實驗方法

一、細胞培養（cell culture）：

1. 試劑：

（1）培養液（RPMI-1640）

培養細胞的培養液為 RPMI-1640，將一單位的 RPMI powder 和2.0 g 的 NaHCO₃及5.957 g 的 HEPES 溶於滅菌後的二次水 中，將pH 值調至 7.4。在無菌操作台中，以 0.22 μm 的濾膜過 濾後分裝，保存於4℃。

（2）培養液添加物

小牛的血清白蛋白（fetal bovine serum，FBS），購自 Hyclone 或 Sigma，保存於-20℃，培養液中目標濃度為 10%。

（3）Penicillin-Streptomycin（10X；10000 unit/ml-10 mg/ml），購自 Sigma，保存於-20℃，培養液中目標濃度為 1%。

（4）L-Glutamine（10X；200 mM），購自 Sigma，保存於-20℃，培 養液中目標濃度為 1%。

（5）1X PBS（phosphate balanced solution）

以8 g NaCl、1.2 g NaH₂PO₄．H₂O 加二次水配製，將其 pH 調 成7.4 後補二次水到 1L，滅菌後保存於 4℃。

（6）冷凍培養液

以 2 ml 的 DMSO 加上 8 ml 的 RPMI （只添加 P-S 與 L-Gln, 無含血清）配製成 20% DMSO，若無使用完可存放於-20℃保 存。冷凍培養液，以2.5 ml 的 20% DMSO 與 fetal bovine serum 2.5 ml 混合，最後的 DMSO 濃度為 10%。

2. 步驟：

（1）細胞分盤（subculture）

細胞培養於RPMI medium（10% FBS、1% P-S、1% L-Gln）中，

放置於細胞培養箱（37℃，5% CO2），待細胞成長約八至九分 滿時，進行分盤培養。分盤時將舊的培養液吸掉，以回溫後之 1X PBS 約 3~5 ml 沖洗細胞，共二至三次，將死去的細胞去 除。再加入8~10 ml 回溫後的培養液，將細胞全部沖下來，並 吸放數次直到均勻沖散細胞以1：3 或 1：4 的比例分盤培養。

（2）冷凍細胞

冷凍細胞前一天需更換成新鮮的培養液。培養好約八分滿的細 胞，將舊的培養液去除，再用3~5 ml 之 1X PBS 沖洗細胞，約 二至三次。用8~10 ml 的培養液，將細胞全部沖下來，再將細 胞液吸取置於50 ml 離心管，以 1000 rpm，10 分鐘之離心條件

將細胞沉澱下來。然後去除上清液，以1 ml 冷凍培養液將細 胞打散，置於冷凍管中，先存放於 4℃冰箱 30 分鐘，再移置 於-80℃冰箱，12 小時之後再存放於液態氮桶。

（3）解凍細胞

由液態氮桶中取出細胞，將細胞溶於適量的RPMI 培養液，離 心2000 rpm，5 分鐘。倒掉舊的 RPMI 培養液，再用 10 ml 的 RPMI 將細胞打散，放置隔天細胞貼附後再換培養液，觀察約 一個禮拜等細胞狀況穩定後再做實驗。

二、收集細胞 lysates：

1. 試劑：

主要溶液Lysis buffer（RIPA buffer），以 4.38 g NaCl、3.0285 g Tris-base、1.25 g Deoxycholate、5 ml IGEPAL CA-630（相當的粘稠，

要緩慢的取出）來配製，以上藥品溶於適量的二次水後，將配成 pH 值為7.4，500 ml 溶液，高溫高壓滅菌後保存於 4℃，用以將細胞裂 解。當要收集細胞，再配置成modified RIPA buffer，內含蛋白質水 解酶抑制劑。若要配製成1 ml，則需要 1 ml RIPA buffer、5 μl 之 200 mM Sodium orthovannadate（final conc.= 1 mM）、5 μl 之 200 mM EGTA（final conc. = 1 mM）、5 μl 之 0.5% Aprotinin（final conc. =

0.0025%）、5 μl 之 200 mM PMSF（final conc. = 1 mM）。Sodium orthovannadate 是 phosphatase inhibitor，EGTA 是鈣離子的螯合劑，

Aprotinin 是 serine protease inhibitor，PMSF 也是 serine protease inhibitor。如實驗需求亦可多追加一倍的抑制劑。

2. 步驟:

先測量整體medium 重量，取 1 ml medium 保存起來，以利往後 對於分泌型蛋白的實驗。去除舊的medium 後，以 1X PBS 清洗兩至 三次，將PBS 吸乾以免影響蛋白質濃度。再加入適量 modified RIPA buffer（視細胞的滿度而定，滿盤的細胞約用 800 至 1000 μl），接著 用刮杓將細胞刮下（冰上操作），後置於eppendorf。再把 eppendorf 在 rack 上刮動，來回 3~5 次以幫助裂解細胞。以 4℃、10000 rpm，離 心10 分鐘後取上清液到新的 eppendorf，接著定量並且 denature 後直 接進行Western blot，若需存放則置於-80℃冰箱。

三、蛋白質濃度測定：

1. 試劑：

BSA 1 μg/μl，Protein Assay Kit

2. 步驟:

首先配製BSA 1 μg/μl 作為製作標準曲線之用，配製含不同濃度 的BSA 溶液 800 μl（例如配置濃度間隔 5，0~30 μg BSA），再加入 200 μl Protein Assay Kit（dye），混合均勻後靜置10 分鐘。各別取 200 μl，加入 96 孔盤中，避免氣泡產生影響吸光值，再以 ELISA reader 來測定 595 nm 波長的吸光值，劃出標準曲線（R-squared＞0.99）。

在樣品的測定上，取10 μl 的 cell lysate，加入 790 μl 的二次水與 200 μl 的 protein assay kit（dye），混合均勻後靜置 10 分鐘，取 200 μl 加 入96 孔盤中以 ELISA reader 測定 595 nm 的吸光值。將所得的吸光 值帶入標準曲線求得原樣品的濃度。

四、蛋白質電泳（SDS-PAGE）

1. 試劑:

（1）30% Acryamide/0.8% bisacryamide

配 置 方 法 為 150 g Acryamide 與 4 g N’N’- methylene bisacryamide 溶 於 二 次 水 中 ， 可 配 置 成 500 ml 的 30%

Acryamide/0.8% bisacryamide，避光保存於 4℃。這是電泳過程 中分離蛋白質的介面之用。

（2）Tris-base（2 M , pH 8.8, pH 6.8）

配置方法為，以121.14 g Tris-base 溶於適量二次水中，再配製 成500 ml pH 8.8 或 6.8 的溶液，保存於 4℃。Tris 在電泳的過 程當中主要扮演調整pH 值的角色。上層 pH 6.8 的中性環境可 讓glycine 帶正電，讓電泳時蛋白移動緩慢以達到 stacking 的功 能，而下層pH 8.8 的鹼性環境有助於分離含 SDS 的負電蛋白。

（3）10% APS 與 TEMED

配置方法為1 g APS，溶於 10 ml 二次水，配製的目標濃度為 10% APS，保存於-20℃。在 acryamide 與 bisacryamide 作用的 過程中，APS 扮演著催化的角色，而 TEMED 則扮演輔酶的角 色，TEMED 則是購買自 Sigma 的藥品，保存於 4℃。

（4）10X sample buffer

配製方法為1 ml 的 1M Tris-HCl pH 6.8、5 g SDS、25 g sucrose、

10 mg bromophenol blue、5 ml 2-mercaptoethanol 溶於二次水，

再加二次水至500 ml，保存於室溫。SDS 的作用在於使蛋白質 帶 負 電 ，sucrose 可 使 整 個 樣 品 溶 液 黏 稠 不 易 飄 散 ， β-mercaptoethanol 有助於打斷雙硫鍵幫助變性，而 bromophenol blue 可用來調整溶液的顏色以方便樣品注入。Sample buffer 目 的在於混合樣品後有助於denature，且讓蛋白帶負電性。

（5）5X running buffer

配製方法為7.5 g Tris-base、36 g Glycine、2.5 g SDS，溶於水 配製成 500 ml，保存於室溫，使用前再稀釋成 1X running buffer。主要為電泳過程中通電的介質，其中藥品的比例會影 響到整個電泳過程的穩定度。

（6）Resolving gel（8%）

配製方法為15.8 ml 之二次水、6 ml 之 2 M Tris- base （pH 8.8）、8 ml 之 30% Acryamide/0.8% bisacryamide、150 μl 之 20%

SDS、150 μl 之 10% APS、20 μl 之 TEMED。

（7）Stacking gel

配製方法為 8 ml 之二次水、0.625 ml 之 2 M Tris-HCL（pH 6.8）、1.33 ml 之 30% Acryamide/0.8% bisacryamide、50 μl 之 20%SDS、50 μl 之 10% APS、10 μl 之 TEMED。

2. 步驟:

將兩塊玻璃板、兩條 spacer 及灰色夾組合成一個製膠架，然後 利用黑色旋鈕固定在底座。將下層膠（resolving gel）配方所需的藥 劑依序加入燒杯，混合攪拌均勻，利用 pipette 加進製膠架中至適當 位置。以75%酒精加滿，利用不同極性的溶液來使 gel 平整，待凝膠

（約25 分鐘）。將酒精倒掉，插入間格髮梳（comb），將上層膠（stacking gel）配方所需的藥劑依序加入燒杯。攪拌均勻，利用 pipette 加到製 膠架中至適當位置。等上層膠凝固之後（約25 分鐘），將 comb 拿走，

倒入上、下層各250 ml 1X running buffer。將 sample 定量完和 10X sample buffer（10:1）混和均勻後，以乾式加熱器煮沸 5 分鐘，然後 稍微離心一下，用micropipette 把樣品注入 well 中，進行膠體電泳法

（50 V、20 mA，約時間 18 小時；90 V、22 mA，時間 12 小時）。

五、Western blot analysis：

1. 試劑:

（1）Transfer buffer

配製方法為以1.5 g Tris-base、7.2 g Glycine、0.5 g SDS、100 ml Methanol 溶入二次水配製成 500 ml，保存於室溫。通常一次可 配大量保存，過程中會有許多氣泡以及少許的放熱。

（2）Blotting buffer

配製方法為以5 ml 10X TBS、1.5 g BSA、25 μl Tween 20 補二 次水至 50 ml，保存在 4℃。主要用來將轉印後的 PVDF 膜做 blocking 的動作，以免會有抗體非專一性的辨識。由於 BSA 是

（3）10X TBS and washing buffer

配製方式為30.3 g Tris-base 與 43.83 g NaCl 溶於二次水後，pH 調成7.4，再補水至 500 ml，保存於室溫。TBS 主要用來調整 blotting buffer 與 washing buffer 的 pH 值，Washing buffer 則是 以50 ml 的 10X TBS、500 μl Tween 20（1%）加二次水到 500 ml，主要的功能在洗去非專一性不緊密連接以及未連接的抗 體。

2. 步驟:

剪取適當大小的 PVDF transfer membrane（14.5×12.5 ㎝），以 methanol 浸泡約 30 秒後，再以二次水浸泡 2 分鐘。濾紙使用前浸泡 transfer buffer，依順序三張濾紙、gel、PVDF、三張濾紙，利用 semi-phor transblotter 將下層膠中的蛋白質 transfer 到 PVDF transfer membrane

（25V、300 mA，1.5 小時）。之後將PVDF transfer membrane 取出，

浸泡於適量的blotting buffer 中，在室溫下置於 shaker 上 preblotting 2.5 小時（shaker 擺動速度：5rpm），進行 blocking 的動作。之後將 blotting buffer 倒掉，加入適量含有 primary antibody（依不同抗體有 不同稀釋倍數）的 blotting buffer，於 4℃下 overnight。隔天取出之 後，在室溫下先置於shaker 上作用 30 分鐘（shaker 擺動速度：5rpm），

再以適量 washing buffer 清洗 membrane 三次，5 分鐘、5 分鐘、10 分鐘（shaker 擺動速度: 30 rpm）。加入適量含 secondary antibody 的 blotting buffer（依不同抗體有不同稀釋倍數），室溫 blotting 1.5 小時

（shaker 擺動速度: 5 rpm）。再以適量 washing buffer 清洗 membrane 五次，5 分鐘、5 分鐘、10 分鐘、15 分鐘、15 分鐘（shaker 擺動速 度: 30 rpm）。依 membrane 大小（0.125 ml/cm²），加入適量的ECL kit solution I 與 II 等比例的均勻混和液。在 membrane 與之作用 5 分鐘 後，以X-ray film 感光。

六、細胞移動性分析（cell migration assay）

1. 準備物品：

（1）48-well Boyden chamber，必須以清潔劑清洗過後晾乾。

（2）Polycarbonate filter（8 μm），分有正反兩面，正面光滑而反面 粗糙，正面朝上反面朝下，當細胞穿透後會被吸附在反面上，

再以染色觀察細胞。

（3）Trypan blue，可以將死細胞染色，被染到的死細胞呈現藍色而 活細胞則呈現透明無色。

（4）甲醇（約 20 ml），主要功能為固定細胞用。

（5）Giemsa stain reagent（約 20 ml），細胞染色用，染到的細胞呈

現紫紅色或深紫色。另外還需準備血球計數器來計算細胞量。

2. 步驟：

細胞先分盤至6 cm culture dish，根據實驗組別，依時間處理藥 劑後準備開始實驗。收取1 ml 的培養液，方便做分泌型蛋白的測試。

以1X PBS 清洗細胞 3 次，每次 3 ml，之後以適量的 serum free 的 RPMI medium 將細胞沖下打散。取 20 μl 細胞加入 20 μl 的 trypan blue

（1:1）進行細胞計數，將細胞濃度調整至 2×10⁴個/50 μl。取出 48-well Boyden chamber，在 lower chamber 中，每個 well 放入 30 μl 含有 10 % FBS 的 RPMI medium。之後再依序將橡膠墊片，polycarbonate filter

（8 μm）及 upper chamber，以對稱的方式鎖緊 chamber。polycarbonate filter 為了方便辨識正反面，在膜上右邊做個截角。在 upper chambe 中，每個well 放入 20000 個細胞，最後再以保鮮膜包住整個 48-well Boyden chamber，放置於 37℃，5% CO2 細胞培養箱中，使細胞進行 爬行實驗5 小時。取出 48-well Boyden chamber 之後，依序分解，將 polycarbonate filter 正面朝上浸泡於 20 ml 甲醇中 10 分鐘，進行細胞 固定。固定完的polycarbonate filter 以反面朝上的方式放在乾淨的地 方風乾。之後做細胞染色的步驟，將polycarbonate filter 浸泡於 20 ml 的Giemsa stain reagent 1.5 小時，再以 d.d H2O 將染色退去，待退染

完成後，將polycarbonate filter 固定於載玻片上，利用顯微鏡（400X）

觀察細胞爬行狀況，並將其量化作圖。

七、腹腔巨噬細胞製備及培養

1. 事前準備:

50 ml 離心管，把剪刀、針筒、針頭、塑膠 dropper 用資料袋封好，

照UV overnight。並準備手套、衛生紙、酒精、剃毛刀、感染性垃 圾袋。

2. 步驟:

將4-6 weeks 的 SD rat（約 250~300 g）做腹腔注射，打入 3%之 Brewer thioglycolate medium，每隻 10 ml。C57BL/6 和 C57BL/6 inducible nitric oxide synthesized knockout mice，每隻打 1 ml。誘發腹 腔的巨噬細胞聚集。4 天後，方可實驗。實驗前先將 37℃回溫過的 PBS 分裝到 50 ml 離心管內，並把所有東西準備齊全後，將滅菌後的 物品放入laminar flow。使用 laminar flow 前以酒精消毒桌面，並以 噴過酒精的衛生紙平鋪於桌面上，待實驗物品放入後照 UV 30 分 鐘。之後前往犧牲老鼠，以 CO₂處理犧牲老鼠後將腹部的毛剃光，

將4-6 weeks 的 SD rat（約 250~300 g）做腹腔注射，打入 3%之 Brewer thioglycolate medium，每隻 10 ml。C57BL/6 和 C57BL/6 inducible nitric oxide synthesized knockout mice，每隻打 1 ml。誘發腹 腔的巨噬細胞聚集。4 天後，方可實驗。實驗前先將 37℃回溫過的 PBS 分裝到 50 ml 離心管內，並把所有東西準備齊全後，將滅菌後的 物品放入laminar flow。使用 laminar flow 前以酒精消毒桌面，並以 噴過酒精的衛生紙平鋪於桌面上，待實驗物品放入後照 UV 30 分 鐘。之後前往犧牲老鼠，以 CO₂處理犧牲老鼠後將腹部的毛剃光，