第一節 電流引發之 AMPA/NMDA 參與興奮性突觸後電流具有專一性
Glutamate受體參與之興奮性突觸後電流（eEPSC）可由 whole-cell patch clamp記 錄而得。當細胞與記錄電極形成whole-cell後，實驗所使用之Axopatch 200B放大器可 將 細 胞 膜 電 位 固 定 在 設 定 的 電 位 上 ， 為 全 細 胞 膜 電 位 箝 制 （whole-cell patch clamp）。本實驗將膜電固定在-70 mV，並使用以CsCl為主的細胞內液（internal solution）填充記錄電極，因此在突觸後抑制大多數的電位依賴型鈉離子、鉀離子及 鈣離子。在這樣的系統下，AMPA受體參與之興奮性突觸後電流（eEPSCAMPA）可以 在灌流ACSF含有GABAA受體阻斷劑PTX（100 µM）和NMDA受體阻斷劑DL-APV
（50 µM）的情形下記錄而得。該內流電流可以受到AMPA受體的選擇性拮抗劑 CNQX （ 10 µM ） 所 抑 制 （ 圖 三 A ） 。 NMDA 受 體 參 與 之 興 奮 性 突 觸 後 電 流
（eEPSCNMDA） 則 可 以 在 灌 流Mg2+-free ACSF 含 有 GABAA受 體 阻 斷 劑PTX （ 100 µM）、CNQX（10 µM）和D-serine（10 μM）的情形下記錄而得，NMDA所參與的 內流電流則可以被NMDA的選擇性拮抗劑DL-APV（50 µM）所抑制（圖三B）。證 明本實驗所記錄得之eEPSCAMPA/NMDA各來自單一種類的glutamate受體，可透過此實驗 系統研究藥物對於glutamate系統所造成的影響。
第二節 Carisbamate 抑制 AMPA/NMDA 參與之興奮性突觸後電流
在carisbamate對eEPSCAMPA作用實驗中，以頻率 0.1 Hz的電刺激情形下記錄。此 劑量相關的抑制作用，隨著劑量上升，抑制的程度越大（圖四）。結果顯示，在 carisbamate 100 µM的作用下，會對eEPSCAMPA產生顯著抑制（圖五）。Carisbamate給 予 後 的eEPSCAMPA的 平 均 電 流 改 變 為 控 制 組 的 106.7±11.4% （ 10 µM, n=4 ） 、 78.0±7.1%（30 µM, n=7）、72.7±6.9%（100 µM, n=4）、74.2±5.6%（300 µM, n=4）
其中30 µM、100 µM、300 µM都具有顯著差異（p<0.03, Student’s t-test）（圖八）。
另外，carisbamate也會對eEPSCNMDA產生顯著的劑量相關抑制作用（圖六）。在 carisbamate 100 µM的作用下，會對eEPSCNMDA產生顯著抑制（圖七）。在carisbamate 對eEPSCNMDA作用實驗中，carisbamate給予後的eEPSCNMDA的平均電流改變為控制組 的 87.8±3.9%（10 µM, n=4）、83.1±2.6%（30 µM, n=5）、80.6±4.2%（100 µM, n=6）、77.7±6.1%（300 µM, n=4），其中 30 µM、100 µM、300 µM都具有顯著差異
（p<0.01, Student’s t-test）（圖八）。由於evoked EPSCAMPA/NMDA皆受到carisbamate抑 制，而且在30 µM及 100 µM的 eEPSCAMPA/NMDA並沒有顯著差異（圖九），說明該抑 制作用可能來自於突觸前抑制，並進一步透過其他實驗證明之。
第三節 Carisbamate 高濃度對 paired-pulse ratio（PPR）產生抑制作用
為了要確認carisbamate在突觸的作用位置，以 50 ms或 100 ms成功引發的兩個刺 激所測量計算出的PPR（paired-pulse ratio）來評估。PPR的改變屬於突觸的短期可塑
Manabe et al. 1993）。在給予carisbamate前，paired-pulse刺激所記錄得之eEPSCAMPA
PPR為 1.33±0.05（刺激間隔 50 ms, n=11）和 1.26±0.05（刺激間隔 100 ms, n=9），為 典型的paired-pulse facilitation（PPF），符合先前在DG的實驗所顯示（Andreasen &
Hablitz, 1994; Lee et al., 2008）。在給予carisbamate 30 µM的情況下，不論是刺激間隔 50 ms（1.37±0.11）或 100 ms（1.27±0.11），都沒有看到對PPR造成顯著影響。但是 在給予carisbamate 100 µM的情形下，在刺激間隔 50 ms和 100 ms的情況下，皆產生 抑制PPR的作用（圖十A和圖十一A）。在刺激間隔 50 ms的情況下，PPR抑制到 1.19±0.08（p<0.05）；刺激間隔 100 ms的情況下，PPR抑制到 1.13±0.08（p<0.01），
兩者皆有顯著抑制（圖十B和圖十一B）。這樣的結果顯示carisbamate可能作用在突 觸前產生抑制作用，且此作用只在高劑量展現。
第四節 Carisbamate 無法影響胞外給予 AMPA 引發之電流
為了近一步確認carisbamate的AMPA抑制作用是否來自突觸後， 在膜電位箝制 在-70 mV的情形下，以含有TTX（1 µM）、 DL-APV（50 µM）和PTX（100 µM）的 ASCF灌流下，胞外給予AMPA（10 mM）。由於TTX為一電位依賴型Na+ channel阻 斷劑，可以阻斷突觸前因動作電位引起的glutamate釋放。此時，胞外給予AMPA作用 於AMPA受體上，使該受體通道開啟並產生一內流電流，改變可反映出突觸後的作 用。實驗中，改變Picospritzer的給藥時間長度可以改變內流電流大小，胞外給予 AMPA引發之內流電流大小控制在 60-70 pA間。取carisbamate給予的前後來評估藥物 在突觸後對AMPA受體的影響。結果顯示，carisbamate無法對胞外給予引發的AMPA 內流電流產生抑制作用（圖十二A)。30 µM carisbamate給予後平均電流為原本的 106.2±0.03%（n=4）、100 µM carisbamte給予後為 101.9±0.03%（n=5），都沒有造成
顯著抑制（圖十二B）。該結果間接顯示carisbamate的對AMPA電流的抑制來自突觸 前作用。
第五節 Carisbamate對於mEPSCAMPA的電流大小和頻率皆無影響
為 了 證 明carisbamate 的 作 用 位 置 ， 另 外 記 錄 mEPSCAMPA來 分 析 並 評 估 。 mEPSCAMPA可在膜電位箝制在-70 mV的情形下，含有TTX（1 µM）、 DL-APV（50 µM）和PTX（100 µM）的ASCF灌流下直接記錄而得。在這種條件下，記錄電極在 沒有突觸前電刺激的情形下，會記錄到一些電流大小較小的EPSCAMPA，這是由突觸 前的axon terminal自發性的glutamate釋放，作用在突觸後AMPA受體上造成通道開啟 所致（圖十三）。記錄mEPSCAMPA並分析其數據可以用來評估藥物在突觸前後的作用 位置。在 30 µM的carisbamate下，給藥前的mEPSC平均電流大小為 9.48±0.39 pA
（555 次），給藥後為 9.05±0.47（582 次），並沒有顯著的改變（student test及KS-test： P>0.05）（圖十四）；在 100 µM的carisbamate下，藥前的mEPSC平均電流大小 為8.05±0.85（245 次），給藥後為 7.95±0.77（218 次），如同低濃度下，電流大小並 無顯著改變（student test及KS-test： P>0.05）（圖十五）。此結果符合之前實驗所觀 察到結果，carisbamate無法直接影響AMPA受體。另外，在 30 µM的carisbamate下，
給藥前的平均頻率為 0.35±0.05 Hz，給藥後為 0.42±1.1 Hz；在 100 µM的carisbamate 下，給藥前的平均頻率為 0.26±0.07 Hz，給藥後為 0.23±0.07 Hz（圖十六）。兩個濃 度對mEPSC的頻率皆無明顯變化。
第六節 Nimodipine 無法遮蔽 carisbamate 在突觸前產生的抑制作用
突觸前的axon terminal含有高電位依賴型鈣離子通道，可以感受動作電位產生的 去極化而開啟，導致鈣離子流入，引發突觸前glutamate釋放。由於paired-pulse ratio改 變被認為反應突觸前細胞內鈣離子濃度，因此本實驗選用其中一種高電位依賴型鈣離 子通道：L-type鈣離子通道阻斷劑nimodipine。10 µM的nimodipine會對eEPSCAMPA產 生抑制（圖十七），抑制後的平均電流大小為控制組的0.82±0.04％（n=4,
p<0.01），一段時間後給予carisbamate 100 µM仍會展現抑制作用，carisbamate抑制後 的平均電流大小為控制組的0.63±0.09％（p<0.05）（圖十八）。由於nimodipine無法 遮蔽carisbamate在突觸前產生的抑制作用，我們認為L-type 鈣離子通道並不是
carisbamate的作用位置。