緒論

第一章 緒論

1-1 研究動機

蛋白質、去氧核醣核酸、生物膜皆屬於生物巨分子，這些巨分子具有自我組織 (Self-organiziation) 形成穩定結構的能力，當生物巨分子處在開放系統的環境中，其 系統內部的分子會與外在環境產生交互作用，而改變構形，使分子趨於能量最低態 的特殊構形[1,2]。

金屬硫蛋白 (Metallothionein, MT) 具有α-，β- 兩個金屬鍵結團簇 (metal cluster/domain)[3-7]。2006 年研究指出，螯合金屬後的 MT ，其 α-，β- metal cluster 形狀類似兩個環狀結構，當β-metal cluster 形成(Mn2CdS3)^3-時，可形成磁矩；而α- metal cluster 雖沒有磁性卻扮演穩定β-metal cluster 的角色[8]。然而這環狀結構上的 金屬原子具有自由電子，且這些自由電子會在金屬原子上自由跳動，類似於電子共 振的現象[8]，所以我們推測 metal cluster 可能會吸收能量放出螢光或影響其他發光 機團的發光效應。

生物冷光(Bioluminescence)是在大自然中生物所發出的光之總稱，而本實驗中主 要是探討綠色螢光蛋白GFP (Green Florescence protein），而此蛋白質是 1962 年從 水母細胞中被發現，且使用395 及 475 nm 的光激發後，會在 508 及 503 nm 呈現螢 光[9,10]。

螢光蛋白在生物技術上有許多貢獻，例如用螢光蛋白做為指標，分析蛋白質摺 疊狀況的指標[11,12]，以及藉由螢光共振能量轉移 (Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET) 的效應快速檢測蛋白質在摺疊過程中能量的變化[13-15]。

然而在掃瞄MT 及 GFP 蛋白質螢光光譜時，發現其 MT 的放射光譜與 GFP 的螢 光激發波長的位置很接近，根據螢光共振能量轉移 (Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET) 理論(圖2) [16]，推測 MT 及 GFP 蛋白之間可能會有 FRET 現象，

於是我們合成金屬硫蛋白融合綠色螢光蛋白 (Fusion protein of Metallothionein and green fluorescence protein, MTGFP) 做為實驗材料。觀察及探討 MTGFP 蛋白質在摺 疊過程越接近自然態 (native state) 時，MT 及 GFP 兩蛋白質分子間距離越接近，是 否GFP 產生的螢光能量會有轉移的現象。

1-2 螢光原理介紹

螢光物質受到特定能量的光源激發後，可以產生高或低於原本能量光源的光的 物質。在平常的狀況下，這些螢光物質的電子大多會處於最低能量的狀態，稱為基 態。當分子吸收了與它的特徵頻率一致的特定光源時，其電子便由基態躍遷至能量

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較高的激發態 (此激發態又依能量的高低區分為各階的激發態)。經過一段時間，處 於不同能階激發態的電子會降至最低能量的激發態，在這一過程中所消耗的能量，

並不以光的形式釋放，這是因為這些螢光分子會和周圍的同類分子或其他分子經歷 震動鬆弛 (vibrational relaxation) 將能量散失掉。當降至較低能量激發態的電子又下 降至基態時，此時會以光的形式釋放出多餘的能量，所產生的光即是螢光(圖 1) 。

基態

激發光 放射光 震動鬆弛

熱 激發態

基態

激發光 放射光 震動鬆弛

熱 激發態

圖1 螢光能階示意圖

分子受到激發光刺激，由基態上升到激發態，因為電子處於激發態時能量較高且不穩定，所以 分子間會產生震動鬆弛(Vibrational relaxation)會先以熱的形式釋放能量，最後以螢光的形式放出 能量，回到能量最低的基態。

1-3 螢光共振能量轉移(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)

廣義的來說，FRET 指的是有螢光能量的改變造成螢光共振能量的轉移。但一般 而言，FRET 較常用來探討兩螢光分子間的作用因距離的關係，使被激發的螢光基團 (能量提供者, Donor , D) 能量在回到基態所放出的能量被轉移到鄰近的螢光基團 (能量接受者, Acceptor, A)的現象(圖2、圖3)。FRET 發生的主要條件：1. Donor (D) 和Acceptor (A)之間必須相互靠近小於 100 Å[17]2.Acceptor(A)的激發(Excitation,Ex) 光譜與Donor(D) 螢光放射(Emission, Em)光譜必須有重疊(圖4)。3.Donor(D)和 Acceptor(A)躍遷偶極方向(transition dipole orientations)並非垂直[14,18]。在本研究中 將MT 當作 donor，而 GFP 當作 Acceptor，倘若有 FRET 的現象產生時，會發生在蛋

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Donner 受到激發光激發的 donor，能量會由基態上升到激發態，因為電子處於激發態時能量較 高且不穩定，所以分子間會產生震動鬆弛 (Vibrational relaxation) 會先以熱的形式釋放能量，最 後以螢光的形式放出能量，回到能量最低的基態。 FRET 效應發生在 Donor 與 Acceptor 兩螢 光分子距離範圍約 10~100 Å 時，Donor 釋放的能量不會以螢光的方式釋出，而是轉移能量給 Acceptor，造成 Donor 螢光能量減弱而 Acceptor 螢光能量增加。

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R>>1.5 R

D A

R>>1.5 R

D A

R>>1.5 R

D A

FRET 現象的發生與兩螢光分子基團的距離是有強烈相關性。D: Donor ; A: Acceptor。R:兩螢光 分子之間的距離。R0 : Donor 因 FRET 效應而有 50 %能量被轉移至 Acceptor 的距離，一般最 R0

常見的距離為30-60 Å [17,19]。

5 色波形為其激發光Excitation ;淡黃色波形為其放射光 Emission 。綠色區塊為 Donor 釋放光與 Acceptor 激發光的光譜重疊的位置。 Ex 指 Excitation 激發波, Em 指 Emission 釋放光。產生 FRET 現象必須有以下條件:1.Donor (D) 必須能釋放螢光 2.Donor 及 Acceptor 間必須要有光譜重 疊[20]。

1-4 淬熄效應 (Quenching)

淬熄效應 (quenching) 屬於能量轉移效應的一種，原理為分子受到光刺激後，

電子從基態躍遷到激發態，然而從激發態回到基態的過程中，與處於基態的淬熄分 子 (quencher) 結合，導致部分分子能量喪失使總光能強度下降[21]。

影響淬熄效應的因素：(1) fluorophore 與 quencher 彼此距離；(2)溶劑的極性或溶 液的pH[22-24] ; (3)所用緩衝液的離子強度 [25,26] ; (4) 色胺酸(Trytophane)的殘基 的過程中釋出能量並產生放射光(Emission)。而在此過程中由於 P 物質直接參與反應

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1-6 綠色螢光蛋白(Green Fluorescence Protein,GFP)介紹

2008 年諾貝爾化學獎頒發給研究螢光蛋白的三位科學家，因為 GFP 使原本看 不見的東西，變成看得見，也變成更容易觀察活生物體基因表現。在1960 年日本化 學家下村脩(Osamu Shimomura) 在太平洋東岸北美海域的深海中發現具有生物螢光 的水母(Aequorea Victoria)，具有一般水母的外型，但在其傘狀頂部邊緣，可發現綠 色的螢光。在螢光水母內，Aequorin 為一種可將儲存的 ATP 的化學能轉換成光能的 冷光蛋白chemilluminescent protein），後來又發現純化 Aequorin 蛋白質可得到 GFP 此種綠色螢光蛋白。也就是說Aequorin 和 GFP 這兩種蛋白質藉由不同的發光機制產

Aequorin＂在經過鈣離子的催化後，經過氧化反應，會釋放波長 470nm 的藍色螢光。此色螢光 會傳遞能量激發GFP，使 GFP 釋放波長 508nm 的綠色螢光。

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Aequorin 這種會將化學能轉換形成光能的冷光蛋白(Chemilluminescent protein) 可與鈣離子結合，將儲存於Aequori 中的 ATP 化學能進行發生化學反應產生光能。

此過程為Aequorin 中的 coelenterazine 氧化成 coelentetramide，並釋出 470 nm 的藍 光，而此時發現GFP 吸收 Aequorin 釋出的藍光後，放出 508 nm 的綠光螢光[37-39] (圖 5)，後來發展應用於偵測細胞體內鈣離子的濃度[40]。

然而從水母發現的綠色螢光蛋白，其發螢光的機制是建立在螢光蛋白質的結 構，其內可形成共振的環狀發光基團[9]。另外後來陸續被 Morin 等人從腔腸動物的 某些物種中如水螅(Obelia)及海葵(Renilla)、珊瑚蟲(Discosoma)等發現會發螢光的蛋 白[41]，因為這些會發螢光的蛋白，具有類似的螢光基團結構，所以有 GFP-like protein 的名稱[42]。同時間 Morin 等人提出能量轉移理論，指出由化學發光的 aequorin 所 發出的藍光會刺激 GFP，將光能轉換成綠色螢光[20,43,44]。1974 年 Morise 純化出 GFP 蛋白並獲得蛋白的質結晶[45,46]；1978 年 Prendergast 和 Mann 將 GFP 的單一 分子量明確算出來約30kDa[47,48]；1992 年由 Cubitt 等人選殖出來，1994 年 Chalfie 等成功將綠色螢光蛋白的基因轉移 (transgene) 到大腸桿菌 E.Coli 和線蟲 C.elegans 中，並且表現出穩定的螢光[36,47,48]；1980 年華人化學家錢永健(Roger Y. Tsien)發 展的能發出各種顏色的螢光蛋白質[36,49]。

綠色螢光蛋白結構及發光機制

GFP 蛋白是由 238 個胺基酸所組成的單一蛋白質鏈 (single polypeptide) [50] ，大部分的胺基酸形成 11 條的 ß-sheets (ß-摺版) 的二級結構緊密的聚在一起，

形成筒狀三級結構，稱為ß-barrel，其 3D 立體結構為圓面直徑為 30 nm、高度 40 nm。

另外桶狀蛋白（ß-barrel）中軸上有一條α-helix，而參與激發螢光的發光基團 (chromophore)位於這條α-helix ，將發光基團包圍在 ß-can 的內部，成一個不受外 界環境影響的穩定空間[43,51] (圖6)。

GFP 的發光基團主要由 Ser65-Tyr66-Gly67 三個胺基酸組成[52] (圖 6)，經由環 化、脫氫、氧化三步驟形成多重的共軛雙鍵的共振系統而發出螢光。詳細介紹發光 的機制如下,1.環化作用:藉由單鍵旋轉，使 Tyr66 兩側的醯胺鍵逐漸靠近，此時 Ser65-Tyr66醯胺鍵上氫氧基的氧原子，與 Tyr66-Gly67醯胺鍵上的 N-H 非常接近，使 的陰電性極大的氮原子，與部分帶正電的C=O 雙鍵中的碳原子形成親核作用，產生 新的鍵結。使原本兩個醯胺鍵結的位置產生一個五元環(Imidazolidone ring)，且碳的 旁邊新接一個氫氧基，提供脫水位置。2.脫水：在五元環上的氫氧基和鄰近氮上的氫 原子脫出，形成一分子水持留下一個雙鍵結構。3.氧化：在鄰近 Glu222協助下，氧分 子在Tyr66的C^α-Cß鍵進行脫氫，產生C -C 雙鍵，使苯環與 Imidazolidone ring 之間

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的雙鍵可以互相溝通，形成p-hydroxybenzyliden-imidazolidinone 的共軛(conjugate)結 構[53]，這個結構形成π共振系統 (π-resonance system)，當受到適當波長的光線激 發時，此系統上的電子便會被激發而放射出螢光[42,43,54]。形成這步驟需要吸收可 見光並放出螢光[55,56](圖7)。

圖6 GFP 的發光基團結構

GFP 是一個筒狀結構，由 Ser65-Tyr66-Gly67三個胺基酸組成，鄰近Glu222 及 Arg96 可以協助穩 定Ser65-Tyr66-Gly67結構[57]。

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(a)

(b)

4-pHBI 4-pHBI

圖7 GFP 發光機團與其機制

(a)發螢光的共振結構示意圖：p-hydroxybenzyliden-imidazolidinone 的共軛(conjugate)結構[57]。

(b)為 Ser65-Tyr66-Gly67經由環化、脫氫、氧化產生螢光的步驟[57]。

GFP 的激發光及放射光各有兩個波段，當發光基團為電中性時其激發光為 470 到475 nm，放射光為 503 nm，而發光基團帶負電時其激發光為 395 到 397 nm，放 射光為508 nm，這是因為原本是電中性的發光基團會因為 Tyr66 上的酚基失去一個

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氫離子而帶負電，使得激發π電子所需要的能量降低，而一般狀況下這兩種構型都 會存在 [9,49,54,58,59]。

綠色螢光蛋白的穩定性

GFP 本身對溫度具有高穩定性，在溫度達到 65℃時，仍可保持其結構並具有活性 [60,61]；並且 GFP 在 pH5.5 到 pH12 的範圍均可保有較佳螢光強度，小於 pH4 及高 於pH12 會有螢光失活現象發生[61]；GFP 對蛋白質變性試劑耐受性很高，如：8M urea、6M guanidine hydrochloride、1% SDS 中皆非常穩定，但若將 GFP 置於 6M guanidine hydrochloride 並加溫到 96℃，則蛋白質就會失去活性[61]。

螢光蛋白應用及種類

突變GFP 可得到更多類型的螢光蛋白可以應用在生物技術上，做為一個良好的 標記材料，可廣泛應用在偵測基因在細胞體內的表現、蛋白質交互作用的研究。其

最大特色是不需要任何酵素及輔酶的作用，自行進行蛋白質摺疊，隨後利用UV 燈

即可觀察其表現，另外其他突變的螢光蛋白的簡介請參考(表1) [9,43,49,55,57,62-64]。

表1 突變 GFP 螢光蛋白種類

名稱 激發光/放射光 突變位置 螢光變化

EBFP 380-383 nm /440-447 nm Tyr66 ->His66 藍光 ECFP 433 nm/475 nm Tyr66 ->Trps66 藍綠光 EYFP 513 nm / 527 nm Ser65 ->Gly65

EBFP 380-383 nm /440-447 nm Tyr66 ->His66 藍光 ECFP 433 nm/475 nm Tyr66 ->Trps66 藍綠光 EYFP 513 nm / 527 nm Ser65 ->Gly65