第二章 實驗材料及方法（Materials and Methods）
第一節 實驗材料
一、細胞：
本實驗所用到的細胞 Raw264.7，其為老鼠巨噬細胞株（murine macrophage-like cell line），此株細胞來自於 ATCC（American Type Culture Collection），並且經過v-Abl（abelson）transform。而製作 src siRNA（siRNA-1 和 siRNA-2）細胞和做為對照組非特異性 siRNA
（Ctrl）的細胞則是利用 Raw264.7 巨噬細胞，使用 transfected plasmid DNA pLKO.1-msrc（puro），其目標序列（targeted sequence）為 5’-CGAGCCGCCAATATCCTAGTA-3’或 negative control 的 pSilencer plasmid（其包含的序列在老鼠的基因上不會表現，為 Ambion Ins 所 提供），經由 Lipofectamine invitrogen 的方式，再由 puromycin 或 hygromycin 篩選得到 Src siRNA 細胞。而將 Src 再放回 Src-attenuated 細胞是用 Raw264.7 細胞表現 src siRNA 再 co-transfected pBabe
（hygro）DNA 和 DNA encoding avian c-Src [47]以 hygromycin 篩選 後得到。
活體老鼠之巨噬細胞（rat peritoneal macrophages），簡稱為PEM 細胞，取自於公的 SD rat 或 C57BL/6 老鼠的巨噬細胞，利用 TG
（thioglycolate）注射至老鼠腹腔，使其巨噬細胞聚集，再以 PBS 反 覆沖出細胞後收集。
二、動物：
使用的動物有SD rat，約 250 g 五到七週大之公鼠，訂購自財團 法 人 國 家 實 驗 動 物 中 心 。 另 外 C57BL/6 inducible nitric oxide synthesized knockout（C57BL/6-NOStm1Lau）mice，約 20 g，自行繁殖 於無特定病原（specific pathogen free）環境中，iNOS knockout mice 有正常發育，外觀及標準之顯形（phenotype）。
三、試劑：
1. CpG ODN 1826和control CpG ODN 1826
CpG ODN 1826 為 合 成 之 oligonucleotide ， 含 為 甲 基 化 CpG dinucleotides序列，5’- tcc atg acg ttc ctg acg tt -3’共20 mer，為murine TLR9 ligand ， 在 分 類 上 為 K （ CpG-B ）。 以 200 μg 溶 於 1 ml endotoxin-free water 配 製 為 stock concentration 200 μg/ml ， final concentration 0.3 μg/ml。此藥品購自於Invivogen，保存於-20℃。另 外，ODN 1826 control又稱nCpG，作為negative control，其序列為5’- tcc atg agc ttc ctg agc tt -3’，相同的為20 mer，因為將cytosine和
guanine位置對調使其不具活性。
2. PP2
取1 mg 的PP2 溶於5 ml 之DMSO中，配製為stock concentration 20 μg/ml，final concentration 10 μM。藥品購自於Merck，保存於-20
℃。
3. Chloroquine diphosphate salt
取 10 mg 之 chloroquine 溶於 pH 值 4-6 之溶液中，配製為 stock concentration 5 mM，final concentration 10 μM。此藥品對光敏感須 避光，購自於Sigma，保存於室溫下。
4. Quinacrine dihydrochloride
取 5 mg 之 quinacrine 溶於滅菌後之二次水中，配製為 stock concentration 0.5 mM，final concentration 1 μM。此藥品對光敏感須 避光，購自於Sigma，保存於室溫下。
5. 1400W
取 10 mg 之 1400W 溶於 PBS 中，配製為 stock concentration 10 mM，final concentration 100 μM。此藥品購自於 Sigma，保存於-20
℃。
6. ODQ
取 5 mg 之 ODQ 溶於 DMSO 中，配製為 stock concentration 50
mM，final concentration 100 μM。此藥品購自於 Sigma，保存於-20
℃。
四、抗體
1. 購自 Sigma：
Anti-actin（anti-actin mouse monoclonal antibody），保存於-20℃，
抗體比例1:5000~10000。
2. 購自 Upstate：
Anti-iNOS（anti-iNOS rabbit polyclonal antibody），保存於-20℃，
抗體比例1:1000~2000。
3. 購自 Abcam：
Anti-COX-2（anti-COX-2 rabbit polyclonal antibody），保存於-20
℃，抗體比例1:5000。
4. 購自 Santa Cruz：
（1）Anti-Lyn（anti-Lyn rabbit polyclonal antibody），保存於 4℃，抗 體比例 1:1000。
（2）Anti-Hck（anti-Hck goat polyclonal antibody），保存於 4℃，抗
體比例 1:500。
（3）Anti-Fgr（anti-Fgr rabbit polyclonal antibody），保存於 4℃，抗 體比例 1:200。
（4）pTyr（HRP-conjugated mouse pTyr monoclonal antibody），保存 於 4℃，抗體比例 1:1000。
5. 購自 Jackson：
（1）HRP-rabbit anti-goat antibody，保存於-20℃，抗體比例 1:2000
~3000。
（2）HRP- goat anti-mouse antibody，保存於-20℃，抗體比例 1:5000。
（3）HRP-goat anti-rabit antibody，保存於-20℃，抗體比例 1:5000。
6. Anti-Src（anti-Src mouse monoclonal antibody），特別感謝由台灣台 南成功大學呂增宏教授實驗室提供，保存於 4℃，抗體比例 1:200。
以上抗體稀釋後皆保存於-20℃。
五、實驗儀器與耗材：
儀器 廠牌
Centrifuge Eppendrof 5424
Centrifuge Beckman Allegra
Hemacytometer BOECO Hoefer semiPhor Pharmacia Biotech
TE70PH meter JENCO 6071 Power supply EPS 1001 pH meter JENCO 6071
Shaker TKS RS01
Vortex GENIE SI-2 G560 Universal Microplate
Spectrophotometer
BIO-TEK
Automated Strip Washer BIO-TEK
Stirrer/Hot plate CORNING PC640 Vertical slab gel unit Hoefer SE400 Vortex GENIE SI-2 G560 Water bath TKS ZX-400
Boyden chamber Neuro probe
耗材 廠牌
Protein Assay Kit Bio-Rad Polycarbonate filter（8 μm） Neuro probe PVDF transfer membrane NEN
X-15RDigital analysis system Kodak EDAS 120
六、實驗藥品：
1. 購自 Acors（New Jersey, USA）:
Deoxycholate、Sodium orthovanadate。
2. 購自 Fisher Scientific（New Jersey, USA）：
Methanol、Tween 20
3. 購自 Fisons Scientific Equipment（Bishop Meadow Road, England）： Sodium chloride。
4. 購自 Amresco：Bis-acrylamide。
5. 購自 Gibco BRL（New York,NY,USA）：
Ammonium persulfate，EDTA，Fetal bovine serum，Glycine，L- Glutamine，Penicillin-streptomycin，Sodium Bicarbonate，TEMED，
trypan blue。
6. 購自 Nunc：
100 X 20 mm culture dish，60 X 15 mm culture dish，15 ml cornical tube，50 ml cornical tube。
7. 購自 Merck：Thioglycolate。
8. 購自 Sigma：
β- mercaptoethanol，Aprotinin，Bromophenol blue，EGTA，IGEPAL CA-630，PMSF，Acrylamide，1400W, ODQ, DMSO。
9. 購自美國 USB：
Coomassie brilliant blue R-250，Tris-base，SDS，Glycine，Tween 20。