一、Src family kinase 參與在 CpG 誘發的巨噬細胞移行中
在過去的文獻中指出 CpG 透過 TLR9 的辨識而產生一連串的免 疫反應。細胞移行為巨噬細胞重要功能之一，而 Src 在過去的認知 中，參與在癌症細胞增生及轉移過程。所以我們想知道 Src 在 CpG 誘發的細胞移行能力中所扮演的角色。使用Raw264.7 巨噬細胞，在 加入CpG 或 nCpG 前 20 分鐘先加 PP2（10 μM）處理，經 48 小時後 再比較各組細胞移行的能力。由Fig. 1A，我們發現在加入 CpG（0.3 μg/ml）的組別中，細胞移行的能力明顯較未加藥及 nCpG（0.3 μg/ml）
組別多；但在合併PP2 處理下，可發現原本 CpG 誘發的細胞移行的 能力會被PP2 所抑制，而 PP2 為 Src family kinases 的抑制劑。這樣 的結果也透露Src family kinases 可能參與在 CpG 誘發的細胞移行中。
因為Src family kinases（SFKs）為 nonreceptor tyrosine kinases，
而 酪 氨 酸 （tyrosine ） 磷 酸 化 可 牽 動 肌 動 蛋 白 細 胞 骨 架 （ actin cytoskeleton）重組，導致細胞延伸（cell spreading）、黏附（adhesion）
和移動（motility）等 [48]。所以我們進一步去看在巨噬細胞受 CpG 的刺激下，酪氨酸磷酸化的情形。而由 Fig. 1B 可以得知，在 CpG 刺激下，酪氨酸磷酸化的增加量大於未處理及nCpG 組別。
二、Raw264.7 巨噬細胞在 CpG 的刺激下會增加 Src 的表現量 進一步我們想知道到底是哪個 Src 家族成員參與在 CpG 引發的 巨噬細胞移行。根據過去的文獻，我們知道許多細胞會表現Src，而 Lyn、Fgr 和 Hck 是巨噬細胞中表現最多的 SFKs [34]。所以我們使用 Raw264.7 巨噬細胞加入 CpG 或 nCpG（0.3 μg/ml）處理 48 小時後分 析Lyn、Fgr 和 Hck 的蛋白表現量。由 Fig. 2A 可知 CpG 刺激後只有 Src 量表現增加，而 Lyn、Fgr 和 Hck 的蛋白量無論有無加藥處理皆 沒有很大的差異。
另外，我們用不同的 CpG 濃度處理 Raw264.7 細胞，其濃度分 別為0.01、0.03、0.1、0.3、1、3（μg/ml）。由 Fig. 2B 可知隨著濃度 的增加，Src 的表現量也隨之增加；在 CpG 濃度為 0.3 μg/ml 時，Src 表現量增至一個穩定值。以CpG 0.3 μg/ml 處理 Raw264.7 細胞不同 時間，我們同樣可發現 Src 在 CpG 的刺激下其蛋白會隨時間的增加 而增加（Fig. 2C）。由於 CpG 處理 48 小時後的 Src 表現量最大，所 以後續的實驗所選擇CpG 的濃度為 0.3 μg/ml，時間為 48 小時。
三、老鼠腹腔巨噬細胞在 CpG 的刺激下會增加 Src 的表現量和細胞 移行
我們在巨噬細胞的細胞株中發現 Src 參與在 CpG 所誘發的細胞 移行。同時我們也想知道類似的現象是否也在活體巨噬細胞中發 生，所以我們以腹腔注射的方式將TG（thioglycolate）注入老鼠（rat）
腹腔，使巨噬細胞聚集。四天後，以 CO2將老鼠犧牲所取得的腹腔 巨噬細胞（peritoneal macrophages；PEMs），我們以 CpG 或 nCpG 0.3 μg/ml 處理 48 小時後觀察其 Src 的表現量和細胞移行的能力。相較 於未加藥和nCpG 組別，CpG 會增加 PEM 的移行能力（Fig. 3A），
而在Src 表現增加的同時，Lyn 的表現並無變化（Fig. 3B）。iNOS 在 此做為巨噬細胞活化的 positive control。由上述結果可知 CpG 所誘 發的Src 增加及細胞移行不僅發生在巨噬細胞的細胞株上，同時也可 見於活體的巨噬細胞。
四、Src 參與在 CpG 誘發的巨噬細胞移行中
接下來我們想確認 Src 在 CpG 誘發的細胞移行過程的上扮演的 角色。首先我們用 src siRNA 細胞去探討在 Src 表現量下降時，CpG 誘發巨噬細胞的移行是否受到影響。Raw 細胞和 control 組別在 CpG 刺激後，細胞移行能力增加。但 CpG 刺激後的 src siRNA 細胞
（siRNA-1，siRNA-2），其移行能力相較於 Raw 細胞和 control 組別 明顯減少。雖然CpG 誘發的 Src 在 siRNA-1 及 siRNA-2 細胞中表現 減少，但Lyn 的表現並無變化（Fig. 4A）。所以 Src 在 CpG 引發的細 胞移行扮演重要的角色。
但我們不能排除 siRNA 非特異性的因素，所以我們再將 Src 放 回去 src siRNA 細胞中，去看當 Src 表現恢復後是否也能恢復原本減 少的細胞移行能力。我們比較siRNA-1 及 siRNA-2 細胞和 Raw 細胞 組別，發現在 siRNA-1 和 siRNA-2 細胞中，當 Src 表現量下降，同 時細胞移行能力減弱。但當將 Src 放回去 siRNA-1 (siRNA-1/Src6，
siRNA-1/Src15) 細胞時，可以發現不僅 Src 表現量增加，同時細胞 移行能力也增加了（Fig. 4B）。所以在此我們證明了Src 在 CpG 誘發 巨噬細胞移行能力中的重要地位。
五、在巨噬細胞中在 CpG 的刺激下，增加的 Src 表現量和細胞移行 移行能力是透過 TLR9-dependent 的機制
根據2006 年 JCB 的文獻指出 CpG 誘發的酪氨酸（tyrosine）磷 酸化可經過 TLR9-independent 的機制 [49]。而 Src 為 nonreceptor tyrosine kinase，所以我們也想知道 CpG 誘發的 Src 和細胞移行能力 到底是為TLR9-independent 或是 TLR9-dependent 的路徑。為回答這 個問題，我們使用 Raw264.7 巨噬細胞，在加入 CpG 或 nCpG 前 30 分鐘先加 chloroquine（10 μM）或 quinacrine（1μM ）處理，經 48 小時後再比較各組總體蛋白的酪氨酸磷酸化。我們發現CpG 處理下 的 總 體 蛋 白 酪 氨 酸 磷 酸 化 增 加 ， 但 在 合 併 處 理 chloroquine 或 quinacrine 後細胞的總體酪氨酸磷酸化下降（Fig. 5B）。同時在TLR9 抑制劑處理下所 CpG 誘增之 Src 的表現量減少而細胞移行受抑制
（Fig. 5A）。所以我們認為在長時間 CpG 刺激下所增加的細胞移行 與Src 的表現量主要循 TLR9-dependent 的路徑。
六、1400W 和 ODQ 可抑制 Src 表現量和巨噬細胞移行能力
另外，本實驗室發現在 iNOS knockout 老鼠腹腔的巨噬細胞經 LPS 刺激後，Src 的表現量減少，同時細胞移行能力也下降；而在加 入NO donor 和 NO 下游產物 cGMP 的類似物 8-br-cGMP 後，發現可 恢復 Src 的表現量和細胞的移行。所以 iNOS 和其下游產物 NO 及 cGMP 被證實了可以調節 LPS 誘發的 Src 和細胞移行能力。有了這 樣的結果，我們也想知道是否 iNOS 也影響 CpG 誘發的 Src 和細胞 移行能力。為了回答這個問題，我們先以1400W（iNOS 的抑制劑），
和其下游產物sGC 的抑制劑 ODQ 去處理 Raw264.7 細胞，再觀察其 對CpG 所引發的 Src 表現和細胞移行有無影響。我們發現 CpG 所誘 增的Src 的表現量（Fig. 6B）和細胞移行能力（Fig. 6A）在 iNOS 和 sGC 的抑制劑的處理下皆減少了，所以 iNOS 和 sGC 參與在 CpG 誘 發Src 的表現量和巨噬細胞移行能力中。
七、CpG 處理巨噬細胞後 Src 表現量和移行能力的增加需要 iNOS
進一步我們用iNOS knockout 的老鼠證實 iNOS 的角色。在“野 生型＂組別（wild type），CpG 處理後整體蛋白的酪氨酸磷酸化增加，
但是在iNOS 不存在下，這個現象就不見了（Fig. 7B）。經 CpG 處理 後 iNOS-/-巨噬細胞其 Src 的表現量減少的同時，細胞移行能力也明 顯下降（Fig. 7A）。因此我們認為巨噬細胞中 Src 表現量及細胞移行 的增加，不獨見於 LPS 刺激，也見於 CpG 處理。所以在 CpG 誘發 的Src 的表現量和巨噬細胞移行能力中是需要 iNOS 的。
綜合上述實驗結果，我們認為巨噬細胞在長時間 CpG 的刺激 下，Src 表現量的增加是透過 TLR9-dependent 的機制，而影響巨噬 細胞移行。我們也證明了 iNOS 是 TLR9-dependent 的路徑中的關鍵 蛋白，其活性牽動Src 的表現與巨噬細胞的移行能力。所以 iNOS 對 於Src 的表現和巨噬細胞的移行能力是不可或缺的。