實驗方法

1.指紋圖譜分析方法

(1)萃取方式

將大黃飲片以粉碎機打成粉末，並用20號篩篩過，精秤粉末1 g，

置入25 mL的樣品瓶中，加入70% MeOH水溶液3 mL後，超音波震盪15 分鐘，以離心機於1500 rpm離心5分鐘，取上層液，殘渣再加入的70%

MeOH溶液8 mL超音波震盪15分鐘，重複共三次。將三次的上層液合併，

以70% MeOH定容至25 mL作為檢測液。

(2)分析條件之初篩選

a.移動相的選擇 :

由於中草藥萃取物所含成分相當多，因此開發中草藥的指紋圖譜之 分析方法時，我們建議移動相以梯度方式來發展，比較有利。剛開始分 析檢品時，以梯度變化，從高極性到低極性HPLC移動相，快速跑一遍(有 機相(Acetonitrile)與磷酸水(0.1%)比例，從0%隨著時間遞升至90%，分析 時間為60分鐘，變化速率為1.5 %/min)，得到初步指紋圖譜。初步指紋圖 譜有助於觀察未知檢品其所含之化合物族群的極性分佈狀況。也許大部

分化合物族群分佈高極性區域，也有可能是廣泛的分佈在高、中、低極 性中。了解所含化合物族群之極性分佈情形，並將分析方法最適化。此 外，移動相的酸鹼度也會影響指紋圖譜的結果。

b.檢測波長之選擇

用Photodiode array UV為檢測器，作全波長的掃描，然後再選定適合 的波長，來做為同日及異日精密度之檢測波長。掃描波長: 210、254、280、

500 nm等，其中以254 nm為本實驗之同日及異日精密度之檢測波長。

(2)測定條件

以高效液相層析儀搭配 Photodiode array UV 檢測器或 UV 檢測器，

做為化學指紋圖譜制定之儀器。配置緩衝溶液及移動相，使用 Inertsil ODS-2 column，化學指紋圖譜的波長。將上述檢測液，先以濾紙過濾，

再經 0.45 μm 濾膜過濾，取濾液 20 μL 注入高效液相層析儀中，檢測 其成分。

Table 5 指紋圖譜梯度沖提分析條件 時間

(min)

ACN (%)

0.1 %磷酸鹽 溶液(%)

0 1 99

30 10 90

50 12 88

120 14 86

150 20 80

180 22 78

210 40 60

230 7 30

240 90 10

250 90 10

a.化學指紋圖譜

將已確定基原品種之試品的檢測結果，制定相關參數。

b.指紋圖譜雷達圖之製作

將大黃藥材五批，以HPLC檢測分析得其UV吸收層析峰圖譜，標記 編號各層析峰時間，計算藥材各層析峰積分面積，並求得平均值及S.D.

值。外圍圓座標為HPLC圖譜中各層析峰編號，相對於層析峰編號之積分 面積為該座標軸數值，製成之大黃藥材指紋圖譜雷達圖。

2.大黃萃取液中成分及家兔血漿檢品中之 HPLC 定量方法

A.HPLC 分析條件 層析管(Column)

Merck LiChrospher 100 RP-18e column(250 mm x 4 mm) endcapped, (5 μm) 保護管柱

(Pre-column) Merck Lichrospher l00 RP-18 endcapped, (5 μm) 檢測波長 UV 254 nm

流速 1.0 mL/min

移動相 MeOH : 0.2%磷酸水 = 75 : 25 (用磷酸調 pH=2.8) 注入量 100 μL

分析時間 35 min

內標 1,8-dihydroxyanthraquinone

B.血漿檢品之前處理:

精確量取血漿檢品 140 μL 置入試管中，加入之內標準品

(1,8-dihydroxyanthraquinone) 20 μL、及 Emodin、Chrysophanol、Rhein 之 標準液各 20 μL 和乙腈 600 μL，以試管震盪器振盪 20 秒充分混合使血漿 蛋自沉澱。以離心機於 3500 rpm 離心 20 分鐘。吸取上清液 600 μL 置於 試管中，以氮氣噴吹至乾，以甲醇 200 μL 溶解，接著以 HPLC 分析。

C.檢量線之製作 :

精確量取血漿檢品 140 μL 置入試管中，加入之內標準品

(1,8-dihydroxyanthraquinone) 20 μL、及 Emodin、Chrysophanol、Rhein 之 標準液各 20 μL 和乙腈 600 μL，以試管震盪器振盪 20 秒充分混合使血漿 蛋自沉澱。以離心機於 3500 rpm 離心 20 分鐘。吸取上清液 600 μL 置於 試管中，以氮氣噴吹至乾，以甲醇 200 μL 溶解，接著以 HPLC 分析。由 圖譜所得之 Emodin、Chrysophanol、Rhein 與 1,8-dihydroanthraquinone 波峰之面積比與理論濃度作線性回歸以製作檢量線。

Table 6 大黃酚、大黃素、大黃酸標準濃度血漿檢品溶液之製備

標準溶液濃度 (μg/mL) (取 20 μL) 空白血漿體積 濃度 (μg/mL)

CHRYSOPHANOL EMODIN RHEIN (μL) CHRYSOPHANOL EMODIN RHEIN

100 125 62.5 140 10 12.5 6.25

50 62.5 50 140 5 6.25 5

25 31.25 25 140 2.5 3.125 2.5

12.5 15.625 12.5 140 1.25 1.563 1.25

6.25 7.813 6.25 140 0.625 0.781 0.625

3.125 3.906 3.125 140 0.313 0.391 0.313

1.563 1.953 1.563 140 0.156 0.195 0.156

0.781 0.977 0.781 140 0.078 0.098 0.078

D.回收率實驗

目的在比較添加 Emodin、Chrysophanol、Rhein 於空白血漿和空白 溶液(Methanol)中，經血漿檢品之前處理後檢出量的差異。實驗步驟如同

檢量線之製作中對檢品之處理過程。 之 Chrysophanol 或 Rhein 標準液及 62.5、15.625、3.906 μg/mL 之 Emodin 標準液各 20 μL ，加入 140 μL 之空白血漿中，震盪 1 分鐘混合均勻，即 得 Chrysophanol 或 Rhein 濃度為 5、1.25、0.133 μg/mL，及 Emodin 濃度 為 6.25、1.563、0.391 μg/mL 之血漿檢品(n=3)，計算各個校正濃度之平 均值(Mean)、標準偏差(S.D.)、變異係數(C.V.)。

2.間日內(INTERDAY)試驗:

若於不同天以同日內(INTRADAY)試驗方法操作可得到間日內 (INTERDAY)的精確性比較。

F.靈敏度試驗:

最 低 偵 測 極 限 試 驗 (Limit of Detection, LOD) ， 是 連 續 稀 釋 Chrysophanol 或 Rhein 至 3 種低濃度 39.063、19.531、9.766 ng/mL，連續 稀釋 Emodin 至 3 種低濃度 48.828、24.414、12.207 ng/mL，以 HPLC 分 析求得 3 組波峰高度數據與對照的 3 種低濃度做線性回歸，可得各組回 歸方程式截距之標準偏差(σ)和總回歸方程式之斜率(S)，依 ICH 計算求得 最低偵測極限(LOD=3.3 x σ/s)與最低準確測量濃度(Limit of Quantitation, LOQ=10 x σ/s)，最後再將計算求得的 LOQ 依檢量線之製作，採標準血 漿檢品製備方法分析之。

G.安定性試驗

(1) Emodin、Chrysophanol、Rhein 在家兔血漿中於-30℃下之安定性試 驗:

取濃度為 50、12.5、1.325 μg/mL 之 Chrysophanol 或 Rhein 標準液及 62.5、15.625、3.906 μg/mL 之 Emodin 標準液 20 μL，加入 140 μL 之空 白血漿中，震盪 1 分鐘混合均勻，即得 Chrysophanol 或 Rhein 濃度為 5、

1.25、0.133 μg/mL，Emodin 濃度為 6.25、1.563、0.391 μg/mL 之血漿檢 品，將之分裝後置於-30℃的冷凍櫃中，於第 0, 1, 3, 6, 10, 15, 21 天分別 取出 1 組檢品(n=3)。解凍後，依血漿檢品之前處理方法處理後，以 HPLC

分析，觀察 Emodin、Chrysophanol、Rhein 之濃度變化情形。

(2) Emodin、Chrysophanol、Rhein 在家兔血漿中於-25℃下之安定性試 驗:

取濃度為 50、12.5、1.325 μg/mL 之 Chrysophanol 或 Rhein 標準液及 62.5、15.625、3.906 μg/mL 之 Emodin 標準液 20 μL，加入 140 μL 之空白 血漿中，震盪 1 分鐘混合均勻，即得 Chrysophanol 或 Rhein 濃度為 5、

1.25、0.133 μg/mL，Emodin 濃度為 6.25、1.563、0.391 μg/mL 之血漿檢 品，將之分裝後置於室溫 25℃下，於第 0, 1, 3, 6, 12, 24, 48 小時，分別 取出 1 組檢品(n=3)。解凍後，依血漿檢品之前處理方法處理後，以 HPLC 分析，觀察 Emodin、Chrysophanol、Rhein 之濃度變化情形。

3.大黃萃取液中成分在家兔體內之藥物動力學實驗

A.實驗設計

取雄性家兔六隻，體重介於 2.0 至 3.0 公斤之間，每隻家兔以大黃 萃取液靜脈注射及口服投藥。實驗家兔之重量、給藥順序及劑量標示於 Table 7，每次給藥後至下次給藥，時間須相隔一週以上。

Table 7 實驗家兔之體重

家兔之口張開後，以胃管插入給藥。採血點為給藥後之 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120, 150, 180, 240, 300, 360, 420, 480 分鐘。

血漿中成份定量法依前述血漿檢品之前處理步驟分析定量之。

C.數據處理及統計方法

各種給藥法所取得之血漿檢品經 HPLC 法定量後，依標準曲線成分-內標之波峰/面積比換算大黃萃取液指標成分，大黃酸(Rhein)、大黃素 (Emodin) 、 大 黃 酚 (Chrysophanol) 之 血 中 濃 度 數 據 後 ， 利 用 電 腦 程 式 WINNOLIN 以非室模式及二室模式處理配適後來計算相關之藥物動力 學參數。