
pH 值：
胺基酸的組成中含有氨基(-NH3+)與羧基(-COO-)這兩種基團，在高 pH 值的環境 中氨基會失去一個氫原子而變成 NH2，使得胺基酸帶負電，在低 pH 值的環境中羧 基會接上一個氫原子形成 COOH 而使胺基酸帶正電。因此在高、低 pH 值的環境 中，蛋白質會因為胺基酸之間有庫倫作用力互相相斥，而無法正常的排列、組織成 自然的結構。
金屬螯和劑
一般常用乙二胺四乙酸 (ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA) 及 2-氨乙基醚 (ethylene glycol tetraacetic acid,EGTA) 等金屬螯合劑，其會與溶液中的金屬結合，形 成穩的螯合物，避免金屬影響化學反應的進行。
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2-7 蛋白質摺疊 (Protein Refolding)
探討蛋白質由一無特定構形的鬆散結構摺疊到具有特殊構形的過程，其分子內 結構變化及分子間交互作用是目前熱門的研究蛋。白質摺疊的機制在真核細胞與原 核細胞中可分為Cha peronin-dependent 與 Chaperonin-independent 兩種[153]。對於小 分子蛋白質而言是不需要chaperones 即可自行摺疊到自然態；但大分子蛋白質在摺 疊過程中，需要chperones 的協助才能順利摺疊到自然態，因為 chaperones 可結合到 暴露在親水環境中的疏水性的胺基酸鍊上，避免蛋白質分子產生交互作用造成聚集 而影響摺疊效率[154,155]。
本實驗用階段性熱力學平衡透析法來做蛋白質摺疊，這個透析法的理論基礎是 建立在2002 年提出的 First – order like state transition model[115]，這是一個首先探討 蛋白質在凖靜態熱力學平衡的過程摺疊的模型。並且此理論與 1937 年的相轉換理論 相符合[156]。而 First – order like state transition model 可以有效的降低摺疊過程中蛋 白質分子的交互作用，避免聚集現象產生[157]。另外根據這理論所衍生出的階段性 熱力學平衡透析法，可以使蛋白質摺疊路徑有效率的繞過相轉變區間 (即
本實驗用階段性熱力學平衡透析法來做蛋白質摺疊，這個透析法的理論基礎是 建立在2002 年提出的 First – order like state transition model[115]，這是一個首先探討 蛋白質在凖靜態熱力學平衡的過程摺疊的模型。並且此理論與 1937 年的相轉換理論 相符合[156]。而 First – order like state transition model 可以有效的降低摺疊過程中蛋 白質分子的交互作用，避免聚集現象產生[157]。另外根據這理論所衍生出的階段性 熱力學平衡透析法，可以使蛋白質摺疊路徑有效率的繞過相轉變區間 (即