實驗方法

Hippocampus 活體腦切片製備

實驗動物被斷頭犧牲後，迅速將腦取出放置入低溫cutting solution中，該溶液含 有以下成份，經 95 % O2與 5 % CO2 混合氣通氣後，以 1N HCl及NaOH滴定至pH值 7.4。取出的腦切除小腦（cerebellum）、延髓（medulla）、嗅球（olfactory bulb）與 前腦（prefrontal cortex）後，得到 0.5x0.5x1 cm³的腦切塊，用快乾膠把腦塊的小腦切 面黏在microslicer的標本台上。用microslicer（DTK-1000, Dosaka, 日本京都）以冠狀 切法（coronal brain slice）切出厚度 300 µm的brain slice，接著放進裝有人工腦脊液

（artificial cerebrospinal fluid ，ACSF）的燒杯中於室溫下置放一個小時，經 95 % O2

與5 % CO2 混合氣通氣後，以1N HCl及NaOH滴定至pH值 7.4。最後，腦切片在記錄 前靜置於室溫下（23±2 ℃）一個小時（Onodera et al., 2000）。

圖 一 ： 刺 激 電 極 置 於 molecular layer （ ML ） ， 刺 激 perforant pathway 的 axon 釋 放 glutamate ， 作 用 於 dentate granule cell 的 dendrite 。 記 錄 電 極 會 在 granule cell layer（gcl）記錄 granule cell，得到 glutamate 引發的電流。

電生理學記錄：細胞膜片箝制（whole cell patch-clamp）

腦切片移至 recording chamber，該 recording chamber 安置在顯微鏡（BX51, Olympus, Tokyo, Japan）的記錄台上，腦切片浸於 ACSF 中並持續灌流，流速每分鐘 1 至 2 ml，維持於室溫下（23 ± 2℃）。以紅外光顯微鏡（Olympus, Tokyo, Japan）搭 配高倍水鏡（400x）觀察並記錄 hippocampus 下 dentate gyrus 的 granule cell。使用 Axopatch 200B 放大器對該細胞進行全細胞膜片箝制技術（whole cell patch-clamp）記 錄。記錄電極以拉針器（P97, Sutter Instrument, Novato, CA, U.S.A.）用標準硼矽酸玻 璃毛細管（standard-walled borosilicate glass capillaries）拉出。該電極電阻維持在 3-8Ω，並填充含 CsCl 的 internal solution，內含。紅外光顯微鏡將影像投影在顯示器

（JVC, Japan）上，操作 manipulator（ONU-31P, Olympus, Japan）將記錄電極在低倍 下移到 dentate granule cell layer 上，再用高倍水鏡以及給予記錄電極正壓的情形下，

將記錄電極移至 granule cell 上。當釋放正壓時同步給予負壓，便能使細胞膜與記錄 電極形成緊密貼合。此時記錄電極會記錄到極大的電阻，因而稱為 giga seal。接著給 予一個短暫的負壓將細胞膜記錄電極所吸付的小面積細胞膜破壞，使記錄電極內溶液 和細胞質相通，稱為whole cell 形成。Whole cell 形成後，將細胞將膜電位固定在 -70 mV 記錄，用補償消去 70~80%來自 8 ms，-5 mV 引發後產生電流的 onset 和 offset 來 測量 series resistance 和 whole-cell capacitance。突觸電流濾掉 5k Hz 以上的訊號，經 10k Hz 數位化 and 直接用記錄軟體 AxoScope9.0（Axon Instrument）記錄在電腦硬碟 中。全部實驗固定間隔測量 access resistance，並捨棄改變超過 20%的記錄結果。以 填充 3M NaCl 溶液的玻璃電極置於 DG 的 molecular layer（圖四），搭配刺激器（S-48, Grass-Telefactor, W. Warwick, RI, U.S.A.）和 isolation unit（A.M.P.I., Jerusalem, Israel）引發 EPSC。刺激長度為 10 到 50 µs，強度介於 5 到 20 V 間，頻率 0.1 Hz。為 了避免低頻刺激下造成的 synaptic fatigue（Abrahamsson et al., 2005），會於

whole-cell 形成後，連續刺激五分鐘之後再開始記錄。 eEPSC 以平均後電流頂點量測大小，

由給藥前後各取三分鐘分別作為控制組和給藥組（圖五）。

當DG cell 的突觸前 perforant pathway 受到外來電刺激，會在突觸前的 axon 形成 動作電位。動作電位經電位依賴型鈉離子通道延 axon 傳至 axon terminal，使該觸的 電位依賴型鈣離子通道開啟，造成突觸前鈣離子內流，引發胞釋作用（exocytosis）

將 glutamate 釋放到突觸間隙。Glutamate 為 CNS 主要之興奮性神經傳遞物質，其受 體主要可區分為三類：AMPA、NMDA 及 kainate 受體，AMPA 和 NMDA 皆為 ligand 依賴型 ion channel。DG cell 缺乏 kainate 受體，因而排除該受體引發之電流影響

（Epsztein et al., 2005）。Glutamate 結合至受體時，AMPA 受體的 pore 會開啟，造成 鈉離子和鈣離子為主的陽離子通透，產生內流電流，提高細胞膜電位。NMDAg 受體 在生理情形下，除了需藥 glutamate 與 NMDA 受體結合外，也需要 AMPA 受體開啟 導致膜電位提高，使鎂離子離開 pore，NMDA 受體才會開啟。開啟後鈣離子為主的 陽離子通透增加，幫助膜電位提高，最後產生興奮性動作電位。

AMPA受體參與的EPSC（AMPA receptor-mediated EPSC, eEPSCAMPA）可以在含 有GABAA受 體 阻 斷 劑picrotoxin （ PTX, 100 µM ） 和 NMDA 受 體 阻 斷 劑 DL-aminophosphonovaleric acid（DL-APV, 50 μM）的ACSF溶液中而得；NMDA受體參與 的EPSC（NMDA receptor-mediated EPSC, eEPSCNMDA）可以在含有picrotoxin（PTX, 100 µM ） 、 AMPA 受 體 阻 斷 劑 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione （ CNQX, 10 µM），和NMDA受體異位調節劑D-serine（10 μM）的無鎂離子ACSF溶液中，將膜 電位固定在-70 mV 記錄而得。另外，用 50 和 100 ms的兩種刺激間隔來測量paired-pulse ratio（PPR），由第二個EPSC（ms的兩種刺激間隔來測量paired-pulse 2, P2）除以第一個EPSC（ms的兩種刺激間隔來測量paired-pulse 1, P1）而 得，以用來評估藥物作用於synapse的位置（Andreasen et al., 1994）。為了記錄

AMPA 受 體 參 與 的 最 小 EPSC （ AMPA receptor-mediated miniature EPSC, mEPSCAMPA），在ACSF中加入鈉離子通道阻斷劑tetrodotoxin（TTX, 1 µM）、 PTX

（100 µM）和DL-APV（50 µM），不施給電刺激直接記錄而得。

胞外給予AMPA 和 NMDA 的實驗中，我們在 DG 的 molecular layer 給予 AMPA

（10 mM）和 NMDA（10 mM）引發內流電流。AMPA 和 NMDA 每 1.5 分鐘局部給 予。由Picospritzer（General Valve, Fairfield, NJ, USA）對 patch pipettes 施加壓力（玻 璃管尖端直徑1-2 µm，長度 10-50 ms 壓力 5-15 psi，Wuarin Deduk） 。用含有 TTX

（1 µM）， PTX（100 µM）和 DL-APV（50 µM）的 ACSF 溶液記錄 AMPA 受體引 發的內流電流，用含 TTX（1 µM），PTX（100 µM）和 CNQX（10 µM）的 ACSF 溶液記錄 NMDA 引發的內流電流。除胞外給予 AMPA 和 NMDA，其餘藥物和 ACSF 溶液皆經由灌流給予。

結果分析和統計

使用Clampex 9.0 software（Axon Instrument）收集實驗數據。用Clampfit 9.0

（Axon Instrument）分析eEPSC。用Mini Analysis Program version 6.0（Synaptosoft Inc., Fort Lee, NJ, USA）分析mEPSCAMPA。為評估給予藥物前後是否有影響，以給予 藥 物 之 前 的 電 流 大 小 作 為 基 準 ， 將 給 予 藥 物 之 後 的 電 流 絕 對 值 標 準 化

（normalized）。本論文實驗數據以Student’s t-test分析加以運算，實驗數據皆以平均 值±標準差（mean±S.E）表示，在p值小於 0.05 即是為有顯著差異。

圖二：外給刺激及藥物給予時間示意圖。

(1) eEPSCAMPA/NMDA：刺激長度10-20 µs，強度 5-20 V，

頻率0.1 Hz。

(2) Paired-pulse 記錄：P1/P2 刺激間隔 50/100 ms， 刺激 長度10-20 µs，強度 5-20 V，頻率 0.1

(3) mEPSC 記錄：不給電刺激直接記錄。

(4) 胞外給予 AMPA：間隔 1.5-2 mins，長度 10-50 ms，

壓力5-15 psi。

10-15 分 3-5 分 20-30 分

取給藥前五分鐘做控 制組。

給藥3-5 分鐘 藥物產生作用至電流 穩定後，取穩定後五 分鐘作為實驗組。