微生物培養增值分析儀 (增量試驗)

利用96 微孔盤所進行的抗菌活性測試，僅能表示 LMWC 在靜置 下對菌體的抑制活性，且受是體積小，僅能最作為初步篩選之用。從 MIC 的結果篩選出 DD92_chit，進行以下的菌種生長曲線研究，以了 解LMWC 受測菌種生長之影響。

本實驗使用Bio-photorecorder 觀察細菌生長，為避免不同細菌本 身生長會受生長條件影響，造成抗菌效果的偏差，因此對3 株 S. aureus 及2 株 E. coli 的生長情形做彼此間的評估，可發現在一般生長條件（40 rpm, 37^oC）下，各菌株間其菌數及生長情形其實是相當接近的（圖十 二及圖十三的對照組）。

從圖十二及圖十三表示 DD92_chit 對 S. aureus 抑制之生長曲線

圖，在添加400 ppm DD92_chit 後，發現 BCRC 10780 被抑制的時間 最短約7 小時，BCRC 10781 約 18 小時，BCRC 10451 的耐受性最差，

抑制時間可達22 小時。DD92_chit 濃度增加至 800 ppm，其耐受性趨 勢仍呈現BCRC 10780＞BCRC 10781＞BCRC 10451，抑制時間分別 延長至10、20 及 30 小時。

圖十四及圖十五表示 DD92_chit 對 E. coli 抑制之生長曲線圖，

當添加100 ppm DD_92chit 後，對 BCRC 10675 只能抑制約 4 小時，

但能抑制BCRC 10314 達 15 小時。濃度增加至 200 ppm 時，對 BCRC 10675 能延長至 23 小時，此時 BCRC 10314 則完全被抑制，BCRC 10675 耐受性明顯高於 BCRC 10314。

由兩種抗菌活性試驗皆得同一趨勢，即細菌表面電位的強弱明顯

影響其對LMWC 耐受性。同種不同品系的菌株，仍呈現出不同的抗

菌效果，應與表面電位相關。為了進ㄧ步探討LMWC 的抑菌機制，

後續實驗便透過吸附與電子顯微鏡作為探討幾丁聚醣與細菌表面作 用情形。

4.3. 菌體吸附試驗

葡萄醣胺的 amino groups 在溶液中質子化作用，使幾丁聚醣帶

正電荷。自然界中許多膠體顆粒例如細菌和聚分子通常帶負電荷，因 此彼此間會相互作用產生吸附力，進而導致菌體產生凝聚及沉澱的現

象。除了先前的表面電荷外，作用環境的pH 值也是影響其吸附作用

的因子之ㄧ，因此必須選擇最適的pH 值環境才能達到其最佳的吸附

能力。

由 Strand et al. (2002, 2003)的研究便探討幾丁聚醣與 E.coli 的吸 附環境pH 值，其結果指出適當的 pH 值條件（pH5.0 到 6.5）下，隨 著pH 值增加，會使 LMWC 析出，使其吸附力也會跟著提升，其中 以pH6.0-6.5 最佳，並且不會影響 E. coli 的生長。在此同時，本實驗 也對 S. aureus 在不同 pH 值環境的生長進行評估，以盡可能維持在最

佳吸附力pH 值又不影響細菌本身生長的條件下進行後續實驗。

圖十六、圖十七、圖十八在探討的 3 株 S. aureus 從中性 pH7 到 pH4.5 間的生長情形，由結果得知，3 株 S. aureus 在低於 pH6.5 之生 長會受影響，故本研究選在pH6.5 下進行 LMWC 與 S. aureus 及 E.coli 的吸附力實驗。

3 種不同品系金黃色葡萄球菌與不同濃度 DD92_chit 作用後，彼

此會產生凝聚、沉澱現象，使得細菌被 LMWC 所吸附，因此從培養

基中懸浮殘菌的多寡，可判定彼此間吸附力的差異。從圖十九可以得 知，3 株菌在起始菌數接近的情況下，加入 200 ppm DD92_chit 後，

各菌體明顯被吸附，其中BCRC 10451 減少約 3 個 log 的菌數。隨著 DD92_chit 濃度的增加，所得細菌殘菌數便跟著減少，濃度與殘菌數

的log 值幾乎呈負向線性趨勢，當添加到 800 ppm 時，BCRC 10451 僅剩10⁴ cfu/mL，而 BCRC 10780 所剩菌數最多，故 3 株菌與 LMWC 吸附力強弱依序為BCRC 10451、BCRC 10781、BCRC 10780。

圖二十則是2 種不同品系大腸桿菌與不同濃度 DD92_chit 吸附作 用後殘菌的變化，結果顯示只加入100 ppm，BCRC 10314 的 log 菌 數便減少ㄧ半，隨著濃度增加，LMWC 所吸附的菌數越多，當加入 200 ppm 時，BCRC 10314 幾乎全為 LMWC 所吸附。雖然 BCRC 10675 跟BCRC 10314 的吸附力有ㄧ段差距，但還是能在加入 400 ppm 時，

將菌數吸附超過6 個 log。

上述之結果與先前抗菌實驗（MIC）比較，呈現一致的結果。受 吸附量越多的菌種其MIC 越低，表示越容易受 LMWC 所抑制，此外 細菌被LMWC 吸附的強弱，恰與 zeta potential 所帶的負電荷多寡是 一致的，以BCRC 10314 帶最多負電荷，被吸附的能力最佳，而 BCRC 10780 帶最少負電荷，最不容易受 LMWC 所吸附，由此證實 LMWC 的抗菌特性與其對細菌的吸附力有很大的關係。

4.4. 掃瞄式電子顯微鏡

細菌是如何被LMWC吸附，其吸附的情形為何，是否以包覆作用 達到抑制細菌生長，或是如同先前研究，其會破壞細胞壁導致菌體破 裂而亡（Vishu Kumar et al., 2007; Liu et al., 2003; Chung et al. ），上

述問題可透過SEM觀察，得到部份答案。

圖二十ㄧ為菌體未以LMWC處理的電顯圖，可以看出雖然是不 同品系的菌，但就外觀、外型而言差異不大，所以可以排除外型為影 響抗性的因子。

圖二十二為 BCRC 10451 與 LMWC 作用一小時後的電顯圖，

BCRC 10451 為 S .aureus 最容易受到影響的品系，其結果明顯的如預

期推測，菌體表面被LMWC 所包覆，由圖二十二（A）可以發現有

類似長桿形狀的菌體，推測為圓形的菌體先被LMWC 所包覆，但尚

未完全終止細菌的生長，因此細菌仍可運用有限的養分繼續進行細胞

分裂，然而受到LMWC 阻斷了養分的攝取及空間上的阻礙，細菌未

能完成細胞分裂而停止其動作。為了繼續了解細菌細胞壁的狀況，小 心以低濃度醋酸緩衝液（20 mM）將細菌表面所吸附的 LMWC 洗去，

可以發現細菌表面被LMWC 所破壞，使得細菌有明顯孔洞、破裂（圖

B），可見 LMWC 可深入細胞壁，與細胞壁形成複合的結構，導致

菌體在移除LMWC 的過程中，造成細胞外壁的破裂。因此亦可推論，

菌體細胞壁被LMWC 干擾後，除了電中和外會導致菌體生理功能包

括運輸、生殖、代謝與其他菌體溝通等能力停止外，也會由於包覆而 導致細胞壁變形、破壞，繼而死亡。

圖二十三為 BCRC 10781 與 LMWC 作用後的電顯圖，BCRC

10781 為 S .aureus 中次敏感的菌株，其電顯圖的結果與 BCRC 10451

類似，皆是細胞表面包覆厚厚一層的LMWC，同樣也會因為無法完

成細胞分裂出現長桿狀物，在使用緩衝液洗滌後也發現有細胞破碎的 現象，但發現只有細胞變形而尚未破裂的菌體。

圖二十四為 S .aureus 中抗性最佳的菌株─BCRC 10780，由圖（A）

中可發現細菌仍有被包覆的情況，但效果沒有前者明顯，大多僅呈現 菌體聚集的現象，以緩衝液洗滌後發現僅有少數菌體破裂，其餘則為 外觀變形與正常菌體夾雜，顯示BCRC 10780 可能必須與 LMWC 時 間作用拉長，才能達到殺菌的效果。

圖二十五與圖二十六分別為 E. coli BCRC 10314、BCRC 10675 與 LMWC 作用後的電顯圖，兩株菌一樣會被 LMWC 所包覆，有趣的是 其中抗性較弱的BCRC 10314 所呈現的結果如同 S .aureus 中最弱的 BCRC 10451，容易與 LMWC 所吸附，因此被包覆的程度最多，也有 出現菌體兩倍長的長桿物，似乎也顯示細胞分裂被終止，最後細菌表

面被LMWC 所破壞，使得細菌破碎，造成細菌的死亡。相反的抗性

較佳的BCRC 10675 只出現少數細胞破裂的現象。

因此，由電顯圖實驗可以得知，細菌與LMWC 作用後，彼此會

因為相互吸附使得細菌被包覆在內，初期細菌分裂會受到抑制，若作 用時間超過細菌的耐受度，可能會造成細菌細胞壁的結構改變，使得

細菌發生變形，接著表面出現孔洞，嚴重者細胞破裂而死亡。