實驗方法 - MTGFP融合蛋白摺疊過程中分子內螢光能量轉移研究

3-1.1 重組蛋白質 pET200-MTGFP 及 pET200-MTekGFP 基因鑑定

目的:

pET200-MTGFP 及 pET200-MTekGFP 的 E.coli(BL21(DE3))菌株是由實驗室前人 (蔡娟美小姐)建立的，但因為此菌株長期保存在-80℃冰箱，所以要確認並沒有因為長期保存，造成質體被踢出或質體中有基因突變等問題，所以利用(1) PCR 加上 DNA 電泳確認重組蛋白質片段大小 (2) 重組蛋白質的 DNA 定序。

MTGFP 及 MTekGFP 重組蛋白的介紹：

MTGFP 及 MTekGFP 其 DNA 序列上幾乎完全相同,只差別在 MTekGFP 的 DNA 序列比MTGFP 多一個 enterokinase 的切位在 MT 及 GFP 之間。

流程:

pET200-MTGFP 及 pET200-MTekGFP 的 E.coli(BL21(DE3)菌株→挑單一菌落→

聚合酶連鎖反應(Polymerase Chain Reaction,PCR)與瓊膠電泳(Agarose Gel Electrophoresis)確認 DNA 分子量→DNA 定序。

方法:

PCR 首先利用 PCR (polymerase chain reaction) 的方式，確認重組蛋白質 (MTGFP 及 MTekGFP)的基因是否有存在質體當中。利用已經接上重組蛋白質基因的菌株當做PCR 的模版 (template)，利用 T7 forward primer 引子及 T7 reverse primer

DNA 定序: 由於 MTGFP 及 MTekGFP 的 DNA 長度分別為 999 及 1011 bp，而市面上定序公司其DNA 定序的最佳化長度為 700-750 bp，接近或超過此長度時即建議利用Froward primer 及 Reverse primer 做 DNA 序列兩端的定序提升增加準確性。

實驗步驟:

首先解凍含 pET200-MTGFP 及 pET200-MTekGFP 重組蛋白菌種 (E.coli BL21(DE3))，利用養菌棒清沾菌液，取含 Kanamycin 的培養皿四區畫線，挑出單一菌落，再將挑出的單一菌落，再做一次畫線增加其產量，做為 PCR 反應的 template，進行 PCR 反應，之後跑 DNA 膠鑑定再定序送件。

3-2 蛋白質的小量表現與蛋白質的大量表現

目的:

將重組蛋白質的基因利用大腸桿菌 (E. coli) 的表現系統 BL21(DE3) 表現 MTGFP 及 MTekGFP 蛋白質。

方法:

利用BL21(DE3) E. coli 菌株大量複製帶有要表現 MTGFP 及 MTekGFP 基因片段 的 pET200 質體，並在 37 ℃ 環境下以 IPTG 誘導 E. coli 大量表現蛋白質，最後因為長時間誘導 (16 小時) 形成蛋白質結構錯誤的內涵體 (inclusion body)。待細菌培養適當時間之後再用物理性破壞方式來把細胞打碎以得到所需要的蛋白質。利用誘導大腸桿菌產生蛋白質內涵體的的優點有：(1)細菌生長快速。(2)蛋白質產量極高。(3)蛋白的純度也相對較高。

實驗步驟：

蛋白質小量表現：

將之前製備好的MTGFP 及 MTekGFP 儲存菌株(stock)，取出 20μl 菌液加入 3ml 含有抗生素(Kanamysine, 20g/ml)的 LB 中，於 37℃震盪培養 16hr，使菌株活化。

蛋白質大量表現：

接著從活化的菌株中取出 250μl 菌液，加入含有 250ml LB 的培養錐形瓶中，同樣在 37℃ 中震盪培養 4 小時，之後加入 IPTG (最終濃度為 1mM ) 再繼續培養 16 小時。將培養好之菌液以 9000 rpm,於 4℃ 下離心 3 分鐘得到沈澱的菌體，此菌體再去破菌，即可得到 MTGFP 及 MTekGFP 的內涵體。

3-3蛋白質純化 3-3.1 破菌

目的:

利用破菌後得到蛋白質，而本實驗所要的蛋白質為不溶解的蛋白質，故利用蛋白質溶解度的特性，最為蛋白質初步純化。

實驗步驟：

1.將菌體以少量的含 Pefabloc 的去離子水將菌懸起。

2.將菌液放入破菌機(constant cell disruption systems)中，以壓力 28 kpsi 進行破菌。

3.將破菌後之溶液以 9000 rpm,於 4℃下離心 10 分鐘，將破菌後上清液(supernatant) 及不溶水的內涵體(inclusion body)沉澱分開收集。(破菌完全的 inclusion body 會呈現白色；黃色或綠色表示菌沒有破完全；夾雜黑色是破菌機中的O-ring)

4.開始清洗 inclusion body

4-1.用去離子水均勻打散使 inclusion body 旋起

4-2.19000 rpm 4℃下離心 10 分鐘，倒掉液體部分(要觀察液體是澄清或渾濁) 4-3.重複 step 4-1 & step 4-2，直到液體呈現澄清狀態。

5.直到離心後的上清液接近澄清透明，此時代表已將沈澱物中雜質清洗乾淨，

6.取適量的上清液及沈澱物進行 SDS-PAGE 分析。

3-3.2Gel filtration

目的:

將MTekGFP 蛋白質經由酵素切割後，利用 Superdex 200 XK16/40 的 column 分離實驗所需要的 GFP 蛋白質。

實驗步驟：

1. 將 Enterokinase 酵素處理後的 MTekGFP 蛋白質，離心並且將換置於 PBS pH 7.4 的緩衝液中，利用 0.22uM 過濾膜過濾樣品之後抽氣大約 10 分鐘。

2. 配置 PBS pH 7.4 的緩衝液，利用 0.45uM 的過濾膜過濾抽氣，再將 Superdex 200 XK16/40 的 column 內的緩衝液換置到 PBS pH7.4 的環境中。

3. 將電腦與機器連線，將樣品經由注射閥進入 Superdex 200 XK16/40 的 column 中，並且開始紀錄及收集。

3-4西方墨點法(Western)

目的:

利用專一性抗體來辨認目標蛋白質 方法:

將蛋白質以SDS-PAGE 的電泳分析蛋白質分子量位置，再轉印到 PVDF 纖維膜上，再利用抗體進行冷光呈像。

材料配方：

TBS 配方：0.5 M Tris-HCl pH7.4，0.15 M NaCl

TBST 配方：0.5 M Tris-HCl pH7.4，0.15 M NaCl，0.1 % Tween 20 實驗步驟：

1.活化 PVDF 膜: 利用 100%甲醇浸濕 PVDF 膜，因為 PVDF 本身為疏水性，藉由甲醇可活化PVDF 膜上的正電基團，使其更容易跟帶負電的蛋白質結合。

2.將活化後的 PVDF 用二次水清洗掉甲醇後，泡入轉印的緩衝液(transfer buffer)中保濕靜待使用。

3.將 3M 的圖畫紙也泡入轉印的緩衝液(transfer buffer)中保濕靜待使用。

4.等 SDS-PAGE 已經依照蛋白質分子量大小將蛋白質分開後，即可進行轉印。

5.放置順序:圖畫紙(兩張) → 轉印膜 PVDF → SDS-PAGE →圖畫紙(兩張)。

6.通電時間 100mA，100 分鐘。

7.取出轉印完成的 PVDF (注意正反面)，置入含有 5% 牛奶的 TBS buffer， 25℃搖晃blocking 2 小時。

8.在含有 1%牛奶的 TBST buffer 中，加入一級抗體搖晃培養 2 小時。（一級抗體：

Mouse Anti-His-tag Monoclone Ab; Mouse Anti-GFP Monoclone Ab; Rabbit Anti-MT polyclone Ab）

9.用含有 1%牛奶的 TBST buffer 清洗 PVDF 每 2 分鐘一次，共洗 20 次。

10.在含有 1%牛奶的 TBST buffer 中加入二級抗體搖晃培養 1 小時。（二級抗體：Goat Anti-Mouse IgG-HRP; Goat Anti-Rabbit IgG-HRP）

11.使用含有 1%牛奶的 TBST buffer 清洗 PVDF 每 2 分鐘一次，共洗 20 次。

12.利用 TBS buffer 清洗 PVDF 將 Tween-20 洗淨 13.PVDF 避光加入冷光試劑即刻進行壓片。

3-5蛋白質摺疊(Protein folding)

目的:

將摺疊結構錯誤的蛋白質利用物理方法將其結構解開，再緩慢進行摺疊，使其摺疊回自然態(Native state)。

實驗步驟：

1.將透析膜放入 0.1M 的乙二胺四乙酸 (EDTA) 水溶液，再用熱水煮沸 5 分鐘，再取出膜後再用二次水清洗透析膜上殘留的EDTA。

2.將內涵體用變性藥劑溶解後，在 4℃下劇烈攪拌 12 小時，然後用 0.22μM 過濾膜去過濾蛋白質樣品，再將蛋白質樣品裝入只允許小於3kD 的蛋白質通過的透析袋內，

並將半透膜置放於2.5L 的摺疊緩衝溶液( Refolding Buffer) 中，依照階段性熱平衡透析法的條件(表 5)，確實的置換緩衝液，並收集每個階段的蛋白質摺疊中間體，

進行一些分析測量其結構變化。

表5 階段性熱平衡透析法的變性藥劑和蛋白質摺疊緩衝液的化學成分

步驟名稱配方

Tris Buffer

(mM)

pH Urea (M)

β-ME (mM)

Mannitol (%)

Pefabloc (μM)

Metal Cd²⁺

(μM)

時間

（小時）

置換次數

Denature Buffer 10 11 4.5 100 0.1 0.5 12 小時溶解蛋白質

Folding buffer,R1 10 11 2 0.1 0.1 0.5 10 24小時 2

Folding buffe,R2 10 11 1 0.1 0.1 0.5 10 12 小時 2

Folding buffe,R3 10 11 0.1 0.1 0.5 10 12 小時 2

Folding buffe,R4 10 8.8 0.1 0.1 0.5 10 12 小時 2

Folding buffe, R5 -1

10 8.8 0.1 0.5 10 12 小時 1

Folding buffe, R5 -2 (Native buufer)

10 8.8 0.1 0.5 12 小時 2

3-6 圓二色光譜儀 (Circlular Dichrorism, CD)

目的:

利用此儀器的近紫外光(near-UV)波段與遠紫外光(far-UV)波段，分別可觀察蛋白質的三級結構與二級結構。

實驗步驟：

1.將摺疊過程中每一階段透析袋內的蛋白質中間體稀釋成 0.2mg/ml，用 0.22μM 過濾

膜去過濾蛋白質樣品。因為濃度將影響CD 光譜的橢圓偏轉角的大小，因此對於樣

品的原始濃度的量測必須特別小心。

2.準備摺疊過程中每一階段透析換過後緩衝溶液。

3.取出稀釋後的樣品 200 μl 於 0.1cm 寬的 CD cell 中，並將循環水槽溫度設在 20℃。

4. CD 光譜儀型號為 AVIV-410 的其他參數設定為：

wavelength range 為 300~180 nm，Band width 為 1.00 nm，Temp. Setpoint 為 25.00 deg C，Wavelength Step 為 1.00 nm，Averaging Time 為 3.000 seconds。

5.實驗過程中若燈壓(high tenstion，HT)訊號超過 800 時，會影響樣品吸收偏極光的程度，所以結果不可信，因此要立即停止實驗重新調整參數。

6.實驗結果為 molar ellipticity [θ] (單位：deg·cm²·dmole^-1) [172]，並利用程式 SELCON3[173]去分析蛋白質的二級結構比例。

3-7 動態光散射儀 (Dynamic Light Scattering,DLS)

目的:

分析蛋白質摺疊中間體的分子粒徑大小分佈情況。

實驗步驟：

1.使用 DLS 為型號 BI-200S，Brookhaven Instruments Corporation (紐約，美國)。

2.蛋白質樣品的濃度：1 mg/ml。(實際上蛋白質的濃度可依照光線打到蛋白質後，其對散射光程度做調整，並取2 mL 的樣品置放於透明試管中。)

3.動態光散射儀以波長 532 nm 氬離子雷射，訊號接受器則由測角器固定於 90°角，

腔體內溫度由循環水槽控制在20℃，最後將試管至於儀器的樣品槽中，即可透過

儀器的軟體進行粒徑大小的偵測。

3-8 感應耦合電漿原子發射光譜法（Inductively Coupled Plasma Atomic Emission Spectrometry, ICP - AES）

目的:

利用HORIBA JOBIN YVON 出產的 ICP – AES，型號: ULTIMA 2000 的機器，

應用在測量蛋白質內金屬的含量，因為本實驗所用的MTGFP 融合蛋白，其本身具

有金屬硫蛋白（MT）分子，若融合蛋白質有摺疊回自然態就會有螯合金屬的功能。

用ICP-AES 去測量 MTGFP 融合蛋白其 Fe、Mn、Zn、Pb、Cd、Cu、Ni 的含量，分析透析袋內的蛋白質溶液及透析袋外置換後的緩衝液兩者金屬含量的莫爾數差，最

後再與蛋白質莫爾數去做比較，因為一個金屬硫蛋白擁有7 個金屬鍵結的位置，所

以可利用此特徵推測金屬與蛋白質鍵解的比例。

方法：

將樣品溶在酸性溶液中，分析其水溶液中的元素，係利用高頻電磁感應產生的高溫氬氣電漿，使導入電漿中的樣品受熱而起一系列的去溶劑、分解、原子化 / 離子化及激發等反應。其分析的依據，係利用被激發的待分析元素之原子 / 離子所發射出的光譜線，經由光譜儀的分光及偵測，即可進行元素之定性及定量[174]。本方法具有快速、靈敏及精密的分析特性。測定時，為補償因光譜背景值之不同所導致的誤差，儀器必須具有背景校正的功能。背景校正所選定的波長，需位於待分析元素的譜線附近。一般依據光譜干擾的程度，可在分析元素譜線的左右任選一方或兩方，且此選定的位置需不受到光譜的干擾。

實驗步驟：

1.蛋白質樣品的前處理：將透析袋內待測 M5 的蛋白質樣品，其濃度稀釋到 0.1 mg/ml，準備 10ml；而透析袋外置換過後的 R5-2 緩衝溶液也準備 10ml。

2. ICP - AES 量測重組蛋白質:委託台北縣環保局鄭銘松學長操作。

3-9 螢光光譜儀(Fluorescence Spectroscopy)

目的:

1.分析蛋白質在摺疊的過程中，其摺疊中間體是否有逐步摺疊回自然態，主要觀察螢光能量是否有逐步增強且螢光光譜的最高峰有左移的現象。

2.分析融合蛋白質其摺疊中間體內的兩分子是否有能量轉移的現象，所以選用能激發

MT 蛋白質的激發光，若有 FRET 產生的話，MT 釋放的光會去激發 GFP，使 GFP 放出螢光。

方法：

1.利用 280 nm 的激發光，激發苯環胺基酸，觀察摺疊蛋白質摺疊回自然態。

2.掃瞄 3D 全光譜時，發現 MT 與 GFP 都有特有的螢光基團，利用此光譜的特徵，

尋找到310 nm 是一個可以分析 MTGFP 蛋白是否會有 FRET。

實驗步驟：

1.螢光儀的機型為 Hitachi 公司 F-7000。

2.將 MTGFP 蛋白質摺疊中間體的定量濃度到0.2mg/ml，再利用 280 nm 的激發光觀察MTGFP 蛋白質摺疊中間體是否有逐步摺疊回自然態

3.將純 MT 蛋白質與純 GFP 蛋白質定相同莫爾濃度到 60 mM，掃瞄 3D 全光譜，觀察

在文檔中 MTGFP融合蛋白摺疊過程中分子內螢光能量轉移研究 (頁 40-48)