討論 - Carisbamate（RWJ-333369）在大鼠齒回抑制突觸前麩胺酸釋放

本實驗主要探討具有抗癲癇潛力的藥物 carisbamate（RWJ-333369）是否可以 DG 經由抑制 glutamate 所參與的興奮性訊息傳遞而達到抗癲癇作用。由於 carisbamate 為一新的神經作用藥物，該藥詳細的作用機轉仍不明確，本實驗利用 whole-cell patch clamp 技術，記錄位於 Wistar 大鼠的 hippocampus 活體腦切片中 DG 的 granule cell 上由 glutamate 所引發的電流，藉由使用不同受體的阻斷劑，分離出 AMPA 受體和 NMDA 受體參與之電流，使用 Student’s t-test 分析投予 carisbamate 前後的電流大小變 化。並使用不同的電生理技術，區分藥物的在突觸的作用位置。由於 glutamate 釋放受到鈣離子通道所調控，藉由同時投予鈣離子通道阻斷劑以及 carisbamate 藥物來評估鈣離子通道的作用。

實驗結果顯示carisbamate在perforant pathway-dentate gyrus granule cell突觸展現抑制eEPSCAMPA及eEPSCNMDA的能力，且該抑制作用具有濃度依賴性。而carisbamate

（30 µM, 100 µM）皆抑制eEPSCAMPA和eEPSCNMDA，且有類似的抑制幅度，指向 carisbamate會作用在突觸前抑制glutamate釋放，減少突觸間隙的興奮性神經傳遞物質濃度，因而對glutamate引發之電流有抑制能力。突觸前的短期可塑性PPF來自突觸前

短暫的鈣離子累積，使突觸反應增加。Carisbamate（100 µM）造成的paired-pulse ratio的降低被認為是作用於突觸前使鈣離子濃度降低造成。接著，在TTX存在的情形下，胞外給予AMPA會作用在突觸後AMPA受體上引發內流電流。Carisbamate無法對 AMPA引發之內流電流產生抑制作用，顯示該藥無法直接作用於AMPA受體上，間接解釋carisbamate對eEPSCAMPA所產生的抑制作用來自於突觸前。另外，mEPSCAMPA的電流或頻率可以反應出突觸後藥物對AMPA受體造成改變或藥物作用於突觸前影響造成eEPSCAMPA/NMDA皆受到抑制，表示carisbamate會作用於glutamate系統。

先前報告指出，當glutamate的突觸前釋放受到影響而改變突觸間隙的glutamate濃度時，會以類似比例影響NMDA 及 non-NMDA 參與之 EPSC （ Perkel and Nicoll, 1993）。該實驗在guniea-pig的hippocampus活體腦切片中，記錄CA1 的細胞所得之 NMDA/non-NMDA EPSC 。使用 GABAB受體致效劑baclofen 和 adenosine 拮抗劑 theophylline影響突觸前釋放。GABAB受體致效劑baclofen會對non-NMDA受體參與之

電流及NMDA受體參與之電流產生相近幅度的抑制；theophylline 則會增加glutamate

（Zucker, 1989; Manabe et al. 1993）。其中有許多突觸都會展現PPF的特性，長久以來被認為與突觸前的神經傳遞物質釋放有關，並且與突觸前鈣離子通道或突觸內鈣離子濃度相關（Blitz et al., 2004）。之前實驗證明，在perforant pathway-dentate gyrus的突觸展現PPF的特性。在rat上，以whole-cell patch clamp對hippocampus腦切片的DG進行研究，該研究顯示glutamate釋放所產生的PPF可以在AMPA受體所參與的電流紀錄而得；PPF並不會改變eEPSCAMPA的rise time和decayed time constant；PPF在刺激間隔 100 ms的情形下平均增加電流為 35.7±2.1％，與我們的實驗相近；在連續電刺激小於 350 ms的情形下都會展現PPF；另外，給予baclofen抑制突觸前glutamate釋放並不改變 PPF ratio；給予GABAA受體阻斷劑bicuculline也無法改變PPF ratio。當降低胞外鈣離子濃度時， PPF ratio也會隨之降低（Andreasen et al., 1994）。這些結果除了展示 perforant pathway-dentate gyrus有PPF的特性外，也反應突觸前鈣離子濃度所參與之神

經傳遞物質釋放的改變。Carisbamate在 100 µM情形下會抑制PPF ratio顯示該藥可能透過抑制突觸前機轉產生抑制作用。

AMPA為AMPA受體的選擇性致效劑，單獨給予AMPA會直接作用在突觸後的受體上，使AMPA受體開啟引發內流電流（Lee et al., 2008）。Glutamate受體主要有兩種：ionotropic和metabotropic。前者會形成離子通道影響膜電位傳遞訊息，後者則透 AMPA引發之電流，證明carisbamate對於eEPSCAMPA的抑制作用來自突觸前。

在 TTX 存在的情形下，電位依賴型鈉離子通道受到抑制，此時所記錄得 miniature EPSC 顯示出沒有動作電位的情形下所表現的訊號傳遞。此時所觀察到的電流為 AMPA 受體受到突觸前短暫釋放的 glutamate 作用而開啟的結果。mEPSC 以單一 vesicle 釋放所引發之電流大小為基準成倍數關係。有許多原因會影響 mEPSC 的大小，其中當藥物作用在突觸後 AMPA 受體上產生抑制作用時，會改變 AMPA 受體的對離子的通透性，減少mEPSC 的平均電流大小（Lee et al., 2008）。本實驗結果顯示 carisbamate 不會改變其電流，同樣指出 carisbamate 在 30 µM 或 100 µM 下皆不會作用於AMPA 受體，證明 carisbamate 對 AMPA 受體無法產生作用，與之前的實驗相符。

我們的實驗結果，carisbamate 的抑制作用來自於突觸前的證據包含：一、流。鈣離子內流會導致含有glutamate 進行胞釋作用（exocytosis）（Sudhof, 2004）。

影響突觸前神經傳遞物質是放的可能機轉有下列幾項：道所作用（Dietrich et al., 2003）。鈣離子通道在神經傳遞物質釋放所扮演的角色主要有二：一、鈣離子通道同步開啟引發釋放神經傳遞物質，其過程小於 50 μs；二、鈣離子通道非同步開啟，在動作電位發生後產生自發性開啟，導致神經傳遞物質釋放

（Hagler & Goda, 2001），這兩種情形都需要鈣離子通道參與。鈣離子進入細胞後，

會幫助SNARE（soluble NSF attachment receptor element）protein complex的形成，促進胞釋作用將神經傳遞物質釋放到突觸間隙。因此，調控鈣離子通道或影響細胞內鈣離子濃度會是carisbamate 調控 glutamate 釋放的機轉之一（ Sudhof, 2004 ）。由於

carisbamate經由另一個具抗癲癇作用藥物felbamate修飾而來。同樣為廣效性抗癲癇藥物的felbamate被認為會抑制高電位依賴型鈣離子通道。而先前的carisbamate實驗中指出在預先以鎂離子處理過的hippocampus細胞模型spontaneous recurrent epileptiform discharges（SREDs）上，會觀察到carisbamate具有抑制SREDs的能力。在該實驗中，

會於實驗前24 小時前將培養之SD rats hippocampus細胞預先以低鎂離子的紀錄溶液處理。低鎂離子的紀錄溶液會使NMDA受體過度興奮，影響內鈣離子，造成細胞自發性放電。Carisbamate（100 µM）被認為可以透過調控內鈣離子平衡，抑制這類的自發性放電。Carisbamate有可能透過改變細胞內鈣離子濃度的方式來影響突觸前的 glutamate釋放（Deshpande et al., 2008a,b）。本實驗使用L-type鈣離子通道阻斷劑 nimodipine（10 µM）作為比較，投予nimodipine後會抑制eEPSCAMPA，此時再給予 carisbamate仍會有進一步抑制，顯示carisbamate並非透過L-type 鈣離子通道抑制突觸前釋放。不排除透過其他兩類的鈣離子通道。Carisbamate作用於突觸前是否經過N-和 P/Q type鈣離子通道仍須進一步驗證。

（二）電位依賴型鈉離子通道。除了高電位依賴型鈣離子通道外，動作電位傳遞需要電位依賴型鈉離子通道，才能在axon terminal產生去極化以驅動電位依賴型鈣離子通道（Vautrin and Barker, 2003）。其他實驗指出carisbamate會抑制細胞去極化引發的sustained repetitive firing（SRF），降低引發的spike數量。先前的實驗證明，

phenytoin、carbamazepine、valproic acid和lamotrigine都會抑制SRF，因此該實驗認為 carisbamate 除了影響細胞內鈣離子濃度外，也會抑制電位依賴型鈉離子通道

（Deshpande et al., 2008a,b）。在我們的實驗中，30 µM可以抑制AMPA電流至 78.0±7.1%，而PPR改變在carisbamate 100 µM才有顯著差異。由於PPR主要反應突觸前axon terminal內鈣離子變化，當carisbamate阻斷鈉離子通道而影響glutamate釋放的作用可能不反應在PPR改變中，導致carisbamate在 30 µM可以看到對eEPSC_AMPA/NMDA

產生抑制，卻在高濃度carisbamate（100 µM）才看到降低PPR的作用。有些實驗指

出，mEPSC的頻率會反映出突觸前對於藥物的影響，當藥物作用於突觸前會改變

mEPSC的頻率（Cunningham et al., 2004）；但在某些實驗中，突觸前的抑制作用不 一定會改變mEPSC的頻率（Lee et al., 2008）。在突觸前的axon terminal上幾乎沒有電位依賴型的鈉離子通道，以高電位依賴型的鈣離子通道為主（Vautrin and Barker 2003）。因此TTX存在的情況下鈉離子通道受到抑制，因此高電位依賴型鈣離子通道質釋放（Chen and Roper, 2003），某些抗癲癇藥物被報導會透過 PKC 和 adenylyl cyclase 的活化來影響 glutamate 釋放（DeLorenzo et al., 1977; Maneuf and McKnight, 2001）。之前的實驗顯示，藥物作用在突觸前影響 protein kinase 不會對 mEPSC 的頻率造成影響（Takasu et al., 2008）。因此，carisbamate 對 mEPSC 的頻率沒有影響，

不能排除突觸前抑制glutamate 釋放透過 protein kinase 的機轉而來。

Carisbamate 為一含有 carbamate 官能基藥物，經由另一個具抗癲癇作用藥物 felbamate所修飾。同樣為廣效性抗癲癇藥物的felbamate被認為會調節電位依賴型的鈉離子通道（White et al., 1992; Taglialatela et al., 1996）、抑制高電位依賴型鈣離子電流、在GABAA受體產生異位調節（Rho et al., 1994; Kume et al., 1996）並阻斷NMDA 受體參與的突觸反應（Pugliese et al., 1996）。本實驗中，由於灌流液中加入PTX，抑

制GABAA受體在DG的作用，因此無法觀察carisbamate對GABAA受體的影響。在其他

實驗中，有許多對TLE動物模型具有活性藥物之抗癲癇作用，來自於增加突觸前

GABA釋放或減少周圍GABA再回收（Macdonald and Kelly, 1994），本實驗中不排除 carisbamate的抗癲癇作用包含增強GABA的抑制。另外，本實驗探討carisbamate對胞

症，無法用藥物良好的控制病情（Duncan et al., 2006; French, 2007)。TLE 在難治型癲癇症中相當常見且容易診斷，尤以 hippocampal sclerosis 最為常見（Engel, 1996）。

臨床以及實驗都有許多證據顯示 hippocampus 與癲癇症的相關性，強化該腦區在 TLE 治療上所扮演的角色（Sutula et al., 1989; Babb et al., 1991; Rogawski et al., 1999; Eid et al., 2008）。Carisbamate 除了在不同的癲癇動物模式上展現了廣效的抗癲癇作用，其

中包含TLE 的動物模式，足見該藥物的抗癲癇作用包含 hippocampus 腦區的保護能力

（André et al., 2005; Rogawski, 2006; Bialer et al., 2007; Nehlig et al., 2008）。

DG 在許多研究被證明與 TLE 的形成以及上述所提之 TLE 動物模式具有高度相關。Granule cell 的 axon 稱作 mossy fiber，會投射至 CA3，是 dentate gyrus 唯一的 axonw 投射區域。在 TLE 的病人（de Lanerolle et al., 1989; Sutula et al., 1989; Houser et al., 1990; Babb et al., 1991）以及 TLE 的動物模式皆觀察到 mossy fiber 產生 sprouting 的情形，這些 mossy fiber 的形態改變會於其他的 granule cell 形成興奮性突觸（Dudek and Sutula, 2007）。許多實驗都證明 mossy fiber sprouting 會降低癲癇發作

的閾值且會增加自發性癲癇再發作（Buckmaster and Dudek, 1997）。另外也有實驗證明 TLE 的動物模式下，電生理及免疫組織染色結果顯示 DG 的 interneuron 數量減少，（Sloviter, 1987; Buckmaster and Dudek, 1997; Gorter et al., 2001），其中包含

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