1.大黃指紋圖譜之建立及確效
Figure 1〜4為高效液相層析法以Photodiode array UV作為檢測器，
以波長210、254、280、500 nm所分析出的圖譜，其結果以波長於254 nm 所分析出的圖譜最為清晰且分明，故選定波長254 nm為最適當的分析波 長。
Figure 5〜7為以波長254 nm於同日及異日間的方法確效圖譜，由層 析圖中可觀察出，不論於同日或異日間的方法確效，圖譜中均有20根左 右的層析峰C.V.值於10%以內，顯示本指紋圖譜分析法良好。Table 14〜
16為同日及異日間的方法確效之層析峰面積。Figure 8為大黃萃取液成分 於指紋圖譜中之位置。
Figure 9 為以波長 254 nm 分析六批大黃所得之雷達圖，Table 17 為 六批大黃於高效液相層析圖中各層析峰之面積。由此可得知不同批大黃 藥材，其成分的差異性。
2.大黃萃取液中成分大黃酚、大黃酸和大黃素之HPLC定量法
依張永紅(121)、金幼蘭(122)等人研究指出直接將大黃以8倍的水浸30 min後煎煮至沸，持續10分鐘所萃取出的總蒽醌含量最多，故本萃取液亦
用此法煎煮。
本研究的定量分析法，是將製備好的大黃萃取液注射液或口服液，
加入含1,8-二羥基蒽醌(1,8-dihydroxyanthraquinone) 20 μL之乙腈溶液，取 上清液以氮氣噴吹至乙腈完全逸離後，以適當甲醇溶解之。再注入HPLC 分析。經過多次試驗與修正後，找出最適當定量分析條件。Figure 10顯 示大黃萃取液中之HPLC層析圖。
層析圖中大黃萃取液中三個成分大黃酚、大黃酸和大黃素波峰分別 與其內標準品1,8-二羥基蒽醌(1,8-dihydroxyanthraquinone)波峰之間清晰 且穩定，可見本法分離效果良好，具專一性。經使用指標成分大黃酚、
大黃酸和大黃素標準品溶液逐步稀釋後，溶液以HPLC法分析，本法之偵 測極限在不斷稀釋Chrysophanol、Rhein、Emodin至3種低濃度，以HPLC 分析求得3組波峰高度數據與對照的3種低濃度做線性回歸，可得各組回 歸方程式截距之標準偏差(σ)和總回歸方程式之斜率(S)，依ICH計算求得 最低偵測極限(LOD=3.3 x σ/s)與最低準確測量濃度(Limit of Quantitation, LOQ=10 x σ/s)，最後再將計算求得的LOQ依檢量線之製作，採標準血漿 檢品製備方法分析之。利用本法所製備標準液之檢量線，三個指標成分 在濃度範圍分別為大黃酚10.00〜0.08 μg/mL、大黃酸6.25〜0.08 μg/mL和 大黃素12.5〜0.10 μg/mL，與Peak area ratio間其決定係數(r2)均達到0.999
以上，顯示在此範圍之內有良好的線性關係(Figure 12~14)。故本法足以 定量製劑中指標成分之含量。經分析後得知，大黃萃取液注射液及大黃 萃取液口服液中每毫升含大黃酚1.536 mg大黃酸10.25 mg、大黃素2.722 mg。
3.家兔血漿檢品中大黃酚、大黃酸和大黃素之HPLC定量法
對於血漿檢品中三種成分的定量法，本研究的定量分析法，是將含 指標成分標準品之血漿檢品或大黃萃取液給藥後取得之血漿檢品，每200 μL 血 漿 檢 品 中 ， 大 黃 酚 、 大 黃 酸 和 大 黃 素 加 入 含 1,8- 二 羥 基 蒽 醌
(1,8-dihydroxyanthraquinone)內標準品20 μL之乙腈溶液，進行去蛋白質處 理，取上清液以氮氣噴吹至乙腈完全逸離後，以適當甲醇溶解之。再注 入HPLC分析。經過多次試驗與修正後，找出最適當定量分析條件。Figure 11顯示空白血漿、標準濃度血漿檢品及家兔靜脈注射後血漿檢品之HPLC 層析圖。
層析圖中大黃萃取液中三個成分大黃酚、大黃酸和大黃素波峰與內 標準 品1,8-二羥 基蒽 醌(1,8-dihydroxyanthraquinone)波峰 之間 清晰 且穩 定，較無干擾性波峰，可見本法分離效果良好，具專一性。利用本法所 製備血漿檢品之檢量線，利用本法所製備標準液之檢量線，三個成分在
濃度範圍分別為大黃酚10.00〜0.08 μg/mL、大黃酸6.25〜0.08 μg/mL和大 黃素12.5〜0.10 μg/mL，與Peak area ratio間其決定係數(r2)均達到0.999以 上，顯示在此範圍之內有良好的線性關係(Figure 12~14)。
本法之偵測極限(Limit of Detection)，經逐步稀釋大黃酚、大黃酸和 大黃素三成分在同一標準溶液後分析之，其偵測極限大黃酚為 0.05 μg/mL、大黃酸 0.04 μg/mL、大黃素為 0.02 μg/mL。回收率(Recovery)試 驗結果(n=6)，大黃酚平均可達 94.65±2.58%、大黃酸平均可達
93.05±2.44%、大黃素平均可達 96.66±3.84% (Table 18)。以製備血漿檢品 檢量線之標準液，取六次標準液獨立檢品測得三個指標成分之定量極限 (Limit of Quantitation)，其最低濃度大黃酚為 0.15 μg/mL、大黃酸 0.11 μg/mL 和大黃素 0.07 μg/mL。於同日內(Intraday)及間日內(Interday)的精 確度評估，其三個指標成分變異係數(C.V.)皆均低於 15% (Table 19~24)。
同時含有大黃酚、大黃酸和大黃素三成分之標準血漿檢品液，以三 種濃度(大黃酚、大黃酸均為 2.5、1.25、0.625 μg/mL；大黃素為 3.125、
1.563、0.781 μg/mL)於 25℃及-30℃下進行安定性試驗，結果如 Table 28~33。及 Figure 15〜20 所示;大黃酚、大黃酸和大黃素在 25℃恆溫貯存 48 小時內及-30℃恆溫貯存 21 天內，經分析後兩者濃度無明顯下降，其 安定性較佳。
由前述幾項分析確效試驗可知，本研究對於同時含大黃酚、大黃酸 和大黃素三成分之血漿檢品所開發出的高效液相層析法，為一靈敏、簡 便、再現性及精確性良好之定量分析法，可以供大黃萃取液進行藥物動 力學相關研究及臨床藥物監測之分析應用。
4.大黃萃取液中成分大黃酚、大黃酸和大黃素在家兔體內之藥物動力學
(1) 家兔以靜脈注射給予大黃萃取液後之藥物動力學
為探討大黃萃取液中成分大黃酚、大黃酸和大黃素在家兔體內之動 力學及體內過程，選擇三個指標成分大黃酚、大黃酸和大黃素作為在血 漿中定量的指標成分，以便獲得藥物動力學之相關資訊。以靜脈注射及 三種不同劑量口服，經由試驗設計在家兔進行給藥研究。血漿檢品中三 種指標成分濃度由前述開發之HPLC定量法，將分析所得之血漿中三種 成分之濃度數據，利用WINNOLIN PROGRAM以非室模式及二室模式 進行藥動學分析。
六隻家兔經由耳靜脈注射大黃萃取液注射液(劑量: 508.8 mg/kg;
Rhein 16.4 mg/kg、Emodin 4.35 mg/kg、Chrysophanol 2.46 mg/kg)後，經 分析所得血漿中大黃酚、大黃酸和大黃素濃度經時變化數據，如Table 34 與Figure 21~22、Figure 29所示。而六隻家兔之血漿中大黃酚、大黃酸
和大黃素平均濃度變化，分別示於Table 37及Figure22、30中。由Figure 22、30中曲線的斜率可以發現，大黃酚、大黃酸和大黃素在家兔靜脈注 射後血中濃度下降迅速。觀察各成分之血中濃度變化，其血中濃度-時 間曲線半對數圖符合二室模式，依檢量線之最低濃度發現大黃酚、大黃 酸和大黃素在360分鐘後偵測不到血中濃度。
經WINNOLIN PROGRAM進行曲線配適，發現大黃酚、大黃酸和大 黃素在非室模式及二室模式下，均可以得到配適所得之藥物動力學數據 分別列於Table 50〜55。其大黃萃取液注射液於靜脈注射給予六隻家兔 後，其血中濃度之變化可以用下列三個方程式表示:
Rhein : Cp=16.689e-0.092+2.021e-0.015 Emodin : Cp=5.163e-0.042+1.255e-0.002
Chrysophanol : Cp=2.924e-0.046+0.510e-0.001
大黃酸(Rhein)(16.4 mg/kg): 數據經WINNOLIN PROGRAM程式以 非 室 模 式 及 二 室 模 式 處 理 後 ， 平 均 半 衰 期 (t1/2β) 為 201.23 ± 26.23 及 62.68±45.39 min ， 平 均 穩 定 狀 態 分 佈 體 積 (VDss) 為 11.671 ± 1.431 及 4.865±3.253 L 。 平 均 曲 線 下 面 積 (AUC0→∞) 為 342.733 ± 2.867 及 310.037±16.739 μg．min/mL。
大黃素(Emodin)(4.35 mg/kg): 數據經WINNOLIN PROGRAM程式以 非 室 模 式 及 二 室 模 式 處 理 後 ， 平 均 半 衰 期 (t1/2β) 為 297.91 ± 15.04 及 351.43±12.08 min ， 平 均 穩 定 狀 態 分 佈 體 積 (VDss) 為 5.626 ± 0.120 及
6.167±0.119 L 。 平 均 曲 線 下 面 積 (AUC0→∞) 為 704.700 ± 16.340 及 757.767±13.638 μg．min/mL。依賴錦益(113)等人於家兔靜脈注射5 mg/kg之 實驗、梁建文(95)等人研究，於家兔靜脈注射2 mg/kg之報告，平均半衰期 為70.55、226.81 min。梁建文(114)等人與本實驗的非室模式結果115 min較 為相近。
Table 9 家兔靜脈注射大黃素的藥物動力學參數比較
IV 大黃素(Emodin) t1/2β, min AUC , µg.min/ml Cl , L/min VDss , L 備註 4.35 mg/kg 297.91±15.04 496.365±37.664 0.012±0.001 10.774±0.803
5 mg/kg 70.55 81.29±16.57 0.145±0.024 2.39±0.61 賴錦益(113)等人
2 mg/kg 115 518 0.0723 5.27±4.83 梁建文(114)等人
大黃酚(Chrysophanol)(2.46 mg/kg): 數據經WINNOLIN PROGRAM 程式以非室模式及二室模式處理後，平均半衰期(t1/2β)為606.04±86.34及 574.47±58.33 min ， 平 均 穩 定 狀 態 分 佈 體 積 (VDss) 為 9.541 ± 0.860 及 9.119±0.497 L 。 平 均 曲 線 下 面 積 (AUC0→∞) 為 496.365 ± 37.664 及 485.468±28.592 μg．min/mL。
Table 10 家兔靜脈注射大黃萃取液後大黃素、大黃酸、大黃酚的藥物動 力學參數
IV t1/2β , min AUC0→∞ , μg．min/mL Cl , L/min VDss , L
大黃酸(Rhein)
(16.4 mg/kg) 201.23±26.23 342.733±2.867 0.120±0.001 11.671±1.431 大黃素(Emodin)
(4.35 mg/kg) 297.91±15.04 704.700±16.340 0.016±0.000 5.626±0.120 大黃酚(Chrysophanol)
(2.46 mg/kg) 606.04±86.34 496.365±37.664 0.012±0.001 9.541±0.860
(2)家兔以口服給予大黃萃取液三種劑量後之藥物動力學
六隻家兔經由大黃萃取液口服給藥(一倍劑量: 508.8 mg/kg ; Rhein 16.4 mg/kg、Emodin 4.35 mg/kg、Chrysophanol 2.46 mg/kg ; 五倍劑量:
2544 mg/kg；Rhein 82 mg/kg、Emodin 21.76 mg/kg、Chrysophanol 12.29 mg/kg；十倍劑量: 5088 mg/kg；Rhein 164 mg/kg、Emodin 43.55 mg/kg、
Chrysophanol 24.58 mg/kg)後，經分析所得血漿中大黃酚、大黃酸和大 黃素濃度經時變化數據，如Table 38~49與Figure 23〜28、Figure 31〜36 所示。而六隻家兔之血漿中大黃酚、大黃酸和大黃素平均濃度變化，分 別示於Table 41、45、49及Figure 24、26、28、32、34、36中。觀察各 成分之血中濃度變化，其血中濃度-時間曲線半對數圖符合二室模式，
依檢量線之最低濃度發現大黃酚、大黃酸和大黃素在480分鐘後偵測不
大黃酸(Rhein)(16.4 mg/kg): 以WINNOLIN非室模式及二室模式處 理後約45.00±0.00及30.58±0.28 min.達到平均最高血中濃度(Cmax)，其最高 血中濃度(Cmax)平均約1.809±0.024及1.841±0.056 μg/mL，平均半衰期(t1/2β) 為185.99±22.28及363.49±69.32 min，平均曲線下面積(AUC0→∞)為166.354
±7.336及207.327±13.109 μg．min/mL。
大黃酸(Rhein)(82 mg/kg): 以WINNOLIN非室模式及二室模式處理 後約30.00±0.00及22.90±2.06 min達到平均最高血中濃度(Cmax)，其最高血 中濃度(Cmax)平約2.863±0.059及3.244±0.314 μg/mL。平均半衰期(t1/2β)為 211.47±4.21及213.03±3.62 min，平均曲線下面積(AUC0→∞)為478.6205±
4.171及473.159±5.177 μg．min/mL。
大黃酸(Rhein)(164 mg/kg): 以WINNOLIN非室模式及二室模式處理 後約30.00±0.00及28.41±1.73 min達到平均最高血中濃度(Cmax)，其最高血 中濃度(Cmax)平均約5.333±0.148及5.393±0.112 μg/mL。平均半衰期(t1/2β) 為206.47±5.51及233.65±11.72 min，平均曲線下面積(AUC0→∞)為734.749±
3.717及742.216±8.643 μg．min/mL。
依據口服給藥一倍、五倍、十倍劑量的藥動參數，其平均曲線下面 積(AUC0→∞)亦隨著劑量的增加而成倍數的增加。
據譚力(114)等人實驗口服100 mg於人、Je-Hyun(113)口服給予人100 mg/kg之anthraquinone，平均半衰期為4.08、3.375 hr，其結果與本實驗非 室模式結果較為相近。依蔣心惠(123)等人於家兔口服45.1 g/kg大黃萃取液 之實驗，平均半衰期為28.105 hr，其結果與本實驗非室模式結果差異大。
Table 11 家兔口服大黃酸的藥物動力學參數比較
大黃素(Emodin)(4.35 mg/kg): 以WINNOLIN非室模式及二室模式處 理後約30.00±0.00及20.91±1.43 min達到平均最高血中濃度(Cmax)，其最高 血中濃度(Cmax)平均約1.459±0.050及1.612±0.128 μg/mL。平均半衰期(t1/2β) 為296.28±4.82及292.00±3.37 min，平均曲線下面積(AUC0→∞)為545.465±
6.116及536.309±3.890 μg．min/mL。
大黃素(Emodin)(21.78 mg/kg): 以WINNOLIN非室模式及二室模式 處理後約45.00±0.00及32.30±0.49 min達到平均最高血中濃度(Cmax)，其最 高血中濃度(Cmax)平均約2.390±0.032及2.303±0.010 μg/mL。平均半衰期 (t1/2β) 為 276.51 ± 9.82 及 369.28±6.94 min ， 平 均 曲 線 下 面 積 (AUC0→∞) 為
口服大黃酸 Tmax , min Cmax , μg/mL t1/2β , min VDss , L Cl , L/min AUC0→∞, μg．min/mL 備註 16.4 mg/kg 45.00±0.00 1.809±0.024 185.99±22.28 65.999±6.005 0.247±0.011 166.354±7.336 82 mg/kg 30.00±0.00 2.863±0.059 213.03±3.62 130.672±2.060 0.428±0.004 211.474±4.209 164 mg/kg 30.00±0.00 5.333±0.148 206.471±5.51 166.214±4.159 0.558±0.003 734.749±3.717
45.1 g/kg
大黃萃取液 15.00±00.00 2.045±1.290 1686.3±16.210 299.220±4.019 0.326±0.043 1840.53±4.551 蔣心惠(123) 等人
大黃素(Emodin)(43.55 mg/kg): 以WINNOLIN非室模式及二室模式 處理後約45.00±0.00及32.84±0.16 min達到平均最高血中濃度(Cmax)，其最
大黃素(Emodin)(43.55 mg/kg): 以WINNOLIN非室模式及二室模式 處理後約45.00±0.00及32.84±0.16 min達到平均最高血中濃度(Cmax)，其最