第三章、 實驗材料與方法
3.3. 實驗方法
3.3.1. 幾丁質酶粗酵素之誘發 1. 膠體幾丁質製備
將25 g幾丁質粉末緩緩加入500 mL濃硫酸中，並作充分攪拌約 2小時。加入5 L蒸餾水至該幾丁質懸浮液中，過程中持續進行攪 拌，待其成為白色沉澱的膠體幾丁質，以大量蒸餾水反覆洗滌，
使其pH值達中性，最後將固形物懸浮於蒸餾水中。取懸浮液利用 熱風乾燥測其固形物含量，最後將懸浮液配製成含量約1.5 %固形 物之膠體幾丁質 (
Roberts and Selitrenkoff, 1985）。
2. Trichoderma viride 之幾丁質粗酵素誘發
將Trichoderma viride菌種凍管於37oC快速解凍，取100 μL菌種 保存液於PDA平板中，置室溫培養7天的條件下，連續接種兩代促 使菌株恢復活性。
以2 mL無菌蒸餾水將活化後之木黴菌孢子洗下，接種至一培 培養基中，在室溫下震盪 (150 rpm) 培養5天。無菌紗布過濾後，
取得菌絲體，用蒸餾水將菌絲體表面糖分洗去，接種至二培培養 基，在室溫下震盪培養4天（林, 2007），發酵液經離心去除沉澱 物後，視為幾丁質粗酵素液，並保存於-20oC（Chen and Lin, 2004）。
幾丁質酵素誘發培養液配方如下：
一培培養基（菌絲體增殖培養基）：40 g glucose，12 g sucrose，
1.2 g NaNO3，0.2 g MgSO4‧7H2O，0.2 g KCl，0.004 g
FeSO4‧7H2O，0.4 g K2HPO4，ddH2O定量至400 mL，pH調至7.2。
二培培養基（酵素誘發培養基）：6 g 膠體幾丁質（final 1.5
%），1.2 g NaNO3，0.2 g MgSO4‧7H2O，0.2 g KCl，0.004 g FeSO4‧7H2O，0.4 g K2HPO4，ddH2O定量至400 mL，pH 調至7.2。
3.3.2. LMWC 製備
幾丁聚醣粉末溶於100 mM 醋酸緩衝液中（pH 4.0）配製成1 % (w/v) 幾丁聚醣溶液，分別加入三種酵素：幾丁質粗酵素液（200 Unit/g chitosan）、溶菌酶（4 x 107 Unit/g chitosan）、纖維酵素（700 Unit/g chitosan），在42℃水浴下震盪反應，取水解時間1天之水解 產物，於100oC下水浴加熱15分鐘使酵素失活，冷卻至室溫後再沸 水浴煮30分鐘，並重複冷卻及水浴三次，使水解產物達無菌狀態
（此方法可避免在121℃下造成樣品產生褐變反應）（陳, 2006）。
3.3.3. LMWC 分析
3.3.3.1. 分子量測定
使用黏度計Brookfield HADV-Ⅱ＋（programmable DV-Ⅱ＋
viscometer），探頭為H1 探頭，設定轉速為100 rpm。取不同組合的 酵素水解產物400 mL至燒杯中，於室溫下（30℃）測其黏度（cp）變 化，並以Mark-Houwink-Sakurada方程式求得intrinsic viscosity分子量
（Kasaai et al., 2000; Sobhanmanesh and Hajizadeh, 2005; Ramírez-
Coutiño et al., 2006; Li et al., 2007）。Mark-Houwink-Sakurada方程式：
[η] = K．q MHS．MWa = 1.49 x 10-4 ． MW0.79 3.3.3.2. 溶解度
酵素水解產物於室溫下經過 200 mM phosphate buffer（pH 7.0）
以1：1 的比例中和後，6000 rpm 離心 20 分鐘，將上清液與沈澱
物分離，取其沈澱物水洗三次，以去除溶劑，於60℃的烘箱中烘
乾後秤重，計算其溶解度（林, 2007）。
溶解度（％）＝［（樣品重－烘乾後重）/ 樣品重］ × 100 為了解抗菌實驗之培養環境 pH 值對 LMWC 溶解度之影響，
將LWMC 加入至不同 pH 值的 TSB 培養基中（pH 4.5-7.5），混 勻後以濁度計偵測其透光率。
3.3.3.3. 粒徑與界達電位分析
將酵素水解物（溶在 pH 4.0 醋酸緩衝液中）以 0.2 μm 濾膜過 濾可能的雜質，菌體方面是先將細菌活化培養（16-24 小時），直 接吸取菌液進行偵測，在吸取樣品時，需小心避免產生氣泡將樣 品溶液打入界面電位測量槽中（cuvette），利用 zetasizer nano S90 及zetasizer nano Z 的動態光散射法測定平均粒徑、界達電位與分 佈，動態光散射之操作條件為：波長633.0 nm、室溫下、光散射 角度90o。