第三章、 實驗材料與方法
3.4. 抗菌活性試驗與機制探討
3.3.4.1. 菌株培養
S. aureus（BCRC 10780, BCRC 10781, BCRC 10451）於TSB 培養基；E. coli（BCRC 10314, BCRC 10675）培養於NB，兩種菌 株皆在37oC下培養14-16小時，此時為stationary phase，菌液菌數約 為1-5 x 109 cfu/mL。
3.3.4.2. 菌種鑑定
利用針對表現型(phenotype)進行分析的Microstation Biolog微 生物鑑定套組，以測試生化特性進行菌種鑑定。此菌種鑑定系統 利用含95種脫水碳水化合物的生化套組（96孔微量盤）進行反應，
針對其對不同碳源產生表現型差異之數據，與Microstation Biolog 提供的菌種資料庫進行比對與鑑定。
菌株接種於含5 %羊血的BUG固體培養基（BUG + B），在37oC 下培養14-16小時，利用無菌棉棒抹取培養於BUG+B培養基之菌株 菌落，並將沾有菌落之棉棒均勻在含3滴5 mM Sodium thioglycolate 試劑之GN/GP-IF溶液中，並配合使用Microlog Turbidometer調整接 種液透光度，達20 %T時，分別取150 μL之接種液至GP2 Microplate 之96孔洞，37oC下培養16-24小時，使用Biolog Microlog 4.2軟體判 讀結果，進行菌種比對與鑑定。
3.3.4.3. 不同 pH 值培養條件下的影響
取20 μL活化後的菌液至調整不同pH值（pH 4.5-7.5）之TSB 培養基中，觀察pH對S. aureus與E. coli生長的影響。
3.3.4.4. 抑菌試驗
(1)96 微孔盤抗菌活性測試 (微量試驗)
水解物以20 mM acetic buffer （pH 4.0）作連續對半稀釋，取 50 μl置入96微孔盤中，再加入50 μl之40 mM phosphate buffer（ pH 7.0），最後加入100 μl活化後的菌液，培養於37 ℃下，以ELISA reader OD590於每12小時測其濁度變化，繪出生長曲線，判斷最低 抑制濃度（林, 2007）。
抑制時間（inhibitory time, IT）定義為菌株生長在遲滯期（lag phase）狀態所延長之時間。抑制時間＝（實驗組菌株生長於lag phase 之時間）－（對照組菌株生長於lag phase 之時間）。
最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration, MIC）定義 為。菌株在與樣品培養後，其遲滯期（lag phase）比對照組多48 小時的濃度。
(2) 微生物培養增殖分析儀抗菌活性測試 (增量試驗)
將水解物以100 mM acetic buffer（pH 4.0）稀釋，添加至裝有 TSB培養基的L型管中，加入與水解物等量的200 mM phosphate
buffer（pH 7.0），最後加入10 μL活化後的菌液，使用微生物培養 增值分析儀進行培養及觀測其濁度變化（陳, 2006）。
3.3.4.5. 菌體吸附試驗
將不同濃度水解產物加入事先培養之 10mL 菌液，震盪反應 1
小時，靜置約30 分鐘待其沉澱，隨後吸取上清液以塗抹方式計算
其尚未被水解物作用吸附的剩餘菌數。
3.3.4.6. 掃瞄式電子顯微鏡
分別將 S. aureus (BRCR10451、10780、10781) 與 E. coli（BRCR 10314、BCRC 10675）於 37℃下培養 14-16 小時 (1~5 x 109
CFU/mL)。加入 800 ppm 之幾丁聚醣酵素水解物於菌液中，菌液 與幾丁聚醣水解產物震盪培養1 小時，沉澱靜置約 30 分後取樣。
樣品菌液分別以 (1)未經 100 mM 醋酸緩衝液洗滌幾丁聚醣水解 物，及 (2)有 100 mM 醋酸緩衝液將包覆細菌之幾丁聚醣水解物洗 下，稍後將兩種不同處理方式之菌液樣品以12,000 x g 離心 10 分 鐘，去上清液後加入1 - 2.5 % formaldehyde 或 glutaradehyde 電顯 固定液體中(以 200 mM 磷酸緩衝液配置，pH 7.0)，於 4℃下浸泡 1 小時，隨後以50-100 %乙醇進行系列脫水，將已乾燥之樣品粉末 黏附於載物檯上並進行鍍金包覆(120 秒)，最後在電子顯微鏡下檢 視樣品(20 kV)。
3.3.4.7. Genomic DNA 之抽取（使用 ZR Fungal/Bacterial DNA Kit
進行萃取）
取 2 mL 的菌液，4,000 x g 離心 10 分鐘，去上清液後將沉澱 物以二次水或200mM 磷酸緩衝液（等張溶液）回溶，並重複 2-3 次以去除培養基，最後將沉澱的菌以200 μL 回溶並移至裝有 lysis buffer 的 ZR bashingbead lysis tube 中高速震盪 5 分鐘，再以 10,000 x g 離心 1 分鐘。取 400 μL 上清液至 Zymo-Spin IV Spin Filter 並套 上收集管後，以7,000 x g 離心 1 分鐘，後加入 1,200 μL
Fungal/Bacterial DNA Binding Buffer 至 Zymo-Spin IV Spin Filter，
7,000 x g 離心 1 分鐘，收集管內取得 1,600 μL 混合液。取 800 μL 混合液至Zymo-Spin IIC Column 並接上新的收集管，10,000 x g 離 心1 分鐘，重複二次，隨後將此收集管丟棄。加入 200 μL DNA Pre-Wash Buffer 至已接上新收集管的 Zymo-Spin IIC Column，
10,000 x g 離心 1 分鐘，再加入 500 μL Fungal/Bacterial DNA Wash Buffer 並 10,000 x g 離心 1 分鐘。最後將 Zymo-Spin IIC Column 接 上無菌微量離心管，加入100 μL DNA Elution Buffer，10,000 x g 離心30 秒，可取得回溶於 buffer 中的 DNA。
0.2 g 洋菜粉末加入 20 mL 1x TBE buffer 製備 1% agarose gel，
置於微波爐中加熱使洋菜粒全溶，倒入鑄膠器內待其凝結。樣品
加入追蹤染劑，與DNA marker 進行電泳，連接電源插頭（黑色為
負極，紅色為正極）到電源，帶負電荷的DNA 分子會由負極移向
正極，在50V 下跑膠約 1 小時。之後以 EtBr（~0.5µg/mL）染色 30 分鐘，在以水退染 5 分鐘，把洋菜膠放在 UV 透射光源板上觀 察與拍照。