實驗結果 - MTGFP融合蛋白摺疊過程中分子內螢光能量轉移研究

4-1.1重組蛋白質 pET200-MTGFP 及 pET200-MTekGFP 基因鑑定結果

重組蛋白質 pET200-MTGFP:

利用T7 forward primer 及 T7 reverse primer 及質體當做 template 進行 PCR，起初 T7 forward primer (pET200 質體中第 209 bp)及 T7 reverse primer (pET200 質體中第 485 bp)在 pET200 質體上有特定辨認的基因序列，然而插入MTGFP 的 DNA 長度為 999 bp 被包覆在其間，所以造成整段 PCR 產物長度為1276 bp。利用 1 倍瓊膠電泳(Agrose Gel Electrophoresis) 確認我們所保存菌株其重組基因序列大小為999 bp (圖15，圖16)。此外將 MTGFP 菌株做DNA 定序，確認是否有突變的狀況，定序用 ABI 3730XL DNA Analyzer，

而序列比對則用 NCBI (National Center for Biotechnology information)的 BLAST 功能，從比對的結果來看，與資料庫中 MT 及 GFP 序列完全相同，

所以能確認所保存的菌株為基因正確的MTGFP 菌株。

重組蛋白質 pET200-MTekGFP:

利用T7 forward primer 及 T7 reverse primer 及質體當做 template 進行 PCR，起初 T7 forward primer (pET200 質體中第 209 bp) 及 T7 reverse primer

（pET200 質體中第 485 bp）在 pET200 質體上有特定辨認的基因序列，然而插入MTekGFP 的 DNA 長度為 1011bp 被包覆在其間，所以造成整段 PCR 產物長度為1288bp。利用 1 倍瓊膠電泳(Agrose Gel Electrophoresis) 確認我們所保存菌株其重組基因序列大小為 1011bp (圖 15，圖 17)。此外，並將 MTekGFP 菌株做 DNA 定序，確認是否有突變的狀況，定序用 ABI 3730XL DNA Analyzer，而序列比對則用 NCBI(National Center for Biotechnology information)的 BLAST 功能，比對的結果與資料庫中 MT 及 GFP 序列完全相同，所以能確認所保存的菌株為基因正確的MTekGFP 菌株。

4-1.1.1 PCR 結果：

圖15 pET200-MTGFP 及 pET200-MTekGFP 其 PCR 產物做 DNA 電泳分析

N 指 Native Control, S 指 MTGFP (1276 bp) 及 MTekGFP (1288 bp), P 指 Postive control (pET30a , 370bp).

39 圖16 pET200-MTGFP 質體建構圖

MTGFP 基因全長 999 bp, 轉殖到 pET200/D-TOPO vectors (5741 bp)，最終轉殖後的 pET200-MTGFP 長度為 6740 bp。EK:為 enterokinase 的切位。

圖17 pET200-MTekGFP 質體建構圖

MTekGFP 基因全長 1011bp, 轉殖到 pET200/D-TOPO vectors (5741 bp)，最終轉殖後的 pET200-MTGFP 長度為 6752 bp。EK:為 enterokinase 的切位。

4-1.1.2 MTGFP DNA 定序結果:

將T7 forword 及 reverse primer 定序後的結果，合併擷取訊號強度為可信值的地方。

1.AGAAGGAGAT:指 RBS 序列

2.CATCATCATCATCATCAT:指 His tag 序列 3.紅色字:指 Enterokinase 序列(GATCT…TAAG)

4.黃色背景的文字：指 MT 序列(ATGGAC…TGCGCC)

5.綠色背景的文字：指 GFP 序列(ATGGCTA…CTCTACAAA)

ACCAATTTTTCACTCTAAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAG ATATACATATGCGGGGTTCTCATCATCATCATCATCATGGTATGGCT AGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGGGATCTGTACGACGATG

ACGATAAGGATCATCCCTTCACCATGGACCCCAACTGCTCCTGTGCT

ACAGATGGATCCTGCTCCTGCGCTGGGTCTTGCAAATGCAAAGAGTG CAAATGCACCACCTGCAAGAAAAGCTGCTGCTCCTGCTGCCCGGTGG GCTGTGCGAAGTGCTCCCGGGGCTGCGTCTGCAAAGAGGCTTCGGAC AAGTGCAGCTGCTGCGCCAAAGGGCAATTCTGCAGATATCCAGCACA GTGGCGGCCGCTCGAGTCTAGAATGGCTAGCAAAGGAGAAGAACTT TTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAAT GGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCTACATA CGGAAAGCTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGGAAAACTACCTGT TCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTCTCTTATGGTGTTCAATGCTT TTCCCGTTATCCGGATCATATGAAACGGCATGACTTTTTCAAGAGTGC CATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAACGCACTATATCTTTCAAAGATG ACGGGAACTACAAGACGCGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATAC CCTTGTTAATCGTATCGAGTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATG GAAACATTCTCGGACACAAACTCGAGTACAACTATAACTCACACAAT GTATACATCACGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGCTAACT TCAAAATTCGCCACAACATTGAAGATGGATCCGTTCAACTAGCAGAC CATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCA GACAACCATTACCTGTCGACACAATCTGCCCTTTCGAAAGATCCCAA CGAAAAGCGTGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACTGCTGCTG GGATTACACATGGCATGGATGAGCTCTACAAATAATGAATTAAACCC

GCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTAAGGGCGAGCTCAACGAT CCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGAAGCTAGAGA

4-1.1.3 MTGFP protein 定序結果

主要是由DNA 定序結果，利用軟體將 DNA 翻譯成 protein。

1.紅色背景文字:指 His tag 蛋白質序列(HHHHHH) 2.藍色字體：指 Enterokinase 切位序列 (DDDDK)

3.黃色背景的文字：指 MT 蛋白質序列(MDPNC…SCCA) 4.綠色背景的文字：指 GFP 蛋白質序列(MASKG…DELYK)

MRGSHPHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDHPFTMDPNCSCATD GSCSCAGSCKCKECKCTTCKKSCCSCCPVGCAKCSRGCVCKEASDKCS CCAKGQFCRYPAQWRPLESRMASKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKF SVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFSYGVQCFSRYPD HMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIE LKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNIED GSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLL EFVTAAGITHGMDELYK-

4-1.1.4 MTGFP protein 定序結果分別 NCBI 資料庫比對

(a)MT alignmentalignment 結果

->Query 指 MTGFP 中的 MT 序列

->Sbjct 指 Data Base 中的 Chinese hamster metallothionein Ⅱ gene 序列 -> 結果顯示： MTGFP 中的 MT 序列與資料庫中 Chinese hamster metallothionein Ⅱ gene 的 MT 99 %結果相符。MTGFP 序列的後半段有一個蛋白質 Arg(R)與 Chinese hamster metallothionein Ⅱ gene 上的 Gln(Q)不同，但並不影響蛋白質結構與特性，此兩種蛋白質皆為極性蛋白質。

(b)GFP alignment

->Query 指 MTGFP 中的 GFP 序列

->Sbjct 指 Data Base 中 cloning vector pBAD-GFPuv 的 GFP 序列

->結果顯示：MTGFP 中的 GFP 序列與 cloning vector pBAD-GFPuv 的 GFP 結果100% 相符。

4-1.1.5MTekGFP DNA 定序結果:

將T7 forword 及 reverse primer 定序後的結果，合併擷取訊號強度為可信值的地方。

1.AGAAGGAGAT:指 RBS 序列

2.CATCATCATCATCATCAT:指 His tag 序列

3.紅色字:指 Enterokinase 序列(GATCT…TAAG)( GACGACGATGAC) 4.黃色背景的文字：指 MT 序列(ATGGAC…TGCGCC)

5.綠色背景的文字：指 GFP 序列(ATGGCTA…CTCTACAAA)

ACCAATTTTTCACTCTAAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAG ATATACATATGCGGGGTTCTCATCATCATCATCATCATGGTATGGCT AGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGGGATCTGTACGACGATG

ACGATAAGGATCATCCCTTCACCATGGACCCCAACTGCTCCTGTGCT

ACAGATGGATCCTGCTCCTGCGCTGGGTCTTGCAAATGCAAAGAGTG CAAATGCACCACCTGCAAGAAAAGCTGCTGCTCCTGCTGCCCGGTGG GCTGTGCGAAGTGCTCCCGGGGCTGCGTCTGCAAAGAGGCTTCGGAC AAGTGCAGCTGCTGCGCCGACGACGATGACAAAGGGCAATTCTGCA GATATCCAGCACAGTGGCGGCCGCTCGAGTCTAGAATGGCTAGCAAA GGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGAT GGTGATGTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGG TGATGCTACATACGGAAAGCTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGG AAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTCTCTTATGG TGTTCAATGCTTTTCCCGTTATCCGGATCATATGAAACGGCATGACTT TTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAACGCACTATAT CTTTCAAAGATGACGGGAACTACAAGACGCGTGCTGAAGTCAAGTTT GAAGGTGATACCCTTGTTAATCGTATCGAGTTAAAAGGTATTGATTTT AAAGAAGATGGAAACATTCTCGGACACAAACTCGAGTACAACTATA ACTCACACAATGTATACATCACGGCAGACAAACAAAAGAATGGAAT CAAAGCTAACTTCAAAATTCGCCACAACATTGAAGATGGATCCGTTC AACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCT GTCCTTTTACCAGACAACCATTACCTGTCGACACAATCTGCCCTTTCG AAAGATCCCAACGAAAAGCGTGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGT AACTGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGATGAGCTCTACAAATAAT

GAATTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTAAGGGCG AGCTCAACGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGAAGCTAGAGA

4-1.1.6 MTekGFP protein 定序結果

主要是由DNA 定序結果，利用軟體將 DNA 翻譯成 protein。

1.紅色背景文字:指 His tag 蛋白質序列(HHHHHH) 2.藍色字體：指 Enterokinase 切位序列 (DDDDK)

3.黃色背景的文字：指 MT 蛋白質序列(MDPNC…SCCA) 4.綠色背景的文字：指 GFP 蛋白質序列(MASKG…DELYK)

MRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDHPFTMDPNCSCATD GSCSCAGSCKCKECKCTTCKKSCCSCCPVGCAKCSRGCVCKEASDKCS CCADDDDKGQFCRYPAQWRPLESRMASKGEELFTGVVPILVELDGDVN GHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFSYGVQCFS RYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLV NRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYITADKQKNGIKANFKIRHN IEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMV LLEFVTAAGITHGMDELYK—

4-1.1.7 MTekGFP protein 定序結果分別 NCBI 資料庫比對

(a)MT alignmentalignment 結果

->Query 指 MTekGFP 中的 MT 序列

->Sbjct 指 Data Base 中的 Chinese hamster metallothionein Ⅱ gene 序列 ->結果顯示：MTekGFP 中的 MT 序列與資料庫中 Chinese hamster

metallothionein Ⅱ gene 的 MT 99 %結果相符。MTGFP 序列的後半段有一個蛋白質Arg(R)與 Chinese hamster metallothionein Ⅱ gene 上 Gln(Q)不同，但不影響蛋白質結構與特性，此兩種蛋白質皆為極性蛋白質。

(b)GFP alignment

->Query 指 MekTGFP 中的 GFP 序列

->Sbjct 指 Data Base 中 cloning vector pBAD-GFPuv 的 GFP 序列

->結果顯示：MTekGFP 中的 GFP 序列與 cloning vector pBAD-GFPuv 的 GFP 結果100% 相符。

4-2 MTGFP 重組蛋白質的表現

利用大腸桿菌加入IPTG 誘導 16 小時，使 MTGFP 蛋白質大量表現，

也因為過量表現MTGFP 蛋白質，所以造成內涵體的產生，並利用破菌機破菌，經過二次水多次重複的清洗內涵體，收集破菌後的上清液與破菌後的內涵體，進行電泳分析來確定蛋白質的純度。跑膠結果在 39 kD 左右有大量表現的蛋白質，因為MTGFP 蛋白質分子量為 39.25 kD，所以推測應該是 MTGFP 蛋白質。

圖18 MTGFP 之 SDS-PAGE 分析

利用12% SDS-PAGE 確定蛋白質破菌清洗後 MTGFP 的內涵體純度的狀況。

M 代表 Marker, S 代表上清液，I 代表內涵體，紅色箭頭標的的位置為 MTGFP 蛋白質。

4-3 Gel filtration 純化蛋白質

利用Superdex 200 xk16/40 的 column 純化經由酵素處理過的 MTekGFP，目的是要得到純化的GFP 蛋白質。

將酵素處理過的MTekGFP 經由 Superdex 200 xk16/40 的 column 純化分離出

7 個小片段(fraction)，再以 SDS-PAGE 分析。將 7 個小片段(fraction)分別裝入微量離心管(Ependof)中，而第 4、5 管中可以收集到 GFP 蛋白質(圖 19、圖 20、

圖 21)。再將第五管的綠色螢光蛋白樣品，再做一次 Superdex 200 xk16/40 的 column 純化，可以得到純的 GFP 蛋白質(圖 22)。

圖 19 利用 Gel filtration 方式分離 MTekGFP 的蛋白質

Superdex 200 xk16/40 的 Column 分離出 7 個 fraction (片段)跑膠確認。

GFP 26kD

圖 20 Gel filtration (Superdex 200 xk16/40) 分離 GFP 跑膠確認圖

MTekGFP 經由酵素處理過後將 MT 與 GFP 分開，利用 gel filtration 得到純的 GFP 蛋白。

圖 21 Gel filtration (Superdex 200 xk16/40) 分離 MTekGFP 所收集的樣品

MTekGFP 蛋白質利用 Superdex 200 xK16/40 分離出 6 個 peak，標號 1 到 7 管對應著 gel filtration 的 peak1 到 peak 7。發出螢光的第 4-5 管內含有 GFP 的蛋白質。

35 40 45 50 55 60 65 70 75

-20 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

In te n si ty (m A U )

Volume (ml)

MTekGFP 20090419

Flow rate :1.5ml/min Superdex 200 xk16/40 Wait 10min

Tube:3min/tube

圖 22 利用 Gel filtration 來第二次純化 MTekGFP 蛋白

以Superdex 200 gel filtration 做純化，在 50ml 左右可以得到非常純的 GFP。

4-4西方墨點法確認 MTGFP 蛋白質

做Western 的目的是為要證明此大量表現的蛋白質為 MTGFP。而 MTGFP 蛋白質為融合蛋白，在其 N 端具有 6 個 Histidine 的序列，其次連接MT 蛋白質分子、最後才是 GFP 蛋白質分子，知道這些序列後，於是選用專一性抗體 rabbit–anti-MT (polyclone)、Mouse–anti-MT (Monoclone)、

Mouse-anti–His (Monoclone)、Mouse-anti– GFP (Monoclone) 來辨認特定序列，證明此為MTGFP 蛋白質。取 5ul 的濃度 0.1ug/ml 的內涵體，跑 SDS-PAGE 後，將蛋白質轉印到PVDF 膜上進行 Western Blotting 的實驗。證實我們合成之MTGFP 蛋白質，均可為 4 種抗體辨視。

(1) 1Ab: Mouse anti GFP ； 2Ab:Goat anti mouse (2) 1Ab: Mouse anti His tag ； 2Ab:Goat anti mouse (3) 1Ab: Rabbit anti MT (polycclonal) ；

(4) 1Ab: Mouse anti MT (Monoclonal) 2Ab : Goat anti mouse (1) 1Ab: Mouse anti GFP ； 2Ab:Goat anti mouse

(2) 1Ab: Mouse anti His tag ； 2Ab:Goat anti mouse (3) 1Ab: Rabbit anti

(4) 1Ab: Mouse anti MT (Monoclonal) 2Ab : Goat anti mouse (1) 1Ab: Mouse anti GFP ； 2Ab:Goat anti mouse

(2) 1Ab: Mouse anti His tag ； 2Ab:Goat anti mouse (3) 1Ab: Rabbit anti 2Ab :Goat anti (4) 1Ab: Mouse anti MT (Monoclonal) 2Ab : Goat anti mouse (1) 1Ab: Mouse anti GFP ； 2Ab:Goat anti mouse

(2) 1Ab: Mouse anti His tag ； 2Ab:Goat anti mouse

(3) 1Ab: Rabbit anti 2Ab :Goat anti rabbit (4) 1Ab: Mouse anti MT (Monoclonal) ； 2Ab : Goat anti mouse

43

(1) 1Ab: Mouse anti GFP ； 2Ab:Goat anti mouse (2) 1Ab: Mouse anti His tag ； 2Ab:Goat anti mouse (3) 1Ab: Rabbit anti MT (polycclonal) ；

(4) 1Ab: Mouse anti MT (Monoclonal) 2Ab : Goat anti mouse (1) 1Ab: Mouse anti GFP ； 2Ab:Goat anti mouse

(2) 1Ab: Mouse anti His tag ； 2Ab:Goat anti mouse (3) 1Ab: Rabbit anti

(4) 1Ab: Mouse anti MT (Monoclonal) 2Ab : Goat anti mouse (1) 1Ab: Mouse anti GFP ； 2Ab:Goat anti mouse

(2) 1Ab: Mouse anti His tag ； 2Ab:Goat anti mouse

(3) 1Ab: Rabbit anti 2Ab :Goat anti rabbit (4) 1Ab: Mouse anti MT (Monoclonal) ； 2Ab : Goat anti mouse

圖23 MTGFP Western 的結果

MTGFP 經由電泳後將蛋白質轉印到 PVDF 上，先分別使用一級抗體 rabbit–anti-MT (polyclone)、Mouse–anti-MT (Monoclone)、Mouse-anti–His (Monoclone)、Mouse-anti–

GFP (Monoclone) 進行反應，再使用二級抗體：Goat-anti-mouse IgG-HRP 及

Goat-anti-rabbit IgG-HRP，最後再加入 HRP 的受質在 membrane 上進行呈色。紅色箭頭為MTGFP 蛋白質的位置。

4-5 圓二色光譜儀 (Circlular Dichrorism, CD)測量二級結構變化

利用CD 測量 MTGFP 蛋白質摺疊過程中，分析各個摺疊中間體 M1、

M2、M3、M4 及已摺疊的 M5 進行 far-UV 的 CD 分析其二級結構變化，每一個樣品的濃度為0.2mg/ml。掃描的波段在 190-290nm，M1(unfold state) 到M5(native state)為 R1 到 R5 的摺疊步驟的中間態，然而各階段樣品在掃瞄過程中，若燈壓超過800V 則立即停止測量，因為燈壓過高，除了傷害儀器，其數據也不可採信。將分析所得到之CD 圖譜數據經由 SELCON3 軟體來分析蛋白質二級結構比例，分別為distorted(d)、 regular (r)、 turn (Trn)、

α-helix (H)、β-sheet(S)、α-helix (H(d))、distorted β-sheet (S(d))、random coil (unrd)。MTGFP 此蛋白質具有 GFP 的β-sheet 結構特徵，及 MT 的 random coil 特徵[175]。有研究指出 GFP 的二級結構中，α-helix(H) 20  1 %、β -sheet(S) 52 2 %、β-turn 16  1 %、remainder 13  1 %[176]；而對於 MT 的CD profile 的研究，指出 MT 與螯合金屬後在結構上會有變化，可觀察到波長227 nm (會在附近產生正向波形)、239 nm (會在附近產生負向波形)、

259 nm（會在附近產生正向波形）等的改變[111]，在 PDB 的網站搜尋 MT-2 的結構，發現其具有 8 個β-trun 由 4 個胺基酸組成、1 個γ-trun 由 3 個胺基酸組成[177]。由CD 實驗結果得知 MTGFP 其 GFP 蛋白質在 M1 並沒有完全解開結構，但隨著摺疊接近自然態時，MT 摺疊回自然態(M5)，使得β-sheet 比例下降，而 random coil 比例提升 (圖 24、圖 25 、表 6)。

50 圖24 MTGFP 蛋白質各摺疊中間體的 CD 光譜

圖中將各中間體及最終自然態(Native state)，依照摺疊順序分別命名為 M1~M4(intermediate state)、M5(native state)，並以不同顏色作為區分。

H(r) H(d) S(r) S(d) Trn Unrd

C o nform a tio n percentate (%)

Secondary Structure (%)

190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 -12

[  

MRE(

x10 3 .d eg.cm 2 .d mole -1

)

Zn MTGFP

51 [176]有部分雷同，都是以β-sheet 為主要分佈結構，但是因為 MTGFP 中含有MT 蛋白質，其最主要結構為 randil coil，所以 MTGFP 其 random cil (unrd) 的比例分佈會比GFP 高。下面(圖 26)主要在講述 MTGFP M5 接近 Native

11.41 31.43 20.02 37.14

GFP 20 52 16 13

MT 0 0 52.5 47.5

MTGFP idea

15.7 40.7 24.4 19.3 α-Helix

11.41 31.43 20.02 37.14

GFP 20 52 16 13

MT 0 0 52.5 47.5

MTGFP idea

15.7 40.7 24.4 19.3

圖26 MTGFP M5 與 GFP 與 MT 與 MTGFP 理想值的二級結構比較

4-6動靜態光散射儀(Dynamic Light Scattering,DLS)分析粒子大小

動態光散射儀(DLS)用來分析水溶液中粒子的粒徑大小，因為蛋白質復性的過程，蛋白質結構會從鬆散變為緊密，所以蛋白質若摺疊回自然態，

其蛋白質分子的粒徑也要越來越小。圖為DLS 的 auto correlation function 經由non-negative constrained least square(NNLS)的方法分析得到的結果 (圖 27)。由 DLS 數據的結果可以瞭解 MTGFP 蛋白質在 denature buffer 下是變性而展開的情形，其有效直徑為12.7±0.2nm。而其他摺疊中間體 M1-M4 在 20℃測得有效粒徑大小分別為 12.6±0.2nm、12.4±0.2nm、12.2±0.4nm、11.0

±0.00nm。最後的已摺疊蛋白質 M5 的粒子大小為 9.4±0.1nm。藉由 DLS 的分析可以瞭解MTGFP 透過藉由透析置換 buffer 的方式移除變性劑，然後進行摺疊且其構形上有所變化，使得我們可以觀察到蛋白質顆粒在粒徑上逐步摺疊回自然態。

U M1 M2 M3 M4 M5

10 11 12 13

9.4 +/- 0.1 nm 11.0 +/- 0.0 nm 12.2 +/- 0.4 nm

12.4 +/- 0.2 nm 12.6 +/- 0.2 nm

12.7 +/- 0.2 nm

Diameter (nm)

Folding state

MTGFP

圖27 動態光散射儀分析 MTGFP 蛋白質在各摺疊過程中分子粒徑大小分佈發現隨著摺疊趨近自然態，蛋白質粒子也逐漸變小。

4-7感應耦合電漿原子發射光譜法（ICP – AES）分析蛋白質內金屬含量

MT 蛋白質是一種會螯合金屬的硫蛋白，且一個金屬硫蛋白可以接 7 個二價過渡金屬離子，而TGFP 蛋白質的序列中含有 MT 的序列，所以當蛋白質摺疊回自然態成為有功能的蛋白質時會與金屬結合。在摺疊的過程中，添加金屬離子幫助蛋白質摺疊，所以利用ICP-AES 分析微量金屬元素時，要將透析袋內的蛋白質溶液及透析袋外置換後的緩衝液兩者金屬含量的莫爾濃度相扣後，再與MTGFP 蛋白質的莫爾濃度做比較，看彼此的比例關係，進而推測一個MTGFP 蛋白質內可以與多少的金屬螯合，算出蛋白質的硫鍵與金屬鍵解的比例。實驗所用的MTGFP 蛋白質濃度為 254.77 uM，

將蛋白質濃度比例視為1 時，結果顯示與 6.7 個 Zn 離子結合，因此 MT 具

在文檔中 MTGFP融合蛋白摺疊過程中分子內螢光能量轉移研究 (頁 48-75)