本實驗透過三種不同水解機制的酵素，降解兩種不同去乙醯度之 幾丁聚醣，發現水解產物的分子量隨著水解時間的增加而降低，可製 備出分子量、抗菌性、溶解度、電荷度不同的LMWC。其中以 cellulase 水解物其溶解度最佳可高達100％，lysozyme 水解產物雖具不錯抗菌 效果，但有溶解度不佳問題，利用DD92 及 chitinase 所製備的 LMWC 比較容易兼顧溶解度及抗菌效果，使得應用上得到最佳的潛力，利用 本實驗室誘發之chitinase 不但操作簡單、價格低廉，其所製備的 LMWC 在食品等領域上具應用的潛力。
在抗菌機制方面，細菌的界達電位關係著細菌與 LMWC 的吸附 力，當吸附力越強其抗菌效果也跟著提升，透過SEM 與殘菌 DNA
量的分析，推測細菌與LMWC 作用後，彼此會因為相互吸附使得細
菌被包覆，初期以抑制細菌分裂達到抗菌的效果，若超過細菌的耐受 度，便會造成細菌細胞壁的結構改變，使得細菌發生變形，接著表面 出現孔洞，嚴重者細胞破裂。
本實驗目前僅探討LMWC 與菌體表面電荷對抑菌的影響。由於
細胞壁的電荷可受細胞壁成份改變而造成細胞壁對LMWC 敏感性有
所不同。未來可就此議題進一步探討，如進行細菌細胞壁成份分析與
組成方式、細胞膜蛋白質成份與其功能分析，或更進一步比對其基因 上差異，評估細胞壁哪些成份、組成方式或哪些特定蛋白質是如何造
成同種不同品系菌體間的敏感性差異，相信對LMWC 的抑菌機制會
有更深層的了解。
第六章、圖表
表一、利用幾丁質酶、纖維素、溶菌酶水解不同去以醯度幾丁聚醣所 製備之水解產物及其物理特性探討
Table 1. The properties of LMWC prepared from two different DD of chitosans in an enzymatic process by using chitinase (chit), cellulase (cel), or lysozyme (lys)
*Ht : hydrolysis time (h)
# Solubility ＜ 1%
DD (%) LMWC
Enzyme_Ht* MW (kDa) Solubility (%) Zeta potential (mV)
Log MW
3.8 4.0 4.2 4.4
Solubility (%, w/v)
0
Zeta potential (mV)
60
Figure 11 .The relationship between molecular weight, solubility and zeta potential of LMWC.
表二、E. coli 及 S. aureus 之界達電位與利用幾丁質酶、纖維酵素、溶 菌酶水解所製備的LMWC 之最低抑制濃度的關係
Table 2. The relationship between the zeta potentia of two E. coli strains and three S. aureus strains and MIC values of LMWC prepared from two different DD of chitosans in an enzymatic process by using chitinase (chit), cellulase (cel) or lysozyme (lys)
*Ht : hydrolysis time (h)
#NI : Not inhibition
E. coli
(BCRC 10314)E. coli
(BCRC 10675)S. aureus
(BCRC 10451)S. aureus
(BCRC 10780)S. aureus
Time (h)
0 10 20 30 40
Absorbance (OD 590)
0 1 2 3 4
10451_control 10780_control 10781_control
10451_400 ppm_DD92_chit 10780_400 ppm_DD92_chit 10781_400 ppm_DD92_chit
圖十二、三種品系金黃色葡萄球菌在濃度在400 ppm LMWC_DD92_
chit 下之生長曲線圖。
Figure 12. The growth curves of three strains of S. aureus grown at 400 ppm of LMWC_DD92_chit.
Time (h)
0 10 20 30 40
Absorbance (OD 590)
0 1 2 3 4
10451_control 10780_control 10781_control
10451_800 ppm_DD92_chit 10780_800 ppm_DD92_chit 10781_800 ppm_DD92_chit
圖十三、三種品系金黃色葡萄球菌在濃度在800 ppm LMWC_DD92_
chit 下之生長曲線圖。
Figure 13. The growth curves of three strains of S. aureus grown at 800 ppm of LMWC_DD92_chit.
Time (h)
0 10 20 30 40 50
Ab so rb ance (OD
590)
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
10314_control 10675_control
10314_100 ppm_DD92_chit 10675_100 ppm_DD92_chit
圖十四、二種品系大腸桿菌與濃度在100 ppm LMWC_DD92_chit 下 之生長曲線圖。
Figure 14. The growth curves of two strains of E. coli grown at 100 ppm of LMWC_DD92_chit.
Time (h)
0 10 20 30 40 50
A bso rb an ce (O D
590)
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
10314_control 10675_control
10314_200 ppm_DD92_chit 10675_200 ppm_DD92_chit
圖十五、二種品系大腸桿菌與濃度在200 ppm LMWC_DD92_chit 下 之生長曲線圖。
Figure 15. The growth curves of two strains of E. coli grown at 200 ppm of LMWC_DD92_chit.
Time (h)
0 2 4 6 8 10 12 14
Absorbance (OD590)
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
pH4.5 pH5.0 pH5.5 pH6.0 pH6.5 pH7.0
圖十六、在不同pH 值下金黃色葡萄球菌 BCRC 10451 的生長情形。
Figure 16. The growth curve of Staphylococcus aureus BCRC 10451 under different pH conditions.
Time (h)
0 2 4 6 8 10 12 14
Absorbance (OD 590)
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
pH4.5 pH5.0 pH5.5 pH6.0 pH6.5 pH7.0
圖十七、在不同pH 值下金黃色葡萄球菌 BCRC 10780 的生長情形。
Figure 17. The growth curve of Staphylococcus aureus BCRC 10780 under different pH conditions.
Time (h)
0 2 4 6 8 10 12 14
Absorbance (OD590)
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8
1.0 pH4.5
pH5.0 pH5.5 pH6.0 pH6.5 pH7.0
圖十八、在不同pH 值下金黃色葡萄球菌 BCRC 10781 的生長情形。
Figure 18. The growth curve of Staphylococcus aureus BCRC 10781 under different pH conditions.
LMWC_DD92_chit conc. (ppm)
0 200 400 600 800
B acte ria l counts (cfu/m L)
104 105 106 107 108 109 1010
BCRC 10451 BCRC 10780 BCRC 10781
圖十九、根據懸浮液殘菌變化量評估不同濃度LMWC 對 3 株金黃色 葡萄球菌吸附作用變化情形。
Figure 19. Adsorption test: According to the change of bacterial residue in supernatant, evaluating effect of LMWC on three strains of S. aureus treated in the presence of increasing concentrations of LMWC.
LMWC_DD92 chit conc. (ppm)
0 100 200 300 400
B ac te rial c ou nts ( cf u/m L )
0.0 1.0e+2 1.0e+4 1.0e+6 1.0e+8 1.0e+10
BCRC 10314 BCRC 10675
圖二十、根據懸浮液殘菌變化量評估不同濃度LMWC 對 2 株大腸桿 菌吸附作用變化情形。
Figure 20. Adsorption test: According to the change of bacterial residue in supernatant, evaluating effect of LMWC on two strains of E.
coli treated in the presence of increasing concentrations of LMWC.
圖二十一、正常狀態下金黃色葡萄球菌的電子顯微。
Figure 21.SEM photographs of S.aureus without treatment with LMWC.
10451: (A) 5000x, (B)10000x; 10780: (C)5000x, (D)10000x;
10781: (E) 5000x, (F)10000x.
B
BA
D C
E F
圖二十二、LMWC 與金黃色葡萄球菌 (BCRC 10451) 作用 1 小時（A）
並比較20 mM 醋酸緩衝液沖洗後（B）的電子顯微圖。
Figure 22. SEM photographs of S.aureus (BCRC 10451) treated with 800ppm LMWC for 1 hrs, following precipitated for 6 hrs (A), and then washed by 20 mM acetic buffer (B).
B A
圖二十三、LMWC 與金黃色葡萄球菌 (BCRC 10781) 作用 1 小時（A）
並比較20 mM 醋酸緩衝液沖洗後（B）的電子顯微圖。
Figure 23. SEM photographs of S.aureus (BCRC 10781) treated with 800ppm LMWC for 1 hrs, following precipitated for 6 hrs (A), and then washed by 20 mM acetic buffer (B).
B A
圖二十四、LMWC 與金黃色葡萄球菌 (BCRC 10780) 作用 1 小時（A）
並比較20 mM 醋酸緩衝液沖洗後（B）的電子顯微圖。
Figure 24. SEM photographs of S.aureus (BCRC 10780) treated with 800ppm LMWC for 1 hrs, following precipitated for 6 hrs (A), and then washed by 20 mM acetic buffer (B).
B A
圖二十五、LMWC 與大腸桿菌 (BCRC 10314) 作用 1 小時（A）並比 較20 mM 醋酸緩衝液沖洗後（B）的電子顯微圖。
Figure 25. SEM photographs of E. coli (BCRC 10314) treated with
800ppm LMWC for 1 hrs, following precipitated for 6 hrs (A), and then washed by 20 mM acetic buffer (B).
B A
圖二十六、LMWC 與大腸桿菌 (BCRC 10675) 作用 1 小時（A）並比 較20 mM 醋酸緩衝液沖洗後（B）的電子顯微圖。
Figure 26. SEM photographs of E. coli (BCRC10675) treated with
800ppm LMWC for 1 hrs, following precipitated for 6 hrs (A), and then washed by 20 mM acetic buffer (B).
B A
圖二十七、萃取3 株金黃色葡萄球菌 DNA 的並比較其量。
Figure 27. The DNA extraction analysis of S. aureus.