靜脈注射及口服大黃萃取液後大黃成分大黃素、大黃酸、大黃酚於家兔之藥物動力學研究; Pharmacokinetics Studies of Emodin, Rhein and Chrysophanol in rabbits After Intravenous and Oral
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(2) 可分的關係，故中藥藥物動力學對中藥走向現代化及推廣具有極為重要 的意義。 大黃為蓼科植物掌葉大黃、藥用大黃或唐古特大黃的根莖。主產於 四川，別名將軍、錦紋、川軍。性寒、味苦。具有攻積導滯(1)、瀉火涼 血(2)、活血祛瘀(3)、利膽退黃等功效(4)。該品的根莖中，有多種生物活性 成分，其無機成分中至少存在25種元素；有機成分中，含有大黃酸、大 黃素、蘆薈大黃素、大黃素甲醚和大黃酚等(5-12)。其藥理作用具瀉下(13-19)、 止血(20-27)、抗腫瘤(28-32)、利尿(33-38)、保肝利膽(39-48)、降低膽固醇(49-52)、免 疫抑制(53-56)、抗菌(57-61)等。臨床亦運用於胃腸實熱所致急、慢性或習慣 性便秘、實火上炎所致吐血、衄血以及目赤腫痛、口舌生瘡、產後腹痛、 血瘀經閉以及跌打損傷等證症(62-64)。本研究是以大黃萃取液在家兔體內 進行靜脈及口服給藥後的藥物動力學研究。觀察大黃之三種成分大黃素 (Emodin)、大黃酸(Rhein)及大黃酚(Chrysophanol)在家兔體內的動態及吸 收等評估。. 2. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com.
(3) 第二章 總論. 第一節 大黃藥材的簡介. 大黃為植物蓼科掌葉大黃 Rheum palmatum LINN.的根和根莖。主要產 於四川、甘肅、青海、西藏、寧夏、陝西、湖北、雲南、貴州等地。於 冬初選 3 年以上的植株，挖取地下部分，除去粗皮，切片，曬乾或烘乾， 生用；或酒製，蒸熟，炒黑用。 【生長習性】大黃性喜冷涼氣候，耐寒，忌高溫。野生於中國大陸西北 及西南海拔 2000 公尺左右的高山區；家栽在 1400 公尺以上的地區。. 【本草記載】大黃始著錄於神農本草經草部下品，其後歷代諸家本草如 名醫別錄、神農本草經集注、新修本草、本草拾遺、嘉祐補注神農本草、 圖經、藥性論、日華子本草、圖經本草、本草衍義、本草綱目、神農本 草經會通，本草備要等均有收載(65)。. 3. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com.
(4) 【藥名考訂】大黃(神農本草經)：似指根莖大而黃色者品質為良。將軍(名 醫別錄)：陶隱居云：「將軍之號當取其駿快矣。」李杲曰： 「推陳致新， 如戡定禍亂，以致太平，所以有將軍之號」 ，以上均指瀉下之藥效駿快之 意。黃良(名醫別錄)：根莖黃者良，似指品質。火參(吳普本草)：治實熱 (火)性疾患之藥效最佳如參之高貴。膚如(吳普本草)：似有護膚如意之 意，似指皮膚病良藥(69)。. 【化學成分】主要為苷及苷元類，苷的瀉下作用常強於其相應苷元。苷 元主要是蒽醌衍生物，包括大黃酚(Chrysophanol)、大黃素(Emodin)、蘆 薈大黃素(Aloe-Emodin)、大黃酸(Rhein)和大黃素甲醚(Physcion Parietin、 Rheochrysidin)。此 5 種苷元存在於大黃根的形成層附近及射線中，一小 部分呈游離狀態，存在於嫩根的木質部分，大部分與葡萄糖結合成苷， 貯存於根的較老部分。大黃的致瀉效力與其中的結合性大黃酸含量成正 比，游離的蒽醌類成分無致瀉作用(5-12,64)。 成份分類如下: (一) Anthraquinone (游離型 Anthraquinone、結合型 Anthraquinone) (二) Dianthraquinone (游離型 Dianthraquinone、結合型 Dianthraquinone) (三) Phenylbutanone (四) Tannin (五) 無機物 (六) 其他 有機物。. 4. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com.
(5) (一)Anthraquinone: 1.游離型 Anthraquinone (ex. Aloe-Emodin, Chrysaron, Chrysophanol, Emodin, Isoemodin, Laccaic acid D, Physion, Rhein) 2.結合型 Anthraquinone (ex. Rhein-8-O-β-D-glucoside, Physcion monoglucoside, Aloe-Emodin monoglucoside, Emodin monoglucoside, Chrysophanol monoglucoside, Rheinoside A. B. C. D., Aloe-8- glucoside, Aloe-Emodin-ω-8- glucoside, Chrysophanol-8- glucoside, Physcion-8glucoside, Physcion-8-O-β-D-gentiobioside). (二)Dianthraquinone 1.游離型 Dianthraquinone (ex. Rheidin A. B. C., Palmidin A. B. C.) 2.結合型 Dianthraquinone (ex. Sennoside A. B. C. D. E.). (三)Phenylbutanone (ex. Lindleyin, Isolindleyin). (四)Tannin (ex. (+)-Catechin, (-)-Epicatiechin, Epicatiechin, Gallic acid, 3-O-galloyl-(-) epicatiechin, 1,6-Digalloyl-2-cinnzmoyl-glucose, 2-Cinnamoglucose . Glucogallin, 1,2,6-Tri-O-galloyl-glucose, α’-O-Cinnamoyl glucogallin, 4-O-methyl gallic acid, 3-O-Galloyl procyanidin B-1, 3,3´-di-O-Galloyl cyaniding B-2, Rfhatannin I . II). 5. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com.
(6) (五)無機物 (ex. 含總灰分 14.3〜17.5% ，其中 SiO2 1.2〜1.7%、Al2O3 1.7 〜1.9%、K2O 12.9〜17.9%、Na2O 6.4〜9.9%、FeO33.8〜77%、CaO 42.6 〜52%、Mg 1.7〜1.9%、SO4 6.9〜8.4%、P2O54.8〜5.7%、Cl 1.9〜2.8%。). (六)其他有機物(ex. 常量元素和微量素: K, Ca, Ti, Cr, Mn, Fe, Cu, Zn, Sr, Rb, Ni, Co, Pb, Al, La, Mg, Pt, Hg, Ge, Si, S...etc.) 【藥性】苦、寒。歸脾、胃、大腸、肝、膽經(39-48)。. 【藥效】敗毒抗癌(28-32)、瀉熱導積(13-19)、消腫逐淤(3)。. 6. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com.
(7) 【腸內菌轉化】. 7. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com.
(8) 【藥理】 Table 1 (28-32). 抑制癌細胞. 大黃素和大黃酸對小鼠黑色素瘤、淋巴肉瘤、乳腺癌及艾氏腹 水癌均有明顯的抑制作用。. 導致排便(1,13-19) 蒽醌苷能刺激大腸導致排便，另含鞣質具收斂作用，故在產生 瀉下作用後可出現續發生便秘。 使血壓下降(66) 止血(20-27) (49-52). 降低膽固醇. 促進膽汁分泌. 浸劑、酊劑給麻醉兔靜脈注射，可使血壓下降；酊劑並可使離 體兔耳血管擴張。 大黃酚給小鼠口服或皮下注射，可縮短血液凝固時間。 浸液口服有降低血清高膽固醇的作用。 口服大黃蒽醌類，可促進膽汁分泌，有利膽、排石作用。. (39-48). 增強消化(67) (33-38). 促進胰消化液的分泌。. 利尿. 大黃酸、大黃素均有利尿作用，大黃酸作用較強。. 抗菌(57-61). 大黃的抑菌成分已發表於文獻中的有蘆薈大黃素、大黃酸、大 黃素、大黃酚及大黃素甲醚。其中以大黃酸、大黃素、蘆薈大 黃素作用最好。在培養基中對金黃色葡萄球菌、核酸及蛋白質 的合成具有明顯的抑制作用；對肺炎雙球菌、鏈球菌、白喉桿 菌、枯草桿菌、炭疽桿菌、痢疾桿菌、傷寒桿菌、綠膿桿菌、 霍亂弧菌及多種常見的致病性真菌均有較強的抗菌作用。. 大黃素的生理活性決定它不僅可用於醫療，也可用於保健和日用化 工品中，如有人把它用於護髮(68)和護膚品(69-70)中。 【貯藏法】本品應置於密蓋阻光容器內貯之。 【用途分類】瀉藥。 【劑量】常用劑量 0.2〜1 g。(71). 8. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com.
(9) 第二節 大黃的藥理研究. 1.大黃瀉下作用機制 趙燕玲等人(72) 為探討大黃瀉下作用與腸道5-HT及其受體的關係,將 成年SD(Sprague-Dawley, SD品系)大鼠20隻分為灌服大黃組(A組10隻，每 天灌服2次水煎劑，每次3 mL，連續9天)和對照組(B組10隻，每天灌服2 次蒸餾水，每次3 mL，連續9天)。採用免疫組化和醫學圖像分析系統相 結合的方法，測定各組大鼠十二指腸5-HT細胞的數目、面積、平均灰度、 細胞內5-HT含量及5-HT受體的含量。結果發現A組大鼠十二指腸5-HT細 胞的數目為108.80±5.26、面積為30.18±21.8μm2 、5-HT含量為0.3409± 0.0308AU、5-HT受體含量為0.3188±0.0312AU均高於B組(P <0.01)，平均 灰度為123.38±3.94較B組降低(P <0.01)。結果証明大黃的瀉下作用可能與 腸道5-HT及其受體含量的增高有密切關係。 魏鳳玲等人(73)採用炭末法和記錄小鼠用藥後的瀉下次數，研究大黃 中結合蒽醌對小鼠的促進腸蠕動和致瀉作用，探討其治療參考劑量和量效、時-效關係,並測定主要藥動學參數。結果表明,結合蒽醌有明顯的促 進腸蠕動和致瀉作用,促進腸蠕動半效劑量為 18.22-25.79mg/kg,致瀉作用. 9. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com.
(10) 的治療參考劑量為 150.48-224.45mg/kg,在一定劑量範圍內量-效、時-效呈 直線性相關,體內半衰期為 5.10 小時。 周才ㄧ(74)等人應用 Gordon-Chadwick(1979)體內環封法研究了大黃 懸浮液對動物腸道內水份和電解質的移行速度。給予小鼠含炭末之大黃 懸浮液 0.5 g/kg，於 30 min 後解剖，測量每隻動物消化道中炭末所推進 的距離。20 隻小鼠經大黃懸浮液給藥後，腸道內容物增均推進率為 83.2 ±6.1 %，對照動物 20 隻，其平均推進率為 67.1±12.2 %，兩者有十分明顯 區別(P＜0.001)。表明大黃能明顯加強小鼠消化道的推進性運動。對腸道 內容物排出時同的影響實驗，採用大黃懸浮液 0.5 g/kg 給藥後，22 隻小 鼠腸道內容物增均排出時間為 139±61 min，而對照組 5 小時還未見排出， 兩組有十分顯著差別(P＜0.001)。同時親察到，給藥動物均有水樣糞便。 表明大黃能促進胃腸道的推進速度，產生明顯的瀉下效應。對腸道水份 和電解質(Na+、K+)移動速度的影響表明，在盲腸中灌以 2 %大黃懸浮液 的大鼠，其水份和 Na+的淨分泌增均值分別為-21.7±12.9 μL/(min．g)和 -7.9±0.8 μg 當量/(min．g);與對照組的 3.6±1.9 μL/(min．g)和 3.3±0.8 μg 當量/(min．g)比較。P＜0.001。而鉀離子的淨吸收增均值兩組比較無顯 著性差異。表明大黃懸浮液對腸道內水份和鈉離子的吸收，即促進水份 和納離子向腸道內迅速移進。實驗結果初步證實，大黃的瀉下作用與大. 10. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com.
(11) 腸內水份和鈉離子分泌直接有關;大黃懸浮液能明顯增強水份和 Na+向腸 道內移行的速度，由此可見，大黃瀉下作用是由腸道粘膜向腸管內分泌 水份所致。. 2.大黃的不同製備法對瀉下作用的影響. 武新安等人(75)從藥劑學的角度出發闡明大黃作為瀉下劑大腸靶向給 藥(targeting drug system.TDS or Targeted Drug Delivery System.TDDS)的 觀點。方法根據近 60 年國內外藥理學、藥劑學及臨床實驗研究，論述了 結合蒽醌、特別是游離蒽醌對大腸蠕動和轉運時間的影響和它們的吸收 特點,以及大黃提取、濃縮、乾燥過程中成分的損失情況。結果及結論指 出大黃提取物中的游離蒽醌應視為有效瀉下成分;不僅應注意大黃提 取、濃縮、乾燥過程中游離蒽醌的損失，更應注意游離蒽醌在上消化道 轉運過程中的損失；大腸靶向給藥可阻止游離蒽醌在上消化道的吸收,將 有利於提高療效和降低用量。 3.膽汁分泌促進作用 高博等人(76)給大鼠十二指腸灌注苦黃口服製劑 4,5, 9.0 g/kg 後，肝臟 分泌膽汁和膽紅素量均較給藥前明顯增加(P<0.05, P<0.01)，持續時間約. 11. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com.
(12) 為 1-2 小時。結果表示苦黃口服製劑(苦參、大黃、茵陳、柴胡、大青葉 等)有一定的利膽及促進單位時間內肝膽紅素排出的作用。 孫霞等人(77)研究大黃主要成分之一“大黃鞣質”在大黃減體重生理機 制中的作用。方法為口服去鞣質大黃水浸煎劑和腹腔、靜脈給予沒食子 酸(Gallic acid)，觀察對大鼠體重、攝食量、胃排空速度以及胰酶、肝膽 汁分泌量的影響。結果顯示去鞣質大黃可使肝膽汁分泌量增加(P<0.05), 但對大鼠胰酶分泌量沒有作用(與對照組相比 P>0.05)。Gallic acid 以腹腔 及靜脈給藥均引起大鼠胰脢分泌量降低(與對照組相比 P<0.01)，但肝膽 汁分泌量與對照組相比沒有變化(P>0.05)。結論為減體重作用與胃的排空 抑制、胰脢分泌減少和肝膽汁分泌增加同時相關。. 4.利尿作用 鄭豐等人(78)在體內和體外實驗中系統地觀察了中藥大黃對大鼠近端 腎小管和髓袢升支粗段小管(遠曲小管)Na+-K-ATP酶均具有顯著抑制作 用，尤其是對髓袢升支粗段作用更為明顯。大黃的作用隨劑量增大而增 強，50 mg/L大黃對髓袢升支粗段Na+-K+-ATP酶活性的抑制率達42.9 %體 內應用大黃後，出現利鈉及利尿效應。. 5.降低血中膽固醇的作用. 12. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com.
(13) 邵淑麗等人(79)觀察大黃減肥湯對肥胖伴高脂血症男性患者的治療作 用。結果大黃減肥湯（含大黃、姜黃、柴胡、生薑、大棗、枸杞子）有 效降低肥胖伴高脂血症男性患者的體重、肥胖度、體重指數、血清總膽 固醇和三酸甘油酯水平，與實驗前相比差異顯著(P<0.05，P<0.01)，表明 大黃減肥湯可促進脂肪動員和利用，調節脂代謝。. 6.降血清尿素氮作用 唐蕙蘭等人(80)觀察炮制大黃制劑對慢性腎功能衰竭大鼠治療作用。 方法為以 WISTAR 大鼠隨機分為三組。對照組、模型組(model bank)、炮 制大黃組(醋製後，經乙醇提取)治療大、中、小劑量３組。灌胃。觀察血 尿素氮、肌酐、尿酸變化。結果表示血清尿素氮、肌酐、尿酸有明顯下 降，說明該製劑可明提高內生肌酐清除率。. 7.抗菌作用 黃曉敏等人(81)檢測大黃體外抗菌活性。方法採用無芽胞厭氧菌藥敏 實驗的肉湯微量稀釋法。結果為大黃對脆弱類桿菌、多形擬桿菌的抗菌 活性最強，MIC(最小抑菌濃度)值為 0.3125-2.5mg/ml，MBC(最小殺菌濃 度)值為 1.25-10mg/ml。對產黑素普雷沃氏菌的抗菌活性較強，MIC 值為. 13. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com.
(14) 0.625-5mg/ml，MBC 值為 5-10 mg/ml，對其他的無芽胞厭氧菌也具一定 的抗菌活性。. 14. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com.
(15) 第三節 大黃的毒理研究. 唐小江等人(82)以山大黃粉劑對小鼠經口服給予結果LD50大於5000 mg/ kg，水煎劑對小鼠經口服給予結果LD50大於10000 mg/kg，對大鼠經 口服給予結果LD50大於6000 mg/ kg 體重。給藥後5〜8 h出現輕度腹瀉症 狀，持續1天。山大黃多糖(Rheum Rhaponticum Polysaccharide，RRP)對 小鼠經口LD50 大於5000 mg/kg；小鼠微核子試驗、精子畸形試驗、染色 體畸變試驗均未見致突變性,也無生殖細胞誘變性,因此，RRP是比較安全 的。山大黃多糖具有一定的抗突變作用,對環磷醯胺致小鼠體細胞微核、 精子畸形和染色體畸變均有抑製作用,抑制率分別為49.5 %、28.4 %、32.1 %。 赫梅生等人(83)應用動物急性死亡率法估測了大黃的藥物動力學，大 黃按中藥傳統煎劑，減壓濃縮至所需濃度，小鼠腹腔注射給藥，測得 LD50(ip)為 16.3±1.2 g．kg-1，LD50(po)為 178.7±46.4 g．kg-1。於測定 LD50 中發現死亡性別差異並不顯著，說明雌雄小鼠對大黃的毒性成分的敏感 性相近。 梁資富等人應用毒理效應法研究了河套大黃(Rheum hotaoense Cheng et kao)的藥物動力學(84)，小鼠灌胃大黃乾膏，測得口服 LD50 為 8.04. 15. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com.
(16) g．kg-1。用小鼠斷尾法測定止血時間，ED50 為 0.24g．kg-1，ED85 為 0.74 g． kg-1。. 16. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com.
(17) 第四節 大黃成分的理化特性. 1.大黃素 Emodin 的理化特性 A.化學名 1,3,8-trihydroxy-6-methylanthraquinone B.結構式 OH. C.分子式及分子量. O. OH. OH. H33C CH. C15H10O5 Molecular Weight = 270.23. O. D.物理、化學性質 橙黃色或土黃色結晶或粉末。(乙醇或 12 mm 下减壓昇華)，熔點 256 〜257℃。最大吸收波長為 222、252、265、289 及 437 nm。本品溶於乙 醇，略溶於乙醚，氯仿，不溶於水，溶於苛性鹼水溶液，碳酸鈉水溶液 或氨溶液中顯櫻紅色(85)。. 17. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com.
(18) E.藥理作用 具抗腫瘤活性、抗微生物生長作用、免疫抑制作用、解痙、止咳作 用、利尿作用及瀉下作用，小劑量時對離體蟾蜍心臟有興奮作用，大劑 量時則為抑制作用。抑制 5-脂氧酶(5-Lipooxygenase)，抑制人型多核白細 胞 LTB4 和全血中 LTB4 的合成(86-88)。. 2.大黃酸 Rhein 的理化特性 A.化學名 1,8-dihydroxyanthraquinone-3-carboxylic acid B.結構式 OH. OH. O. COOH. C.分子式及分子量 O. C15H8O6 Molecular Weight = 284.21 D.物理、化學性質 昇華呈黃色粉末，熔點 321〜322°C。吸收波長為 229、258 及 435 nm。 幾乎不溶於水，可溶於鹼、吡啶；微溶於乙醇、苯、氯仿、乙醚及石油. 18. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com.
(19) 醚。外型為紅色的鉀鹽或粉紅色的鈉鹽，和Ca(OH)2及Ba(OH)2也可形成 紅色的鹽類(85)。. E.藥理作用 導瀉利尿作用、抗菌、抑菌作用、抗癌作用(86,89)。 3.大黃酚 Chrysophanol 的理化特性 A.化學名 1,8-dihydroxy-3-methylanthraquinone B.結構式. OH. OH. O. CH3. CH3. C.分子式及分子量 O. C15H10O4 Molecular Weight =254.23 D.物理、化學性質 於乙醇或苯中形成六角形或單斜晶體，熔點為196℃。最高吸收波長 為226、256、278、288及436 nm。幾乎不溶於水，微溶於沸騰的乙醇， 可溶於苯、氯仿、乙醚、冰醋酸、丙酮、氫化鹼(alkali hydrides)溶液， 及熱的碳酸鹼(alkali carbonates)溶液；極微溶於石油醚(85)。. 19. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com.
(20) E.藥理作用 具抗菌活性；縮短血液凝固時間、興奮神經、麻痺肌肉；並具止咳、 利尿和抗癌作用(87,89)。. 20. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com.
(21) 第五節中藥指紋圖譜. 1.中藥指紋圖譜的定義和特性 中藥指紋圖譜係指中藥原料藥材、飲片、半成品、成品等經適當處理後，採 用一定的分析方法，得到能夠標示其特性的共有峰之圖譜。中藥指紋圖譜是一種 綜合的、可量化的化學(不包括生物學)鑑定手段。藉以鑑別真偽、評價原料藥材、 半成品和成品品質均一性和穩定性。其基本特性是整體性和模糊性。它不同於常 規意義的指紋分析含義，並不具有個體特異性，而更多強調的是作為主要以植物 來源中藥的共有特徵性。 從巨集觀和整體性能看，中藥指紋圖譜可準確、量化地對中藥進行真偽鑑別 和品質評價。從微觀和細節上看，由於藥材有產地、採集時間和加工方法等因素 的限制，很難給出一個對所有中藥都適用的共有峰和非共有峰的比例，更不能如 西藥來要求一一對應，所以中藥指紋圖譜又是模糊的。. 2.中藥指紋圖譜的分類 化學指紋圖譜按所採用的實驗方法為：(1) 色譜法，其中最引人注目的當屬裂 解氣相色譜和三維高效液相色譜。另外，高效毛細管電泳技術、以超臨界流體萃 取為前處理的氣相色譜-質譜聯用技術，也大大豐富了中藥指紋圖譜構建的內涵。 (2) 光譜法，包括紫外光譜和紅外光譜。但其鑑別專屬性差，分辨率低，需借助計. 21. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com.
(22) 算機模式識別技術或模糊數學方法進行處理。(3) X 射線繞射法。(4) DNA (去氧核 糖核酸) 指紋圖譜(90-91)分子生物學技術，特別是隨機擴增多態 DNA (RAPD) 標 記，可以在特異 DNA 序列尚不清楚的情況下，檢測 DNA 的多態性，這是構建中 藥指紋圖譜的新技術，具有極好的應用前景(92)。. 3.中藥指紋圖譜的獲得 樣品採集：固定品種、藥用部位、產地、採收期和加工方法的 10 批以上藥材， 以及足夠數量的及處方組成和用量固定、生產工藝穩定的中間體或成品 。 方法研究：光譜和色譜學方法。 標準圖譜(共有圖譜模式)確定：用相似性軟體計算得到。 資訊獲取和處理：用電腦儀器的強大功能對未知樣品進行相似性評價。 相關性的考察：對中間體和成品之間成分相關性進行比較要求嚴格，主要有 光(波)譜、色譜技術。 應選用儀器設備易得，且便於操作的方法。 光譜(UV、IR)和波譜(NMR、MS)指紋圖譜由於靈敏度和選擇性的限制，所以 不能表達中藥這樣混合體系中各種不同化學成分濃度分佈的整體狀況。 色譜指紋圖譜為首選方法，如 TLCS(薄層色譜掃描法)(93)、GC(氣相層析儀 法)(94-96)、HPLC(高效液相層析法)(97-98)和 HPCE(高效液相毛細管電泳法)。 基本要求：色譜指紋圖譜必須有良好的專屬性、重現性和可行性。. 22. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com.
(23) 而採用中藥指紋圖譜的方式，則能有效表明中藥的品質，相當於為 中藥製品貼上了“化學條碼”。使中藥有了自己獨有的品質控制標準。. 建立指紋圖譜時，首先要選定具有代表性的樣品，粗加工後採用適 當的溶劑把其中的有效成份提取出來，然後再把提純後的中藥樣品放入 分析儀器的檢測器中，經過一到兩個小時的分析，電腦就可以根據樣品 中所含的不同的化合物繪製出峰值各異的圖譜來。這個圖譜就是該種藥 材標準的指紋圖譜。. 在檢驗成品中藥材或中成藥的品質時，可以將被檢驗的藥品放入分 析儀器的檢測器中，觀察它所顯示的圖譜同這一種藥材的標準指紋圖譜 有無大的區別，從而判斷藥品的品質。. 中藥指紋圖譜的建立為中藥品質控制提供了管制標準。. 23. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com.
(24) 第六節 大黃成分之 HPLC 定量法文獻整理 中藥材及其製劑中所含的大黃酸、大黃素及大黃酚定量方法，有用 薄層層析法(Thin Layer Chromatography)及分光光度法，和近年的高效液 相層析法(High Performance Liquid Chromatography)，其中高效液相層析 法，因所需檢品少，準確性高，是目前測定藥品含量常用的方法。. 為了進行大黃酸、大黃素及大黃酚在家兔體內藥物動力學以及生體 可用率研究，本研究將探討一種靈敏度高且具專一可行性，適合大黃酸 (Table 2)、大黃素(Table 3)及大黃酚(Table 4)在血漿檢品中濃度之 HPLC 方法。曾經有人發表過整理如下：. 24. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com.
(25) Table 2 Rhein 之 HPLC 定量法文獻整理 檢測波長. 流速. (nm). (mL/min). 含 0.1%高氯酸的 80%甲醇溶液. 254. 0.5. PERKIN ELMER HS5HC 甲醇－水 (75:25) ODS(50 mm x 3.9 mm). 254. 0.8. 254. 1.2. 254. 1.0. 作者. 層析管柱. 移動相(v/v). 羅文毓等(99). Nucleosil ODS(5μm). 趙陸華等(100). 王玉玨等(101). YMC-PachA-312 ODS(150 mm x 3.9 mm). 甲醇－水－冰乙酸. 陳玉祥等(102). Zorbox ODS (4.6 mm x 250 mm). 甲醇－水. 袁海龍等(103). C8. 范國榮等(104). YWG-ODS10μm (200 mm x 4.0 mm ID). 封士蘭等(105). Kromasal ODS. (90:25:5). (80:20) 甲醇－0.2%磷酸 (80:20) 甲醇-水-高氯酸 (75:25:0.1 v/v) 甲醇－0.1%磷酸 (265:35). 25. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com. 437. 254. 1.0. 254. 1.1.
(26) Table 3 Emodin 之 HPLC 定量法文獻整理 檢測波長. 流速. (nm). (mL/min). 含 0.1%高氯酸的 80%甲醇溶液. 254. 0.5. 趙陸華等. PERKIN ELMER HS-5HC ODS (50 mm x 3.9 mm). 甲醇－水(75:25). 254. 0.8. 陳玉祥等(102). Zorbox ODS (4.6 mm x 250 mm). 甲醇－水(80:20). 254. 1.0. 王藍霞等(106). C18. 254. 1.0. 280. 0.9. 437. 1.0. 483. 1.0. 286. 1.0. 254. 1.1. 254. 0.6. 作者. 層析管柱. 移動相(v/v). 羅文毓等(99). Nucleosil ODS(5 μm). (100). (107). 梁建文. Merck 589830 LiChrospHer 100 RP-18 (250 mm x 4 mm). 甲醇－0.1%高氯酸 (9:1) 乙腈－2%乙酸 (73:27) 甲醇－0.2%磷酸. 袁海龍等(103). C8. 周蘭等(108). Shim-pack CLC-ODS (NO.61514957B). 甲醇－0.4%磷酸. 蔡曉霞等(109). Shimdze CLC ODS (150 mmｘ4.6 mm). 甲醇－水－磷酸. 封士蘭等(105). Kromasal ODS. 姚仲青(110). C18. (80:20). (85:15). (80:20:0.5) 甲醇－0.1%磷酸 (265:35) 乙醇－0.1%磷酸 (90:10). 26. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com.
(27) Table 4 Chrysophanol 之 HPLC 定量法文獻整理. 作者. 層析管柱. 移動相. 羅文毓等. Nucleosil ODS (5 μm). 含 0.1%高氯酸的 80%甲醇溶液. PERKIN ELMER HS-5HCODS. 甲醇－水. (99). 趙陸華等 (100). (50 mm x 3.9 mm). 陳玉祥等. Zorbox ODS (4.6 mm x 250 mm). (102). 王藍霞等. C18. (75:25). 甲醇－水 (80:20). 甲醇－0.1%高氯酸. (106). (9:1). 周寶寬等. 含 0.1%高氯酸的 80%甲醇溶液－水. C18-ODS. (111). 姚仲青等. 檢測波長. 流速. (nm). (mL/min). 254. 0.5. 254. 0.8. 254. 1.0. 254. 1.0. 254. 1.0. 254. 0.6. (80:20). C18. 乙醇－0.1%磷酸 (90:10). (110). 27. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com.
(28) 第七節 大黃成分之藥物動力學相關研究. 過去大黃成分之藥物動力學研究多數採個別成分的給藥來探討，今 分別條述如下:. 1.大黃素的藥物動力學研究: 依梁建文等人(107)實驗，經靜脈注射及口服方法給予家兔大黃素(10 mg/kg)，其靜脈注射之血中濃度表現呈現二室模式，AUC為518 μg ． min/mL，Cl為72.3 mL/min，t1/2為155 min。口服給藥後之血中濃度顯示 吸收極差。龐志功等人(112)發現，以1 g/kg大黃原藥的劑量，經水煎劑給 家兔灌胃，於體內呈現二室模式，AUC為26.40 μg ． h/mL，Cl為0.06 µg/mL，t1/2為47.62 hr。另據賴錦益等人(113)研究，經靜脈注射及口服方法 給予家兔大黃素(5 mg/kg)，其靜脈注射之血中濃度呈現二室模式，t1/2為 57 min。. 2.大黃酚的藥物動力學研究: 龐志功等人(112)發現，以1 g/kg大黃原藥的劑量，經水煎劑給家兔灌 胃，於體內呈現二室模式，AUC為8.89 μg．h/mL，Cl為0.17 µg/mL，t1/2 為21.26 hr。. 28. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com.
(29) 3.大黃酸的藥物動力學研究:. 據Je-Hyun Lee, Jong等人(114)實驗，依口服方法給予健康的受試者大黃 抽出液(100 mg/kg)，AUC為9746.68 ng．h/mL，Cl為12.02 mL/h kg，t1/2為 3.38 hr。譚力(115)等人發現，依口服方法給予健康的受試者大黃酸(100 mg/kg)，AUC為93.40 μg．h/mL，Cl為1.31 L/hr，t1/2為3.81 hr。. 安睿等人(116)以大黃水煎液(用濃鹽酸調 pH 至 1，於 80℃水解 6 hr 後調 pH 至 4〜5，靜置過夜，待沉澱完全析出，離心，除去上清液，得 大黃樣品，以適量 CMC-Na (Na-Carboxymethylcellulose)溶液配製成懸浮 液)於家兔以口服方式給藥，結果表明大黃素為三室模式，大黃酚及大黃 酸為二室模式。大黃素及大黃酸的消除半衰期較長，清除率低，大黃酸 高峰濃度大，大黃素達 Tmax 快，藥效較大黃酚久。若以大黃酸標準品給 藥則呈現二室模式，且分佈體積及清除率也較大黃水煎液高出許多，Tmax 及 Cmax 也差異甚大。. 29. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com.
(30) 第八節 研究動機與目的. 1.研究動機 對中藥研究藥物動力學的基本任務，ㄧ是效法西藥藥物動力學的原 理及方法，以現代科學知識，建構適合於中藥藥物動力學研究的理論和 技術體系。二是利用現有的藥物動力學原理及方法，於實驗中研究中藥 有效成分、有效部位、中藥單方、複方及其藥物動力學參數。三是應用 參數，設計理想的中藥製劑與合理的給藥方案。 過去研究中藥藥物動力學的方法有: (1)血中藥物濃度法；(2)生物效 應法(藥理效應法、藥物累積法、效量半衰期法等)。而其中以血中藥物濃 度法最直接。對於有效成分明確且能用現有定量分析方法測定的中藥， 可採用體內藥物濃度法對該中藥進行藥物動力學研究，即給藥後在不同 時間測得血液(或尿液、淚液、唾液等生物樣本)中的藥物濃度，得到ㄧ 組體液藥物濃度-時間數據，然後建立藥物動力學模型，計算藥物動力學 參數，從而闡明該中藥在體內的動態變化規律。 過去對中藥研究藥物動力學大部分只針對其單一成分，例如:黃芩苷 (117-118). 、葛根素(119-120)等，但是單味中藥材中的成分眾多而非只有單一成. 分，各個成分間的交互作用也會彼此影響之間的吸收、分布、代謝、排. 30. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com.
(31) 泄、生體可用率等，故以ㄧ個中藥多種成分的探討較可以了解中藥的藥 物動力學行為。. 31. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com.
(32) 2.研究目的 A.建立大黃萃取液指標成分大黃素、大黃酸及大黃酚在血漿檢品中定量 之高效液相層析方法 尋找一種靈敏度高、準確性好且具專一性之大黃酚、大黃酸和大黃 素血漿檢品分析方法，家兔體內之藥動學及生體可用率研究。. B.大黃萃取液之藥物動力學研究 探討大黃萃取液在家兔經由耳靜脈靜脈注射後，分析指標成分大黃 酚、大黃酸和大黃素在家兔體內的藥物動力學特性，經定量而得知血中 濃度經時變化數據，進行藥物動力學相關模式之評估，以求得有關於藥 物動力學參數，並探討給予大黃萃取液後各成分在家兔體內之藥物動態 行為。. C.大黃萃取液之生體可用率研究 經由靜脈注射大黃萃取液及口服給予大黃萃取液後，分析而得到之 藥物動力學參數來瞭解三個指標成分大黃酚、大黃酸和大黃素之生體可 用率相關資訊，進一步觀察大黃萃取液口服給藥後的吸收情形，以供相 關臨床應用及藥理學研究之參考。. 32. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com.
(33) 第三章 實驗材料及研究方法. 第一節 實驗材料. 1.藥材 本實驗所使用之大黃藥材係勝昌藥廠所提供之掌葉大黃 Rheum palmatum LINN.之根莖. 2.藥品及試劑 大黃素(Emodin). Sigma Chemical Co.. 大黃酸(Rhein). 建宏層析企業股份有限公司. 大黃酚(Chrysophanol). 建宏層析企業股份有限公司. 1,8-二羥基蒽醌(1,8-dihydroxyanthraquinone). Sigma Chemical Co.. 肝素鈉(Heparin Sodium). Novo Industrlal Co. 5000 IU/mL. 磷酸(Phosphoric. Merck Co.. acid). 甲醇(Methanol). Merck Co.. 乙腈(Acetonitrile). Merck Co.. 氫氧化鈉(Sodium hydroxide). Merck Co... 33. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com.
(34) 藥用酒精(Ethanol). 煙酒公賣局. 生理食鹽水. 信東化學工業公司. 氮氣. 源吉氮氣. * 使用於高效液相層析儀之試劑均為HPLC級. 3.儀器及材料. A.高效液相層析儀之裝備 幫浦(Pump):. Jasco Model PU-980. 偵測器(Detector):. Jasco Model UV-975 Intelligent UV/VIS. 積分儀(Integrator):. Scientific InformLation Service CorporationIntegrator. 自動取樣機(Auto Sampler):. Jasco Model AS-851. 印表機(Printer):. Hewellt Packard LaserJet 1200 series. 層析管(Column):. Merck LiChrospher 100 RP-18e column (125 mm x 4 mm) endcapped, (5 μm). 保護管柱(Pre-column):. Merck Lichrospher 100 RP-18 endcapped, (5 μm). B.實驗室裝備 電子天平:. Sartorius Type 1801. 34. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com.
(35) 減壓抽氣機:. Eyela, Aspirator A-2S, Tokyo, Rikak Co.. 微量移液管(Micropipette): Socorex Transferpette:. l-10μL 20-200μL 100-1000μL. 試管振盪器:. Maxi Mix II Thermolyne Type 37600 Mixer. 高速離心機:. Hettich Zentrigen D-7200 Tuttlingen， Germany (5000 rpm). 酸鹼測定儀(pH meter):. Suntex Microprocessor pH meter Model-2200. 純水製造裝置:. RiOs, TK-5/ZROS6016Y, Millipore Co. and Milli-Q, FM-l2OD/ZMQS600, Millipore Co.. 超音波振盪器: BRANSON 5510, BRANSON ULTRASONIC Co. 吹氣濃縮裝置: Organomation Associates INC. Model No. 112. 過濾膜:. Millipore Type HV, 0.45 μm, Millipore Co.. C.動物實驗所用器材 胃管(內徑1.5 mm) : 季勗儀器公司 針筒過濾器0.22 μm : PRO-XTM (Lida) 注射針及針筒 :. Terumo Co. Tokyo, Japan 1 mL Syringe 25G x 5/8" (0.5 mm x l6 mm). 35. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com.
(36) 2.5 mL Syringe 24G x l" (0.55 mm x 25 mm) 10 mL Syringe 22G x l.5" (0.70 mm x 38mm) 靜脈置留針及針塞 : Terumo Co. Tokyo, Janan IV Catheter 22G x l" Injection Plug, 0.2 mL 家兔固定器 :. 信德儀器公司. 張口器、棉花、3M膠帶、計時器. 4.溶液製備 (1)大黃素(Emodin)、大黃酸(Rhein)及大黃酚(Chrysophanol)的標準溶液 精稱大黃素、大黃酸及大黃酚標準品各稱2.5, 1.25, 2 mg分別置 入一個20 mL的容量瓶中，添加甲醇至刻度，即得濃度分別為125, 62.5, 100 μg/mL的大黃素、大黃酸及大黃酚的標準溶液。使用時再以甲醇 稀釋成所需濃度之標準溶液。. (2)內部標準溶液 精稱1,8-二羥基蒽醌(1,8-dihydroxyanthraquinone) 1 mg置於20 mL定 量瓶中，先加入適量甲醇使之溶解，再加入甲醇至刻度，可得1,8-二羥基 蒽醌濃度為50 μg/mL之內部標準溶液。. 36. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com.
(37) (3)肝素鈉溶液 精取肝素鈉注射液(5,000 IU/mL) 2.5 mL加於500 mL生理食鹽水 中，即得25 IU/mL抗凝血肝素鈉溶液。. (4)大黃口服、靜脈注射溶液 精稱生大黃飲片100 g，加水800 mL，浸30 min，加熱煮沸10 min再 以紗布過濾去渣。將過濾出之藥渣依前述步驟操作一次，合併濾液後抽 氣過濾，約得700 mL濾液。將濾液以離心機於4000 rpm離心20 min，上 清液以0.22 μm濾膜過濾除菌，濾得之濾液以減壓濃縮至19.08 g，調控pH 值至10，再加水定量至60 mL。. 37. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com.
(38) 精稱100 g生大黃飲片，加水800 mL ，浸30 min. 加熱煮沸，煮沸持續 10 min 過濾. 濾液. 藥渣 加水 800 mL 加熱煮沸，煮沸持續 10 min. 濾液. 藥渣. 抽氣過濾 700 mL 離心 4000 rpm 20 min 過濾 0.22 μm 濾膜 減壓濃縮 19.08 g. 萃取率=19.08% RHEIN = 10.25 mg/ml EMODIN = 2.722 mg/ml CHRYSOPHANOL = 1.536 mg/ml. 溶於 60 mL 水(調控 pH 值至 10). 38. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com.
(39) 第二節 實驗方法. 1.指紋圖譜分析方法. (1)萃取方式 將大黃飲片以粉碎機打成粉末，並用20號篩篩過，精秤粉末1 g， 置入25 mL的樣品瓶中，加入70% MeOH水溶液3 mL後，超音波震盪15 分鐘，以離心機於1500 rpm離心5分鐘，取上層液，殘渣再加入的70% MeOH溶液8 mL超音波震盪15分鐘，重複共三次。將三次的上層液合併， 以70% MeOH定容至25 mL作為檢測液。. (2)分析條件之初篩選 a.移動相的選擇 : 由於中草藥萃取物所含成分相當多，因此開發中草藥的指紋圖譜之 分析方法時，我們建議移動相以梯度方式來發展，比較有利。剛開始分 析檢品時，以梯度變化，從高極性到低極性HPLC移動相，快速跑一遍(有 機相(Acetonitrile)與磷酸水(0.1%)比例，從0%隨著時間遞升至90%，分析 時間為60分鐘，變化速率為1.5 %/min)，得到初步指紋圖譜。初步指紋圖 譜有助於觀察未知檢品其所含之化合物族群的極性分佈狀況。也許大部 39. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com.
(40) 分化合物族群分佈高極性區域，也有可能是廣泛的分佈在高、中、低極 性中。了解所含化合物族群之極性分佈情形，並將分析方法最適化。此 外，移動相的酸鹼度也會影響指紋圖譜的結果。. b.檢測波長之選擇 用Photodiode array UV為檢測器，作全波長的掃描，然後再選定適合 的波長，來做為同日及異日精密度之檢測波長。掃描波長: 210、254、280、 500 nm等，其中以254 nm為本實驗之同日及異日精密度之檢測波長。. (2)測定條件 以高效液相層析儀搭配 Photodiode array UV 檢測器或 UV 檢測器， 做為化學指紋圖譜制定之儀器。配置緩衝溶液及移動相，使用 Inertsil ODS-2 column，化學指紋圖譜的波長。將上述檢測液，先以濾紙過濾， 再經 0.45 μm 濾膜過濾，取濾液 20 μL 注入高效液相層析儀中，檢測 其成分。. 40. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com.
(41) Table 5 指紋圖譜梯度沖提分析條件 時間 (min) 0. ACN (%) 1. 0.1 %磷酸鹽 溶液(%). 30. 10. 90. 50. 12. 88. 120. 14. 86. 150. 20. 80. 180. 22. 78. 210. 40. 60. 230. 7. 30. 240. 90. 10. 250. 90. 10. 99. a.化學指紋圖譜 將已確定基原品種之試品的檢測結果，制定相關參數。 b.指紋圖譜雷達圖之製作 將大黃藥材五批，以HPLC檢測分析得其UV吸收層析峰圖譜，標記 編號各層析峰時間，計算藥材各層析峰積分面積，並求得平均值及S.D. 值。外圍圓座標為HPLC圖譜中各層析峰編號，相對於層析峰編號之積分 面積為該座標軸數值，製成之大黃藥材指紋圖譜雷達圖。. 41. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com.
(42) 2.大黃萃取液中成分及家兔血漿檢品中之 HPLC 定量方法. A.HPLC 分析條件 層析管(Column) Merck LiChrospher 100 RP-18e column(250 mm x 4 mm) endcapped, (5 μm) 保護管柱 (Pre-column) Merck Lichrospher l00 RP-18 endcapped, (5 μm) 檢測波長. UV 254 nm. 流速. 1.0 mL/min. 移動相. MeOH : 0.2%磷酸水 = 75 : 25 (用磷酸調 pH=2.8). 注入量. 100 μL. 分析時間. 35 min. 內標. 1,8-dihydroxyanthraquinone. B.血漿檢品之前處理: 精確量取血漿檢品 140 μL 置入試管中，加入之內標準品 (1,8-dihydroxyanthraquinone) 20 μL、及 Emodin、Chrysophanol、Rhein 之 標準液各 20 μL 和乙腈 600 μL，以試管震盪器振盪 20 秒充分混合使血漿 蛋自沉澱。以離心機於 3500 rpm 離心 20 分鐘。吸取上清液 600 μL 置於 試管中，以氮氣噴吹至乾，以甲醇 200 μL 溶解，接著以 HPLC 分析。. 42. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com.
(43) C.檢量線之製作 : 精確量取血漿檢品 140 μL 置入試管中，加入之內標準品 (1,8-dihydroxyanthraquinone) 20 μL、及 Emodin、Chrysophanol、Rhein 之 標準液各 20 μL 和乙腈 600 μL，以試管震盪器振盪 20 秒充分混合使血漿 蛋自沉澱。以離心機於 3500 rpm 離心 20 分鐘。吸取上清液 600 μL 置於 試管中，以氮氣噴吹至乾，以甲醇 200 μL 溶解，接著以 HPLC 分析。由 圖譜所得之 Emodin、Chrysophanol、Rhein 與 1,8-dihydroanthraquinone 波峰之面積比與理論濃度作線性回歸以製作檢量線。 Table 6 大黃酚、大黃素、大黃酸標準濃度血漿檢品溶液之製備 標準溶液濃度. (μg/mL). CHRYSOPHANOL EMODIN. (取 20 μL) 空白血漿體積 RHEIN. (μL). 濃度. (μg/mL). CHRYSOPHANOL EMODIN. RHEIN. 100. 125. 62.5. 140. 10. 12.5. 6.25. 50. 62.5. 50. 140. 5. 6.25. 5. 25. 31.25. 25. 140. 2.5. 3.125. 2.5. 12.5. 15.625. 12.5. 140. 1.25. 1.563. 1.25. 6.25. 7.813. 6.25. 140. 0.625. 0.781. 0.625. 3.125. 3.906. 3.125. 140. 0.313. 0.391. 0.313. 1.563. 1.953. 1.563. 140. 0.156. 0.195. 0.156. 0.781. 0.977. 0.781. 140. 0.078. 0.098. 0.078. D.回收率實驗 目的在比較添加 Emodin、Chrysophanol、Rhein 於空白血漿和空白 溶液(Methanol)中，經血漿檢品之前處理後檢出量的差異。實驗步驟如同. 43. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com.
(44) 檢量線之製作中對檢品之處理過程。 回收率可由下式求得 Recovery(%) =. Plasma standard peak area ratio × 100% Methanol standard peak area ratio. E.精確性試驗 為了確認 Emodin、Chrysophanol、Rhein 定量分析方法之精確性，因 此做同日內(INTRADAY)及間日內(INTERDAY)的精確性比較。. 1.同日內(INTRADAY)試驗: 以不同濃度之含 Emodin、Chrysophanol、Rhein 標準濃度血漿檢品， 分別於同一日的早上、中午、晚上分別各取濃度為 50、12.5、1.325 μg/mL 之 Chrysophanol 或 Rhein 標準液及 62.5、15.625、3.906 μg/mL 之 Emodin 標準液各 20 μL ，加入 140 μL 之空白血漿中，震盪 1 分鐘混合均勻，即 得 Chrysophanol 或 Rhein 濃度為 5、1.25、0.133 μg/mL，及 Emodin 濃度 為 6.25、1.563、0.391 μg/mL 之血漿檢品(n=3)，計算各個校正濃度之平 均值(Mean)、標準偏差(S.D.)、變異係數(C.V.)。. 2.間日內(INTERDAY)試驗: 若於不同天以同日內(INTRADAY)試驗方法操作可得到間日內 (INTERDAY)的精確性比較。. 44. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com.
(45) F.靈敏度試驗: 最 低 偵 測 極 限 試 驗 (Limit of Detection, LOD) ， 是 連 續 稀 釋 Chrysophanol 或 Rhein 至 3 種低濃度 39.063、19.531、9.766 ng/mL，連續 稀釋 Emodin 至 3 種低濃度 48.828、24.414、12.207 ng/mL，以 HPLC 分 析求得 3 組波峰高度數據與對照的 3 種低濃度做線性回歸，可得各組回 歸方程式截距之標準偏差(σ)和總回歸方程式之斜率(S)，依 ICH 計算求得 最低偵測極限(LOD=3.3 x σ/s)與最低準確測量濃度(Limit of Quantitation, LOQ=10 x σ/s)，最後再將計算求得的 LOQ 依檢量線之製作，採標準血 漿檢品製備方法分析之。. G.安定性試驗 (1) Emodin、Chrysophanol、Rhein 在家兔血漿中於-30℃下之安定性試 驗: 取濃度為 50、12.5、1.325 μg/mL 之 Chrysophanol 或 Rhein 標準液及 62.5、15.625、3.906 μg/mL 之 Emodin 標準液 20 μL，加入 140 μL 之空 白血漿中，震盪 1 分鐘混合均勻，即得 Chrysophanol 或 Rhein 濃度為 5、 1.25、0.133 μg/mL，Emodin 濃度為 6.25、1.563、0.391 μg/mL 之血漿檢 品，將之分裝後置於-30℃的冷凍櫃中，於第 0, 1, 3, 6, 10, 15, 21 天分別 取出 1 組檢品(n=3)。解凍後，依血漿檢品之前處理方法處理後，以 HPLC. 45. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com.
(46) 分析，觀察 Emodin、Chrysophanol、Rhein 之濃度變化情形。. (2) Emodin、Chrysophanol、Rhein 在家兔血漿中於-25℃下之安定性試 驗: 取濃度為 50、12.5、1.325 μg/mL 之 Chrysophanol 或 Rhein 標準液及 62.5、15.625、3.906 μg/mL 之 Emodin 標準液 20 μL，加入 140 μL 之空白 血漿中，震盪 1 分鐘混合均勻，即得 Chrysophanol 或 Rhein 濃度為 5、 1.25、0.133 μg/mL，Emodin 濃度為 6.25、1.563、0.391 μg/mL 之血漿檢 品，將之分裝後置於室溫 25℃下，於第 0, 1, 3, 6, 12, 24, 48 小時，分別 取出 1 組檢品(n=3)。解凍後，依血漿檢品之前處理方法處理後，以 HPLC 分析，觀察 Emodin、Chrysophanol、Rhein 之濃度變化情形。. 3.大黃萃取液中成分在家兔體內之藥物動力學實驗. A.實驗設計 取雄性家兔六隻，體重介於 2.0 至 3.0 公斤之間，每隻家兔以大黃 萃取液靜脈注射及口服投藥。實驗家兔之重量、給藥順序及劑量標示於 Table 7，每次給藥後至下次給藥，時間須相隔一週以上。. 46. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com.
(47) Table 7 實驗家兔之體重 Rabbit NO.. 1. 2. 3. 4. 5. 6. Weight (kg). 2.56. 2.47. 2.68. 2.84. 2.75. 2.59. Table 8 給予實驗家兔之劑量 靜脈 大黃 萃取液. 口服. 注射. 一倍. 五倍. 十倍. 508.8 mg/kg. 508.8 mg/kg. 2544 mg/kg. 5088 mg/kg. B.給藥法及檢品處理 實驗前家兔先秤重紀錄實際體重以便配置給藥劑量。實驗時將兩耳 之毛剔除後關入限制籠內，接著以燈泡照射兔耳使其兔耳血管擴張，再 以酒精棉消毒並助血管擴張，隨即插入靜脈滯留針，將針塞(Injection plug) 注滿肝素鈉溶液約 1 mL，以防靜脈滯留針內之血液凝固。 投藥前先抽取 1.5 mL 之空白血液。靜脈注射給藥時由另一耳投藥，分別 於投藥後 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120, 150, 180, 240, 300, 360 分鐘由靜 脈滯留針之針塞抽取 1.5 mL 血液，置於真空採血管中，以 3500 rpm 轉 速離心 20 分鐘後取出上層血漿，即保存於-30℃之冷凍櫃中。 口服給藥前家兔至少禁食 24 小時，實驗期間亦不進食。以張口器將. 47. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com.
(48) 家兔之口張開後，以胃管插入給藥。採血點為給藥後之 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120, 150, 180, 240, 300, 360, 420, 480 分鐘。 血漿中成份定量法依前述血漿檢品之前處理步驟分析定量之。 C.數據處理及統計方法 各種給藥法所取得之血漿檢品經 HPLC 法定量後，依標準曲線成分內標之波峰/面積比換算大黃萃取液指標成分，大黃酸(Rhein)、大黃素 (Emodin)、 大 黃 酚 (Chrysophanol)之 血 中 濃 度 數 據 後 ， 利 用 電 腦 程 式 WINNOLIN 以非室模式及二室模式處理配適後來計算相關之藥物動力 學參數。. 48. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com.
(49) 第四章 結果與討論. 1.大黃指紋圖譜之建立及確效 Figure 1〜4為高效液相層析法以Photodiode array UV作為檢測器， 以波長210、254、280、500 nm所分析出的圖譜，其結果以波長於254 nm 所分析出的圖譜最為清晰且分明，故選定波長254 nm為最適當的分析波 長。 Figure 5〜7為以波長254 nm於同日及異日間的方法確效圖譜，由層 析圖中可觀察出，不論於同日或異日間的方法確效，圖譜中均有20根左 右的層析峰C.V.值於10%以內，顯示本指紋圖譜分析法良好。Table 14〜 16為同日及異日間的方法確效之層析峰面積。Figure 8為大黃萃取液成分 於指紋圖譜中之位置。 Figure 9 為以波長 254 nm 分析六批大黃所得之雷達圖，Table 17 為 六批大黃於高效液相層析圖中各層析峰之面積。由此可得知不同批大黃 藥材，其成分的差異性。. 2.大黃萃取液中成分大黃酚、大黃酸和大黃素之HPLC定量法 依張永紅(121)、金幼蘭(122)等人研究指出直接將大黃以8倍的水浸30 min後煎煮至沸，持續10分鐘所萃取出的總蒽醌含量最多，故本萃取液亦. 49. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com.
(50) 用此法煎煮。 本研究的定量分析法，是將製備好的大黃萃取液注射液或口服液， 加入含1,8-二羥基蒽醌(1,8-dihydroxyanthraquinone) 20 μL之乙腈溶液，取 上清液以氮氣噴吹至乙腈完全逸離後，以適當甲醇溶解之。再注入HPLC 分析。經過多次試驗與修正後，找出最適當定量分析條件。Figure 10顯 示大黃萃取液中之HPLC層析圖。 層析圖中大黃萃取液中三個成分大黃酚、大黃酸和大黃素波峰分別 與其內標準品1,8-二羥基蒽醌(1,8-dihydroxyanthraquinone)波峰之間清晰 且穩定，可見本法分離效果良好，具專一性。經使用指標成分大黃酚、 大黃酸和大黃素標準品溶液逐步稀釋後，溶液以HPLC法分析，本法之偵 測極限在不斷稀釋Chrysophanol、Rhein、Emodin至3種低濃度，以HPLC 分析求得3組波峰高度數據與對照的3種低濃度做線性回歸，可得各組回 歸方程式截距之標準偏差(σ)和總回歸方程式之斜率(S)，依ICH計算求得 最低偵測極限(LOD=3.3 x σ/s)與最低準確測量濃度(Limit of Quantitation, LOQ=10 x σ/s)，最後再將計算求得的LOQ依檢量線之製作，採標準血漿 檢品製備方法分析之。利用本法所製備標準液之檢量線，三個指標成分 在濃度範圍分別為大黃酚10.00〜0.08 μg/mL、大黃酸6.25〜0.08 μg/mL和 大黃素12.5〜0.10 μg/mL，與Peak area ratio間其決定係數(r2)均達到0.999. 50. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com.
(51) 以上，顯示在此範圍之內有良好的線性關係(Figure 12~14)。故本法足以 定量製劑中指標成分之含量。經分析後得知，大黃萃取液注射液及大黃 萃取液口服液中每毫升含大黃酚1.536 mg大黃酸10.25 mg、大黃素2.722 mg。. 3.家兔血漿檢品中大黃酚、大黃酸和大黃素之HPLC定量法 對於血漿檢品中三種成分的定量法，本研究的定量分析法，是將含 指標成分標準品之血漿檢品或大黃萃取液給藥後取得之血漿檢品，每200 μL 血 漿 檢 品 中 ， 大 黃 酚 、 大 黃 酸 和 大 黃 素 加 入 含 1,8- 二 羥 基 蒽 醌 (1,8-dihydroxyanthraquinone)內標準品20 μL之乙腈溶液，進行去蛋白質處 理，取上清液以氮氣噴吹至乙腈完全逸離後，以適當甲醇溶解之。再注 入HPLC分析。經過多次試驗與修正後，找出最適當定量分析條件。Figure 11顯示空白血漿、標準濃度血漿檢品及家兔靜脈注射後血漿檢品之HPLC 層析圖。 層析圖中大黃萃取液中三個成分大黃酚、大黃酸和大黃素波峰與內 標準 品1,8-二羥 基蒽 醌(1,8-dihydroxyanthraquinone)波峰 之間 清晰 且穩 定，較無干擾性波峰，可見本法分離效果良好，具專一性。利用本法所 製備血漿檢品之檢量線，利用本法所製備標準液之檢量線，三個成分在. 51. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com.
(52) 濃度範圍分別為大黃酚10.00〜0.08 μg/mL、大黃酸6.25〜0.08 μg/mL和大 黃素12.5〜0.10 μg/mL，與Peak area ratio間其決定係數(r2)均達到0.999以 上，顯示在此範圍之內有良好的線性關係(Figure 12~14)。 本法之偵測極限(Limit of Detection)，經逐步稀釋大黃酚、大黃酸和 大黃素三成分在同一標準溶液後分析之，其偵測極限大黃酚為 0.05 μg/mL、大黃酸 0.04 μg/mL、大黃素為 0.02 μg/mL。回收率(Recovery)試 驗結果(n=6)，大黃酚平均可達 94.65±2.58%、大黃酸平均可達 93.05±2.44%、大黃素平均可達 96.66±3.84% (Table 18)。以製備血漿檢品 檢量線之標準液，取六次標準液獨立檢品測得三個指標成分之定量極限 (Limit of Quantitation)，其最低濃度大黃酚為 0.15 μg/mL、大黃酸 0.11 μg/mL 和大黃素 0.07 μg/mL。於同日內(Intraday)及間日內(Interday)的精 確度評估，其三個指標成分變異係數(C.V.)皆均低於 15% (Table 19~24)。 同時含有大黃酚、大黃酸和大黃素三成分之標準血漿檢品液，以三 種濃度(大黃酚、大黃酸均為 2.5、1.25、0.625 μg/mL；大黃素為 3.125、 1.563、0.781 μg/mL)於 25℃及-30℃下進行安定性試驗，結果如 Table 28~33。及 Figure 15〜20 所示;大黃酚、大黃酸和大黃素在 25℃恆溫貯存 48 小時內及-30℃恆溫貯存 21 天內，經分析後兩者濃度無明顯下降，其 安定性較佳。. 52. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com.
(53) 由前述幾項分析確效試驗可知，本研究對於同時含大黃酚、大黃酸 和大黃素三成分之血漿檢品所開發出的高效液相層析法，為一靈敏、簡 便、再現性及精確性良好之定量分析法，可以供大黃萃取液進行藥物動 力學相關研究及臨床藥物監測之分析應用。. 4.大黃萃取液中成分大黃酚、大黃酸和大黃素在家兔體內之藥物動力學. (1) 家兔以靜脈注射給予大黃萃取液後之藥物動力學. 為探討大黃萃取液中成分大黃酚、大黃酸和大黃素在家兔體內之動 力學及體內過程，選擇三個指標成分大黃酚、大黃酸和大黃素作為在血 漿中定量的指標成分，以便獲得藥物動力學之相關資訊。以靜脈注射及 三種不同劑量口服，經由試驗設計在家兔進行給藥研究。血漿檢品中三 種指標成分濃度由前述開發之HPLC定量法，將分析所得之血漿中三種 成分之濃度數據，利用WINNOLIN PROGRAM以非室模式及二室模式 進行藥動學分析。 六隻家兔經由耳靜脈注射大黃萃取液注射液(劑量: 508.8 mg/kg; Rhein 16.4 mg/kg、Emodin 4.35 mg/kg、Chrysophanol 2.46 mg/kg)後，經 分析所得血漿中大黃酚、大黃酸和大黃素濃度經時變化數據，如Table 34 與Figure 21~22、Figure 29所示。而六隻家兔之血漿中大黃酚、大黃酸 53. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com.
(54) 和大黃素平均濃度變化，分別示於Table 37及Figure22、30中。由Figure 22、30中曲線的斜率可以發現，大黃酚、大黃酸和大黃素在家兔靜脈注 射後血中濃度下降迅速。觀察各成分之血中濃度變化，其血中濃度-時 間曲線半對數圖符合二室模式，依檢量線之最低濃度發現大黃酚、大黃 酸和大黃素在360分鐘後偵測不到血中濃度。 經WINNOLIN PROGRAM進行曲線配適，發現大黃酚、大黃酸和大 黃素在非室模式及二室模式下，均可以得到配適所得之藥物動力學數據 分別列於Table 50〜55。其大黃萃取液注射液於靜脈注射給予六隻家兔 後，其血中濃度之變化可以用下列三個方程式表示: Rhein : Cp=16.689e-0.092+2.021e-0.015 Emodin : Cp=5.163e-0.042+1.255e-0.002 Chrysophanol : Cp=2.924e-0.046+0.510e-0.001 大黃酸(Rhein)(16.4 mg/kg): 數據經WINNOLIN PROGRAM程式以 非 室 模 式 及 二 室 模 式 處 理 後 ， 平 均 半 衰 期 (t1/2β) 為 201.23 ± 26.23 及 62.68±45.39 min ， 平 均 穩 定 狀 態 分 佈 體 積 (VDss) 為 11.671 ± 1.431 及 4.865±3.253 L 。 平 均 曲 線 下 面 積 (AUC0→∞) 為 342.733 ± 2.867 及 310.037±16.739 μg．min/mL。 大黃素(Emodin)(4.35 mg/kg): 數據經WINNOLIN PROGRAM程式以 非 室 模 式 及 二 室 模 式 處 理 後 ， 平 均 半 衰 期 (t1/2β) 為 297.91 ± 15.04 及 351.43±12.08 min ， 平 均 穩 定 狀 態 分 佈 體 積 (VDss) 為 5.626 ± 0.120 及. 54. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com.
(55) 6.167±0.119 L 。 平 均 曲 線 下 面 積 (AUC0→∞) 為 704.700 ± 16.340 及 757.767±13.638 μg．min/mL。依賴錦益(113)等人於家兔靜脈注射5 mg/kg之 實驗、梁建文(95)等人研究，於家兔靜脈注射2 mg/kg之報告，平均半衰期 為70.55、226.81 min。梁建文(114)等人與本實驗的非室模式結果115 min較 為相近。 Table 9 家兔靜脈注射大黃素的藥物動力學參數比較 IV 大黃素(Emodin) 4.35 mg/kg. t1/2β, min. AUC , µg.min/ml Cl , L/min. VDss , L. 備註. 297.91±15.04 496.365±37.664 0.012±0.001 10.774±0.803. 5 mg/kg. 70.55. 81.29±16.57. 2 mg/kg. 115. 518. 0.145±0.024 2.39±0.61 0.0723. 5.27±4.83. 賴錦益(113)等人 梁建文(114)等人. 大黃酚(Chrysophanol)(2.46 mg/kg): 數據經WINNOLIN PROGRAM 程式以非室模式及二室模式處理後，平均半衰期(t1/2β)為606.04±86.34及 574.47±58.33 min ， 平 均 穩 定 狀 態 分 佈 體 積 (VDss) 為 9.541 ± 0.860 及 9.119±0.497 L 。 平 均 曲 線 下 面 積 (AUC0→∞) 為 496.365 ± 37.664 及 485.468±28.592 μg．min/mL。. 55. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com.
(56) Table 10 家兔靜脈注射大黃萃取液後大黃素、大黃酸、大黃酚的藥物動 力學參數 IV 大黃酸(Rhein) (16.4 mg/kg) 大黃素(Emodin) (4.35 mg/kg) 大黃酚(Chrysophanol) (2.46 mg/kg). t1/2β , min. AUC0→∞. ,. μg．min/mL Cl , L/min. VDss , L. 201.23±26.23. 342.733±2.867. 0.120±0.001 11.671±1.431. 297.91±15.04. 704.700±16.340. 0.016±0.000 5.626±0.120. 606.04±86.34. 496.365±37.664. 0.012±0.001 9.541±0.860. (2)家兔以口服給予大黃萃取液三種劑量後之藥物動力學. 六隻家兔經由大黃萃取液口服給藥(一倍劑量: 508.8 mg/kg ; Rhein 16.4 mg/kg、Emodin 4.35 mg/kg、Chrysophanol 2.46 mg/kg ; 五倍劑量: 2544 mg/kg；Rhein 82 mg/kg、Emodin 21.76 mg/kg、Chrysophanol 12.29 mg/kg；十倍劑量: 5088 mg/kg；Rhein 164 mg/kg、Emodin 43.55 mg/kg、 Chrysophanol 24.58 mg/kg)後，經分析所得血漿中大黃酚、大黃酸和大 黃素濃度經時變化數據，如Table 38~49與Figure 23〜28、Figure 31〜36 所示。而六隻家兔之血漿中大黃酚、大黃酸和大黃素平均濃度變化，分 別示於Table 41、45、49及Figure 24、26、28、32、34、36中。觀察各 成分之血中濃度變化，其血中濃度-時間曲線半對數圖符合二室模式， 依檢量線之最低濃度發現大黃酚、大黃酸和大黃素在480分鐘後偵測不 到血中濃度。 56. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com.
(57) 大黃酸(Rhein)(16.4 mg/kg): 以WINNOLIN非室模式及二室模式處 理後約45.00±0.00及30.58±0.28 min.達到平均最高血中濃度(Cmax)，其最高 血中濃度(Cmax)平均約1.809±0.024及1.841±0.056 μg/mL，平均半衰期(t1/2β) 為185.99±22.28及363.49±69.32 min，平均曲線下面積(AUC0→∞)為166.354 ±7.336及207.327±13.109 μg．min/mL。 大黃酸(Rhein)(82 mg/kg): 以WINNOLIN非室模式及二室模式處理 後約30.00±0.00及22.90±2.06 min達到平均最高血中濃度(Cmax)，其最高血 中濃度(Cmax)平約2.863±0.059及3.244±0.314 μg/mL。平均半衰期(t1/2β)為 211.47±4.21及213.03±3.62 min，平均曲線下面積(AUC0→∞)為478.6205± 4.171及473.159±5.177 μg．min/mL。. 大黃酸(Rhein)(164 mg/kg): 以WINNOLIN非室模式及二室模式處理 後約30.00±0.00及28.41±1.73 min達到平均最高血中濃度(Cmax)，其最高血 中濃度(Cmax)平均約5.333±0.148及5.393±0.112 μg/mL。平均半衰期(t1/2β) 為206.47±5.51及233.65±11.72 min，平均曲線下面積(AUC0→∞)為734.749± 3.717及742.216±8.643 μg．min/mL。 依據口服給藥一倍、五倍、十倍劑量的藥動參數，其平均曲線下面 積(AUC0→∞)亦隨著劑量的增加而成倍數的增加。. 57. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com.
(58) 據譚力 (114) 等人實驗口服100 mg於人、Je-Hyun(113) 口服給予人100 mg/kg之anthraquinone，平均半衰期為4.08、3.375 hr，其結果與本實驗非 室模式結果較為相近。依蔣心惠(123)等人於家兔口服45.1 g/kg大黃萃取液 之實驗，平均半衰期為28.105 hr，其結果與本實驗非室模式結果差異大。 Table 11 家兔口服大黃酸的藥物動力學參數比較 口服大黃酸 Tmax , min Cmax , μg/mL. t1/2β , min. VDss , L. Cl , L/min AUC0→∞, μg．min/mL. 16.4 mg/kg 45.00±0.00 1.809±0.024 185.99±22.28 65.999±6.005 0.247±0.011. 166.354±7.336. 30.00±0.00 2.863±0.059 213.03±3.62 130.672±2.060 0.428±0.004. 211.474±4.209. 164 mg/kg 30.00±0.00 5.333±0.148 206.471±5.51 166.214±4.159 0.558±0.003. 734.749±3.717. 82 mg/kg. 45.1 g/kg 大黃萃取液. 15.00±00.00 2.045±1.290 1686.3±16.210 299.220±4.019 0.326±0.043. 1840.53±4.551. 大黃素(Emodin)(4.35 mg/kg): 以WINNOLIN非室模式及二室模式處 理後約30.00±0.00及20.91±1.43 min達到平均最高血中濃度(Cmax)，其最高 血中濃度(Cmax)平均約1.459±0.050及1.612±0.128 μg/mL。平均半衰期(t1/2β) 為296.28±4.82及292.00±3.37 min，平均曲線下面積(AUC0→∞)為545.465± 6.116及536.309±3.890 μg．min/mL。 大黃素(Emodin)(21.78 mg/kg): 以WINNOLIN非室模式及二室模式 處理後約45.00±0.00及32.30±0.49 min達到平均最高血中濃度(Cmax)，其最 高血中濃度(Cmax)平均約2.390±0.032及2.303±0.010 μg/mL。平均半衰期 (t1/2β)為 276.51 ± 9.82 及 369.28±6.94 min ， 平 均 曲 線 下 面 積 (AUC0→∞)為 652.718±10.838及741.118±9.879 μg．min/mL。 58. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com. 備註. 蔣心惠(123) 等人.
(59) 大黃素(Emodin)(43.55 mg/kg): 以WINNOLIN非室模式及二室模式 處理後約45.00±0.00及32.84±0.16 min達到平均最高血中濃度(Cmax)，其最 高血中濃度(Cmax)平均約4.443±0.112及4.094±0.021 μg/mL。平均半衰期 (t1/2β)為331.16±22.05及368.06±12.36 min，平均曲線下面積(AUC0→∞)為 911.742±19.707及950.171±13.606 μg．min/mL。 依據口服給藥一倍、五倍、十倍劑量的藥動參數，其平均曲線下面 積(AUC0→∞)亦隨著劑量的增加而增加，但並非為倍數的增加。 依賴錦益(113)等人於家兔口服三黃瀉心湯(大黃素總量約6.444 mg)之 實驗及龐志功(112)等人報告，於家兔口服1 g/kg大黃原藥之研究，平均半 衰期為235.91 min、47.62 hr，本實驗數據非室模式結果與賴錦益(100)等人 較為相近。 Table 12 家兔口服大黃素的藥物動力學參數比較 口服大黃素 Tmax , min Cmax , μg/mL Cl , L/min. t1/2β , min. AUC0→∞,μg．min/mL. 296.28±4.82. 545.465±6.116. 21.78 mg/kg 45.00±0.00 2.390±0.032 0.121±0.092 48.870±38.520 276.51±9.82. 652.718±10.838. 43.55 mg/kg 45.00±0.00 4.094±0.021 0.120±0.003 57.008±2.558 368.06±12.36. 950.171±13.606. VDss , L. 4.35 mg/kg 30.00±0.00 1.459±0.050 0.020±0.000 8.532±0.106. 6.444 mg 72.60±17.74 0.031±0.005 0.510±0.134 168.650±27.790 235.91±60.58 1 g/kg 大黃原藥. 127.8. 1.05. 0.06. 2857.2. 59. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com. 23.280±4.350 384. 備註. 賴錦益(113) 等人 龐志功(112) 等人.
(60) 大黃酚(Chrysophanol)(2.46 mg/kg): 以WINNOLIN非室模式及二室 模 式 處 理 後 約 30.00 ± 0.00 及 20.05±0.18 min 達 到 平 均 最 高 血 中 濃 度 (Cmax)，其最高血中濃度(Cmax)平均約0.2805±0.004及0.310±0.009 μg/mL。 平均半衰期(t1/2β)為869.00±127.20及697.57±85.84 min，平均曲線下面積 (AUC0→∞)為159.886±15.530及137.558±11.100 μg．min/mL。. 大黃酚(Chrysophanol)(12.29 mg/kg): 以WINNOLIN非室模式及二室 模式處理約30.00±0.00及29.92±0.34 min達到平均最高血中濃度(Cmax)，其 最高血中濃度(Cmax)平均約0.641±0.008及0.642±0.008 μg/mL。平均半衰期 (t1/2β)為763.35±138.73及647.57±36.83 min，平均曲線下面積(AUC0→∞)為 184.384±19.992及167.198±5.840 μg．min/mL。. 大黃酚(Chrysophanol)(24.58 mg/kg): 以WINNOLIN非室模式及二室 模式處理約45.00±0.00及41.48±2.77 min達到平均最高血中濃度(Cmax)，其 最高血中濃度(Cmax)平均約1.085±0.039及0.961±0.287 μg/mL。平均半衰期 (t1/2β)為847.19±153.93及1700.40±1324.41 min，平均曲線下面積(AUC0→∞) 為304.547±38.040及450.399±263.683 μg．min/mL。 依據口服給藥一倍、五倍、十倍劑量的藥動參數，其平均曲線下面. 60. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com.
(61) 積(AUC0→∞)亦隨著劑量的增加而增加，但並非為倍數的增加。 依龐志功(99)等人報告，於家兔口服1 g/kg大黃原藥之研究，平均半衰 期為21.26 hr，其結果與本實驗非室模式及二室模式處理結果差異大。 Table 13 家兔口服大黃酚的藥物動力學參數比較 口服大黃酚 Tmax , min Cmax , μg/mL Cl , L/min. VDss , L. t1/2β , min. 2.46 mg/kg 30.00±0.00 0.281±0.004 0.039±0.004 47.988±2.333 869.00±127.20. 159.886±15.530. 12.29 mg/kg 30.00±0.00 0.641±0.008 0.168±0.019 182.230±13.979 763.35±138.73. 184.384±19.992. 24.58 mg/kg 45.00±0.00 1.085±0.039 0.205±0.029 244.914±17.435 847.19±153.93. 304.547±38.040. 1 g/kg 大黃原藥. 85.2. 0.73. 0.17. 備註. AUC0→∞,μg．min/mL. 1275.6. 533.4. 龐志功(99). 5.大黃萃取液在家兔體內的生體可用率(F). 為明瞭大黃萃取液口服後於家兔體內的生體可用率，以三個指 標成分大黃酚、大黃酸和大黃素之平均曲線下面積(AUC0→∞ )數據與靜脈 注射後之平均曲線下面積(AUC0→∞ )數據進行計算如公式如下： 絕對生體可用率 ( F ) =. AUC0 → ∞ORAL / DOSEORAL AUC0→ ∞IV / DOSEIV. 大黃酸口服的絕對生體可用率約為66.87%。 大黃素口服的絕對生體可用率約為70.77%，與賴錦益等人(113)實驗結 果2.79%及梁建文等人(114)研究報告指出絕對生體可用率很低比較，結果. 61. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com. 等人.
(62) 相距甚大，其原因可能與本實驗所用的為大黃萃取液複方給藥而非單一 成分給藥所致，對於是否與大黃萃取液中其他有效活性成分的交互影響 有關還要再進一步的實驗認證。 大黃酚口服的絕對生體可用率約為28.33%。. 62. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com.
(63) 第五章 結論. 1.大黃指紋圖譜之建立及確效 利用上述指紋圖譜分析條件於同日及異日間的確效實驗精密度評 估，變異係數均於10%以下，故此指紋圖譜分析條件適用於大黃萃取液 的分析及品管。. 2.以HPLC法分析大黃萃取液中成分大黃素、大黃酸及大黃酚之定量法 大黃素、大黃酸及大黃酚利用 Merck LiChrospher 100 RP-18e column (250 mm x 4 mm) endcapped, (5 μm) 層析管，以 1,8-二羥基蒽醌溶液為內 標準品，大黃素、大黃酸及大黃酚於波長 254 nm 偵測，可得良好的分析 效果。大黃素標準液濃度在 12.5 至 0.10 μg/mL 之間，大黃酸標準液濃度 在 6.25 至 0.08 μg/mL 之間，大黃酚標準液濃度在 10.00 至 0.08 μg/mL 之 間，與 Peak area ratio 間有良好的線性關係(r2=0.999 以上)。故本法為適 合大黃萃取液中指標成分品質管制之定量法。. 63. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com.
(64) 3.利用 HPLC 法偵測大黃萃取液中成分大黃素、大黃酸及大黃酚在血漿 檢品中之定量法 大黃素、大黃酸及大黃酚利用 Merck LiChrospher 100 RP-18e column (225 mm x 4 mm) endcapped, (5 μm) 層析管，1,8-dihydroxyanthraquinone 溶液為內標準品，於波長 254 nm 偵測，分析可得良好的分析效果。大黃 素標準液濃度在 12.5 至 0.10 μg/mL 之間，大黃酸標準液濃度在 6.25 至 0.08 μg/mL 之間，大黃酚標準液濃度在 10.00 至 0.08 μg/mL 之間，與 Peak area ratio 間有良好的線性關係(r2=0.999 以上)。故本法足以分析於大黃萃 取液中指標成分品質管制之定量法。同日(Intraday)及間日(Interday)所作 精確性評估與定量極限試驗，其變異係數(C.V.)皆低於 14%，故本法足以 應用於藥物動力學及相關分析研究上。. 4.大黃萃取液中大黃素、大黃酸及大黃酚靜脈注射後之藥物動力學 大黃萃取液在家兔靜脈注射給藥之後，指標成分大黃素、大黃酸及 大黃酚在家兔體內的經時變化，經由血中藥物濃度測定及藥動學與統計 學分析之結果，大黃素、大黃酸及大黃酚均遵循二室模式。在家兔體內 中，大黃素的平均排除半衰期約為 297.91 min、大黃酸的平均排除半衰 期約為 201.23 min，而大黃酚的平均排除半衰期約為 606.04 mim。. 64. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com.
(65) 5.大黃萃取液在家兔體內之生體可用率 家兔經口服給予大黃萃取液後，經由血中藥物濃度測定及藥動學 與統計學分析之結果，係遵循二室模式。在家兔體內中，大黃素生體可 用率約為70.79%、大黃酸生體可用率約為67.03%，大黃酚生體可用率約 為28.38%。. 65. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com.
(66) Absorbance (AU). 0.08. 0.04. 0.02. 0. 20. 40. 0.06. 60. 80. 80 100. 100 120. 120 216.27. 140 160. 140 160. 140. 160. 180. 180. 0.10. 180 196.19 197.65 198.83 199.47 199.95 200.56 201.71 204.11 205.60 207.73 210.16 213.20 215.28 219.20 221.76 223.31 224.77 226.53 227.52 229.84 230.29 236.05 237.44 238.56 233.79. 107.04. 151.15 153.57 157.07 158.37 160.51 163.73 164.80 168.88 171.63 178.29 181.87 184.69 187.95. 84.75. 120. 126.56 131.52 135.52 137.25 139.97 142.37 144.77 145.63 147.79. 118.16. 90.51 95.55 99.95. 81.47. 100. 193.92 195.09 198.64 198.99 199.71 201.49 202.40 204.03 205.57 207.68 208.69 209.81 211.17 212.83 215.31 215.97 217.87 219.07 220.16 221.87 226.43 227.63 233.17 233.79 236.24 237.47 243.79 244.32. 60. 150.05. 40. 103.23 109.09 111.20 117.36 122.29 128.13 132.51 133.87 138.80136.51 141.15 144.83 147.15 148.13 151.63 154.75 156.61 158.53 160.72162.27 166.64 169.52 171.52 176.43 179.41 182.61 185.49. 20 80. 99.20. 0 60. 93.79. 0.05 40. 82.53 85.36. 0.10 20. 88.93. 0. 36.45. 0.02 117.36 132.24 133.76 136.51138.80 141.17 144.85 147.15 148.16 150.05 151.36 152.11 154.72 156.61 158.51 160.72 162.27 166.64 169.52 173.41 175.23 176.37 179.39 182.61 185.55. 128.13. 193.95 195.07 196.27 198.59 199.01 199.71 200.16 201.49 204.00202.37 207.68 208.69 209.81 215.31 215.97 217.87 219.07 221.87 224.16 225.04 226.43 227.63 228.83 229.95 232.27 233.17 233.79 235.79 236.24 237.47 238.88 240.29 241.09 241.97 243.25 243.81 245.04. 123.49. 4.37 6.16 6.96 8.59 9.17 11.17 13.07 12.45 14.93 15.73 16.56 18.21 18.85 19.49 20.77 22.03 23.09 23.84 26.27 27.60 28.16 29.57 30.61 31.55 32.75 33.47 34.77 36.45 38.00 38.80 39.44 40.35 42.75 41.15 41.71 44.00 44.96 47.31 48.45 50.45 51.44 52.05 54.13 54.80 56.37 58.85 60.72 63.76 64.72 66.27 69.12 73.68 75.07 78.85 80.53 82.53 85.36 88.91 93.76 99.23 103.20 109.31111.15. 0.04. 11.92. 0.06. 2.83 2.75 4.03 5.44 7.92 8.56 9.76 10.48 15.07 20.11 21.15 23.12 25.65 27.49 28.27 29.84 30.96 32.19 32.93 34.48 38.29 36.37 39.76 42.16 44.64 47.49 48.75 55.04 57.49 60.19 61.63 67.09 72.48. 0.08. 12.45. Absorbance (AU). 0.10. 2.88 2.80 2.72 4.37 6.11 8.56 9.17 11.17 15.76 18.21 19.47 19.97 20.80 21.92 23.87 25.41 26.29 27.57 28.13 29.57 30.59 31.55 33.47 34.77 35.60 37.28 39.44 40.16 41.09 41.73 42.75 44.96 47.33 48.48 51.47 54.11 56.37 58.85 60.72 64.72 66.32 69.12 75.95 80.61. Absorbance (AU). Figure 1 大黃萃取液之Photodiode array UV層析圖(波長210 nm). 0.00. -0.02 200. 200. 200. Retention Time (min). 66. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 220. 220. 220. 240. Retention Time (min). Figure 2 大黃萃取液之 Photodiode array UV 層析圖(波長 254 nm) 0.20. 0.15. 0.00. Retention Time (min) 240. Figure 3 大黃萃取液之 Photodiode array UV 層析圖(波長 280 nm). 0.00. -0.02. 240.
(67) Figure 4 大黃萃取液之 Photodiode array UV 層析圖(波長 500 nm) 0.10. 0.06. 226.43. 233.79 237.47. 209.84 215.97. 199.73. 185.39. 151.65 155.92. 103.17. 82.35. 56.24. 0.02. 34.19 40.13 40.88. 0.04. 2.83 3.65 4.37 6.85. Absorbance (AU). 0.08. 0.00 -0.02 0. 20. 40. 60. 80. 100. 120. 140. 160. 180. 200. 220. 240. Retention Time (min). Figure 5 大黃萃取液 HPLC 層析圖 I (C.V.＜10﹪) 216.56. 0.20. 234.13 210.48. 237.79. 0.05. 177.39 183.73. 35.89. 82.56. 0.10. 226.80. 103.63. 12.13. Absorbance (AU). 0.15. 0.00 0. 20. 40. 60. 80. 100. 120. 140. 160. 180. 200. 220. 240. Retention Time (min). Table 14 大黃萃取液於高效液相層析圖中各層析峰面積之再現性 I (C.V.<10%). 67. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com.
(68) Figure 6 大黃萃取液 HPLC 層析圖 II (C.V.＜10﹪) 216.05. 0.20. 233.79 226.48 237.44. 0.05. 209.92. 35.89. 176.80 183.09. 82.69. 0.10. 103.97. 12.05. Absorbance (AU). 0.15. 0.00 0. 20. 40. 60. 80. 100. 120. 140. 160. 180. 200. 220. 240. Retention Time (min). Table 15 大黃萃取液於高效液相層析圖中各層析峰面積之再現性 II (C.V.<10%). Figure 7 大黃萃取液 HPLC 層析圖 III (C.V.＜10﹪) 216.27. 0.20. 233.79 210.16. 237.44. 178.29 184.69. 0.05. 226.53. 107.04 36.37. 0.10. 84.75. 11.92. Absorbance (AU). 0.15. 0.00 0. 20. 40. 60. 80. 100. 120. 140. 160. 180. 200. Retention Time (min). 68. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com. 220. 240.
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