國立宜蘭大學生物技術研究所 Institute of Biotechnology

國立宜蘭大學生物技術研究所 Institute of Biotechnology

National Ilan University

碩士論文 Master Thesis

不同品系金黃色葡萄球菌與大腸桿菌對低分子量幾丁聚醣 敏感差異性及抗菌機制之初步研究

The preliminary study of antibacterial mechanism of low molecular weight chitosan by using differentially susceptible

strains of Staphylococcus aureus and Escherichia coli

指導教授：林世斌 博士 Advisor：Shih-Bin Lin , Ph. D.

研究生：宮紹凱

Graduate Student：Shao-Kai Kung

誌 謝

時光飛逝，兩年的研究所生涯即將劃下句點。回首這段日子從只會執行實驗 的大學生，慢慢學著收尋資料、設計實驗、思考、解決問題及清楚表達意思，讓 自己更獨立與成熟。求學期間，首先，由衷感謝指導教授林世斌博士，帶領著學 生進入廣泛深奧的研究科學領域。在研究上以指引的方式讓自己學習思考與設計 實驗，並總是能在遇到困難時適時協助與指導，口試與論文提交時期不厭其煩的 批閱及訂正，讓研究表示的更加通順，使論文得以完成。這兩年的細心指導，不 斷著學習著身為科學人應有的學習精神、思考方式與處事態度，讓我獲益良多；

在生活上，亦師亦友、寒暄問暖、運動、聚餐等紓解壓力的相處模式，讓老師與 學生間不在總是像傳統充滿著緊張的關係。此外，特別感謝食品科學所陳莉臻老 師，在實驗室方面總是給予學生良好與充裕的研究環境，教導學生管理與接洽事 務的能力，平時總以學姐身份督促、關心近況、支持與鼓勵，並試著營造一個溫 馨、歡樂及舒適的實驗室，讓苦悶的研究生活時時感到溫暖。能在兩年內提交初 稿、完成口試並順利畢業，在此致上最誠摯的謝意。

研究與論文撰寫期間，感謝陳威戎等生物技術所老師、陳輝煌、陳時欣等食 品科學所老師在學生求學期間與研究上的指導、建議、協助與鼓勵。台灣大學食 品科學所葉安義老師、本校化材所及動物所即時提供實驗儀器，得以讓實驗順利 執行。最後感謝陳威戎老師、陳輝煌老師及海洋大學食品科學所蔡敏郎老師能於 百忙之中撥冗擔任擔任口試委員，悉心審閱批改論文及在口試過程提出寶貴意見 與指導，使得論文更加完善，以上所有幫助學生完成論文的老師們，有你們的熱 心的指導、給予寶貴建議及知識與經驗的傳承，讓學生受益匪淺、至此深致謝枕。

兩年研究生活，感謝一起奮鬥打拼的先進與夥伴們─已畢業的學長姐山禾、

怡君、小曼、欣湉、仕達，在實驗上無私教導所學的技術與實驗、平時的照顧與 鼓勵，讓學弟快速進入研究生狀況；生技所同儕─明傑、彥君、春榮、譽耀、楹 涵等，感謝常提供最新資訊給外放在食品所的我，回想起考前的讀書會總是能在 最短時間發揮最大的讀書效率，也很開心能在每個禮拜專討後的午餐談談近況、

分享平常心得感想與經驗，有你們的鼎力相助、互相照顧，讓我在食品所都能感 受到無比的關心；食品所及動物所同學─煌展、束筠、琇如、明德等，因為你們 的照顧、幫忙以及帶來的許多歡樂，讓我都覺得已經快成為食品所成員；實驗室 工讀助理與碩士級學弟妹─鈺翔、嘉玟、容安、宏毅、芥萍、雅君，謝謝你們時 時關心學長的身心狀況與畢業進度，分擔實驗室工作、管理與維持實驗室運作，

讓我不用經常操煩雜事而能專心做實驗及撰寫論文，並順利畢業；實驗室大學級 學弟妹─函容、宜蓁、于婷、亦綾、湘婷、威銓、鳳儀、懿慧等，雖然要常花不 少心思和時間教育你們，但也因此學習如何以更好的方式教導他人，同時平常有 你們招呼飲食、帶來許多歡笑並陪孤單的學長聊天，讓實驗室增加合諧與歡樂氣 氛，減緩許多實驗與課業的壓力；大學時期的朋友─久存、文鈞、祐宏等，當初 大家一起玩樂、唸書、考研究所，有你們的相互扶持大家都繼續升學並朝畢業及

理想邁進，感謝你們帶給我許多歡樂回憶；另外也感謝沒點到名或在課業及生活 上幫助過我的朋友，給予我精神上及生活上的幫助，讓我能更加順利完成學業，

在此都一並感謝。

最後，感謝摯愛的家人─父親、母親、哥哥，感謝父母對我之照顧與養育之 恩，提供最美好的環境、給予最多的資源、最大的鼓勵與支持、在遇到求學轉折 與瓶頸時，適時給予最大的幫助與指引，讓兒子在生活和求學期間無後顧之憂，

專心求學，得以完成學業，跟隨父親成為正式的碩士生；感謝家兄，雖然小時後 某階段常吵架，但隨年齡增長及各自在外求學，讓彼此更珍惜兄弟之情，在日常 生活上的照顧與關心，並時常提供最新遊戲等娛樂的管道，舒解課業壓力；另外 也感謝關心我的親戚們，在我就學期間不斷的给與我鼓勵與支持。謹於論文撰寫 完成之時，以此兩年研究成果獻給親愛的家人及關心我的朋友們，願他們均能共 享這成果與喜悅。

宮紹凱 謹誌於 國立宜蘭大學 生物技術研究所 中 華 民 國 九十七 年 九 月

摘要

幾丁質（chitin）、幾丁聚醣（chitosan）及幾丁聚醣水解物具組 織相容、生物活性等特性，近年來在生物技術、生物醫學、藥理、農 業等領域上受到廣泛的重視。本實驗室使用自木黴菌（Trichoderma viride, BCRC 32054）誘發之幾丁質酶（chitinase）與市售溶菌酶

（lysozyme）及纖維酵素（cellulase）三種酵素，透過其不同的水解 機制，對不同去乙醯度（DD80、DD92）的幾丁聚醣進行水解，製備 出分子量、抗菌性、溶解度、電荷密度不同的低分子量幾丁聚醣

（LMWC）。幾丁聚醣的去乙醯度明顯影響酵素的水解行為，經過水 解24 小時後，各組合產生之 LMWC 之內生性黏度分子量（MV）大 小排列依序為：DD92_lys（24.8 kDa）、DD80_lys（14.8 kDa）、DD92_chit

（13.5 kDa）、DD80_chit（9.6 kDa）、DD80_cel（8.1 kDa）及 DD92_cel

（6.9 kDa）。LMWC 之溶解度與其分子量大小相關而與其製備所使 用之酵素無關。本實驗以96 微孔盤抗菌試驗對各 LMWC 進行抗菌試 驗，結果顯示LMWC_lys 具較佳的抗菌效果，但溶解度不佳，而 LMWC_cel 雖具較佳的溶解度，但不具抗菌效果。利用 DD92 及 chitinase 所製備的 LMWC 則有高溶解度及抗菌效果，故選擇其作為

後續抗菌機制探討之用。微生物培養增殖分析儀的抗菌試驗乃針對3

株 S. aureus (BCRC 10451、10780、10781) 及 2 株 E. coli (BCRC

10314、10675) 進行探討，結果顯示不同品系的菌種對 LMWC 具不 同程度的敏感性。在機制探討的結果顯示，界達電位（zeta potential）

關係著細菌與LMWC 的吸附力，當菌體的負電荷與正電荷的 LMWC 電位差距越大，其彼此間的吸附力也跟著提升，導致抗菌性也有增 強。透過SEM 觀察，對 LMWC 較敏感的品系，S. aureus（BCRC 10451）

和 E. coli （BCRC 10314）其菌體表面會被 LMWC 所包覆。若將細

菌表面所吸附的LMWC 洗去，可發現菌體遭受破壞及孔洞形成。而

菌體DNA 萃取的分析結果，同樣指出 BCRC 10780 的 DNA 最難萃 取，意味著其細胞壁可能較原本堅固，不易破壞。綜合上述結果推測

細菌與LMWC 作用後，會有電中和現象，且彼此會因為相互吸附使

得細菌被包覆，初期以抑制細菌分裂達到抑菌的效果，也可入侵造成 細菌細胞壁使結構改變，造成細菌死亡。

關鍵字：幾丁聚醣、低分子量幾丁聚醣、幾丁質酶、溶菌酶、纖維酵 素、抗菌活性

Abstract

Chitin, chitosan and chitosan hydrolysates possess histocompatibility and biological activity, in addition, they have been widely applied in the biotechnology, biomedical, pharmacological and agricultural fields recently. In this study, the low molecular weight chitosans (LMWCs) were prepared by using crude chitinase (induced from Trichoderma viride), commercial lysozyme and cellulase. Due to these enzymes have different hydrolysis mechanism on chitosan with different DD, a diverse characteristics of LMWC including Mw, antibacterial activity, solubility, zeta potential could prepared from DD of 80 and 92%. The intrinsic viscosity molecular weight (MV) of LMWC form each of the combination was decreased steeply in 24 hours (from 370 kDa to 13-37 kDa) and, the order of MV were DD92_lys (24.8 kDa), DD80_lys (14.8 kDa), DD92_chit (13.5 kDa), DD80_chit (9.6 kDa), DD80_cel (8.1 kDa) and DD92_cel (6.9 kDa). The solubility of LMWC was affected strongly by Mw but not the enzyme by which LMWC was prepared. The minimum inhibition concentration (MIC) of LMWC was done by 96 microplate method. The results show that LMWC_lys has better antibacterial activity and poor solubility; in opposition, LMWC_cel had better solubility but ineffective antibacterial activity. The LMWC made from DD92 and chitinase had high solubility and good antibacterial activity. Therefore, the LMWC_DD92_chit was used for the following antibacterial activity study. The antibacterial activity test performed by using biophotorecorder method against three strains of S. aureus (BCRC 10451, 10780, 10781) and two strains of E. coli (BCRC 10314, 10675) revealed that various

strains of antibacterial action of bacteria had different susceptibility to LMWC. The antimicrobial action of LMWC was strongly related to zeta potential. The more charge disparity between positive LMWC and negative bacteria, the more adsorptive power between each other, which led to higher antibacterial activity. SEM was used to observe the interaction between LMWC and the most sensitive strains S. aureus (BCRC 10451) and E. coli (BCRC 10314), and results revealed bacteria were heavily coated with LMWC. While the LMWC coat was washed away with acetic buffer, the surface integrity of bacteria was destroyed which resulted in the membrane poration on the surface. The bacterial DNA extraction analysis showed that DNA of BCRC 10780 was the most difficult to be extracted. It suggested that cell wall of BCRC 10780 was thicker, more rigid and not easy to be destroyed. In the early stage, the surface covering of LMWC can possibly cease cell division by charge neutralization. It could also invade into and cause deterioration of cell wall which leads bacteria to death.

Key words : chitosan, low molecular weight chitosan, chitinase, lysozyme, cellulase, antibacterial activity

目錄

中文摘要...Ⅰ 英文摘要...Ⅲ 目錄...Ⅴ 圖目錄...Ⅸ 表目錄... XII

第一章、前言...1

第二章、文獻回顧...3

2.1. 幾丁質 ...3

2.2. 幾丁聚醣...5

2.3. 幾丁聚醣水解物 ...6

2.3.1. 製備方法 ...6

2.3.2. 化學法 ...7

2.3.3. 酵素法 ...7

2.3.4. 常見的水解酵素 ...7

2.3.4.1. 幾丁質酶...8

2.3.4.2. 溶菌酶...9

2.3.4.3. 纖維酵素...10

2.4. 幾丁聚醣及其水解物的功能與應用 ...12

2.4.1. 降低脂肪與膽固醇 ...12

2.4.2. 提高免疫力 ...13

2.4.3. 抗腫瘤活性 ...13

2.4.4. 抗氧化性 ...13

2.4.5. 促進傷口癒合、凝血 ...14

2.4.6. 幾丁聚醣及其水解物的抗菌活性...14

2.5. 影響抗菌活性之因子 ...15

2.5.1. 去乙醯度 ...15

2.5.2. 分子量 ...16

2.5.3. 溶解度 ...16

2.5.4. 電荷密度 ...17

2.6. 目前研究的抗菌機制 ...17

2.7. 細菌細胞壁的介紹 ...19

2.7.1. 革蘭氏陽性菌 ...20

2.7.2. 革蘭氏陰性菌 ...21

2.7.3. 革蘭氏陽性菌與陰性菌比較...23

第三章、實驗材料與方法...24

3.1. 研究架構 ...24

3.2. 實驗器材...25

3.2.1. 儀器及設備 ...25

3.2.2. 樣品 ...26

3.2.3. 實驗菌株 ...26

3.2.4. 藥品清單 ...27

3.2.5. 商購酵素 ...27

3.3. 實驗方法 ...27

3.3.1. 幾丁質酶粗酵素之誘發 ...27

3.3.2. LMWC製備...29

3.3.3. LMWC分析...29

3.3.3.1. 分子量測定...29

3.3.3.2. 溶解度...30

3.3.3.3. 粒徑與界達電位分析...30

3.4. 抗菌活性試驗與機制探討 ...31

3.3.4.1. 菌株培養...31

3.3.4.2. 菌種鑑定...31

3.3.4.3. 不同pH值培養條件下的影響...32

3.3.4.4. 抑菌試驗...32

3.3.4.5. 菌體吸附試驗...33

3.3.4.6. 掃瞄式電子顯微鏡...33

3.3.4.7. Genomic DNA之抽取（使用ZR

Fungal/Bacterial DNA Kit進行萃取） ...34

第四章、結果與討論...36

4.1. LMWC分析...36

4.1.1. 分子量與粒徑變化 ...37

4.1.2. 溶解度測定 ...38

4.1.3. 界達電位測定 ...39

4.2. 水解產物抗菌活性分析 ...40

4.2.1. 96微量孔盤 (微量試驗) ...40

4.2.2. 微生物培養增值分析儀 (增量試驗) ...43

4.3. 菌體吸附試驗 ...44

4.4. 掃瞄式電子顯微鏡 ...46

4.5. 菌體DNA萃取分析...49

第五章、總結...50

第六章、圖表...52

第七章、附錄...71

第八章、參考文獻...76

圖目錄

圖一、幾丁質結構...4

圖二、α- chitin的排列方式...4

圖三、β- chitin的排列方式...4

圖四、幾丁聚醣結構...6

圖五、在酸性下帶正電荷的幾丁聚醣...6

圖六、幾丁質酶作用不同去乙醯度幾丁聚醣之機制...9

圖七、溶菌酶水解作用於兩種型態的幾丁聚糖...10

圖八、幾丁寡糖-單體混合物對B.cereus和E. coli的殺菌反應模擬 機制...19

圖九、革蘭氏陽性菌結構...21

圖十、革蘭氏陰性菌結構...22

圖十一、分子量變化對溶解度與表面電位之影響...53

圖十二、三種品系金黃色葡萄球菌在濃度在400 ppm LMWC_DD92_ chit下之生長曲線圖...55

圖十三、三種品系金黃色葡萄球菌在濃度在800 ppm LMWC_DD92_ chit下之生長曲線圖...56

圖十四、二種品系大腸桿菌與濃度在100 ppm LMWC_DD92_chit下之 生長曲線圖...57

圖十五、二種品系大腸桿菌與濃度在200 ppm LMWC_DD92_chit下之 生長曲線圖...58 圖十六、在不同pH值下金黃色葡萄球菌BCRC 10451的生長情形 ...59 圖十七、在不同pH值下金黃色葡萄球菌BCRC 10780的生長情形 ...60 圖十八、在不同pH值下金黃色葡萄球菌BCRC 10781的生長情形 ...61 圖十九、根據懸浮液殘菌變化量評估不同濃度LMWC對3株金黃色葡

萄球菌吸附作用變化情形...62 圖二十、根據懸浮液殘菌變化量評估不同濃度LMWC對2株大腸桿菌

吸附作用變化情形...63 圖二十一、正常狀態下金黃色葡萄球菌的電子顯微...64 圖二十二、LMWC與金黃色葡萄球菌 (BCRC 10451) 作用1小時（A）

並比較20 mM醋酸緩衝液沖洗後（B）的電子顯微圖...65 圖二十三、LMWC與金黃色葡萄球菌 (BCRC 10781) 作用1小時（A）

並比較20 mM醋酸緩衝液沖洗後（B）的電子顯微圖...66 圖二十四、LMWC與金黃色葡萄球菌 (BCRC 10780) 作用1小時（A）

並比較20 mM醋酸緩衝液沖洗後（B）的電子顯微圖...67 圖二十五、LMWC與大腸桿菌 (BCRC 10314) 作用1小時（A）並比

較20 mM醋酸緩衝液沖洗後（B）的電子顯微圖...68 圖二十六、LMWC與大腸桿菌 (BCRC 10675) 作用1小時（A）並比

較20 mM醋酸緩衝液沖洗後（B）的電子顯微圖...69 圖二十七、萃取3株金黃色葡萄球菌DNA並比較其量 ...70

表目錄

表一、利用幾丁質酶、纖維素、溶菌酶水解不同去以醯度幾丁聚醣所 製備之水解產物及其物理特性探討...52 表二、E. coli及S. aureus之界達電位利用幾丁質酶、纖維酵素、溶菌

酶水解所製備的LMWC之最低抑制濃度的關係...54 表三、界達電位分散體系穩定的標誌...71 表四、3株金黃色葡萄球菌Biolog之GP2 MicroPlate微生物鑑定套組的

96種碳水化合物生化特性試驗結果 ...72

第一章、前言

幾丁質（Chitin）為蝦蟹殼的主要成分，在我國傳統醫學對蝦蟹 殼的藥食作用有所研究，包括《神農本草經》、《本草綱目》、《食 療本草》、《日華子本草》等都記載幾丁質的各方面藥性。

1811 至 1823 年間，法國科學家首度將幾丁質從蕈菇類植物及甲殼類

外殼中分離出並命名，至今已有百餘年歷史。幾丁質（甲殼素）在自

然界產量豐富，但先前並未廣泛被應用，直至1980 年代，科學家發 現幾丁質在生化科技上，具有多項獨特的用途，如抗菌劑、除臭劑、

生醫材料等。幾丁質通常是從蝦蟹外殼中提煉出，如此不僅是將剩餘 廢棄物做利用，減低對環境的污染，同時還增加經濟價值的利用。

幾丁聚醣及其衍生物具抗菌等特性，使其在應用上更被關注，目 前在微生物防治上的主要應用包括防治植物病原菌、防止食品病原菌 生長和延長食品保存期等，有發展成天然殺菌劑的潛力。

儘管幾丁聚醣具有許多生物活性，但是由聚分子所鍵結的高分子長鏈 造成水溶性低的問題，限制其在醫藥及食品工業上的發展，降低分子 量、提高溶解度又能維持其生物活性，為研究的重要目標之一。本研 究利用不同酵素（以Trichoderma viride誘發之幾丁質酶粗酵素液、溶 菌酶、纖維酵素），水解不同去乙醯度的幾丁聚醣。然而各組合產生

之LMWC，其特性皆有所不同，篩選出既不影響抗菌性又能提升溶解 度的水解產物，進而透過不同品系菌種對LMWC的敏感性差異，利用 界達電位、菌體吸附力、SEM等方法，探討其抗菌機制。

第二章、文獻回顧

2.1. 幾丁質

幾丁質為葡萄糖的衍生物，是一種類似纖維素的高分子聚合物，

其不同之處在二號碳上所接的是乙醯胺基（acetyl amino group），由 N-acetyl-glucosamine 以 β-1,4 鍵結合所組成的直鏈聚合物（圖一）。

幾丁質是自然界中僅次於纖維素的天然聚合物，此結構廣泛的存在於 節肢動物（甲殼類、昆蟲）的外殼及真菌、藻類的細胞壁，此外也會 在少數低等動、植物界中，具保護與支持生物體的結構（Shahidi et al., 1999; Ravi Kumar, 2000; Rinaudo, 2006）。

幾丁質普遍存在很多生物體中，但會隨著來源不同而有所差異，

在自然狀態下可依其晶體結構排列方式而有三種不同的形式，分為α-

chitin、β- chitin 和 γ- chitin。α- chitin（圖二）為反平行（anti-parallel，

↑↓↑↓）的雙股螺旋多醣鏈，可形成較多的分子間及分子內氫鍵，

使得構型較為緊密、穩定，自然界中此類型的幾丁質最為普遍，大部 分的昆蟲或蝦、蟹等甲殼類外殼的幾丁質即屬此類。而β-chitin（圖 三）的雙股螺旋多醣鏈為對稱平行 (parallel，↑↑↑↑)排列所形成的 晶型，其分子間及分子內氫鍵較少，故構造較為鬆散，存在於魷魚軟 骨或烏賊軟骨中的幾丁質屬於此類。而 γ-chitin 則為 α-型及 β-型的混

合體，多醣鏈之間為上下相互排列(↑↑↓↑↓↓)，主要存在一般藻 類和真菌類細胞壁結構中（Minke and Blackwell, 1978; Wood and Kellogg, 1988; Uragami and Tokura, 2006）。

圖一、幾丁質結構。

圖二、α - chitin 的排列方式。

2.2. 幾丁聚醣

幾丁聚醣（圖四）是由葡萄糖胺（D-glucoseamine）以β -（1-4）

鍵結而成的高分子多醣類，將幾丁質經過去乙醯作用所製成的產物，

去乙醯度（degree of deacetylation, DD）大於40-50％即可稱為幾丁聚 醣，一般幾丁聚醣的去乙醯程度介於65％-99％（Muzzarelli and Rocchetti, 1985）。目前去乙醯的方式有：（1）熱鹼處理法：利用高 溫強鹼的反應環境進行去乙醯化作用，其去乙醯程度明顯受不同鹼濃 度、反應溫度高低及時間影響，此方法最快速簡單且成本低，但所得 幾丁聚醣品質及物化特性較不穩定，易造成環境污染。（2）酵素法：

利用幾丁質去乙醯酵素（chitin deacetylase）進行去乙醯作用，產物較 穩定且低污染，但作用時間長且反應效率低。（3）真菌發酵法：許 多絲狀真菌的細胞壁中，含有幾丁質或幾丁聚醣，此方法的產物品質 穩定、純度高，但技術尚未純熟仍尚待研發。因此，以其中處理時間 較短的熱鹼法最為常用（Kurita et al., 1977; 陳, 2001; 王, 2003）。

幾丁質和幾丁聚醣不溶於中性及鹼性溶劑中，但幾丁聚醣可以溶 在弱酸性或酸性的有機酸及無機酸中，溶在酸性狀態下使得幾丁聚醣 及其衍生物會成為陽電荷聚電解質（-NH3+）（圖五），這也是幾丁 聚醣較幾丁質具有生物活性且更能應用的原因之ㄧ。

幾丁聚醣具有生物降解性、生物相容性和無毒等特性，在許多領

域都有應用的潛力，包含食品（Shahidi and Synowiecki, 1991）、化 妝品 (Ravi Kumar, 2000)、生物醫學 (Felt et al., 1998)、農業(Yamada et al., 1993)、環保產品（Peniche-covas et al., 1987）和廢水處理

（Jeuniaux,1986）等。

圖四、幾丁聚醣結構。

圖五、在酸性下帶正電荷的幾丁聚醣。

2.3. 幾丁聚醣水解物（chitosan hydrolysate）

2.3.1. 製備方法

Zhang et al., 1999）、化學酸水解法（Il'ina and Varlamov, 2004）、化 學酵素法（Akiyama et al., 1995）、氧化降解法（Mao et al., 2004）、

超音波與剪力降解法（Chen and Chen, 2000）及高速微射流降解法等

（吳, 2002; Kim and Rajapakse, 2005），其中化學及酵素法最廣為使 用。

2.3.2. 化學法

化學法為降解幾丁聚醣的傳統方法，常使用鹽酸（Kendra and Hadwiger, 1984）、磷酸（Hasegawa et al., 1993），亦有研究使用硝 酸（Allan and Peyron, 1995a,b）、硫酸、醋酸等來破壞醣苷鍵，此方 法處理時間短且操作簡單，成本低適合大量製備，然而酸水解為隨意 的水解方式，反應條件不易掌控，其產品再現性低，同時製備過程大 量酸性廢液不但會造成環境污染，中和反應後會造成鹽類的殘留。

2.3.3. 酵素法

酵素法為利用生物性的酵素來水解幾丁質或幾丁聚醣，此方法沒 有鹽類殘留問題，產量較高，再現性也較佳，缺點則是成本偏高。

2.3.4. 常見的水解酵素

用來水解幾丁質之酵素稱為幾丁質水解酵素（chitinolytic

enzymes），主要分為兩大類：專一性酵素（specific enzyme）及非專 一性酵素（non-specific enzyme）。專一性酵素為幾丁質酶（chitinase）, 多以膠體幾丁質誘發菌體所產生。常見的幾丁質酶產生菌有

Streptomyces griseus（Aiba, 1994a）、Trichoderma harzianum,

Rhizoctonia solani（del Soglio et al., 1998）、B. licheniformis SK-1, B.

cepacia TU09（Pichyangkura et al., 2002）、Aeromonas hydrophila

H-2330（Sashiwa et al., 2002）、Penicillium aculeatum NRRL 2129

（Binod et al., 2005）、Lecanicillium fungicola（Ramírez-Coutiño et al., 2006）等菌株。而非專一性酵素多為目前市售可利用來降解幾丁聚醣 的商業酵素，如lysozyme（Aiba, 1992; 1994b）、cellulase, α-amylase, proteinase（Zhang et al., 1999）、hemicellulase, lipase, pectinase

（Sukwattanasinitt et al., 2002; Sashiwa et al., 2003）、pepsin, papain,

（Ilankovan et al., 2006）等酵素。

2.3.4.1. 幾丁質酶

這類的酵素屬於glycosidases（EC 3.2.1.14），用在切斷glycosidic bond，chitinase依其催化功能區（catalytic domain）被歸類於family 18 和19中。若根據其特性以及作用方式的不同則可以分為二大類：一為 endochitinase（EC 3.2.1.14），可以隨機將大分子chitin由中間切開，

成水解成較小片段的chitosan；另一類為exochitinase，可分為兩種：

chitobiosidases（EC 3.2.1.29），兩者可分別從小分子chitin之非還原端 (non-reducing end)水解，釋放出dimer及N-acetyl-glucosaminidases（EC 3.2.1.30）（Patil et al., 2000）。

圖六為幾丁質酶降解幾丁質之水解機制（Aiba, 1994a）。（a）

為去乙醯度90%、（b）為去乙醯度70%、（c）為去乙醯度50%，白 圈所代表的為glucosamine，黑圈代表的為N-acetyl-D- glucosamine，

chitinase 能隨意的從N-acetyl-D- glucosamine端將切除glycosidic bond，而無法從glucosamine的還原端進行水解。

圖六、幾丁質酶作用不同去乙醯度幾丁聚醣之機制。（Aiba, 1994a）

2.3.4.2. 溶菌酶

溶菌酶發揮溶菌作用的最適pH值在8.0 - 9.0左右（Davies et al.,

圍內。溶菌酶在pH 1.2～11.3 的廣泛範圍內，都沒有發現溶菌酶活性 有任何改變，因此溶菌酶對酸鹼度的變化不敏感。

目前已證實溶菌酶必須有三至六個N-乙醯葡萄胺醣才具有水解 切點（圖七）（Aiba, 1992）。而以lysozyme 作為水解酵素時，最佳 的水解樣品其去乙醯度為56％，當樣品去乙醯度為11％或97％時均無 法水解（Kurita et al., 2000）。

圖七、溶菌酶水解作用於兩種型態的幾丁聚糖。(●)N-乙醯-D-葡萄胺 醣，(○)D-葡萄胺醣，(E)溶菌酶（Aiba, 1992）

2.3.4.3. 纖維酵素

纖維酵素為一複合酵素，可將不具溶解性的纖維素分解成單糖

（Wood, 1985），於蝸牛的消化液、吃木質部的昆蟲類、微生物等含 有此酵素，而反芻動物則是其腸道內的微生物會產生纖維酵素，故可 分解纖維素。該酵素系統包括三大型式：

（1）內切型纖維素纖維分解酵素（Endo-β-1,4-D-glucanase，E.C.

3.2.1.4）：

內切型纖維素纖維分解酵素又稱為Cx、CMCase、

carboxymethylcellulase、endoglucanase、β-1,4-D-glucanhydrolase、

β-1,4-D-glucan-4-glucanhydrolase，為一種glycoprotein，分子量約為53 kDa～145 kDa。該酵素之可以作用在纖維素內部的非結晶區，以非特 異性的方式打斷纖維素的β-1,4鍵結，減少纖維素聚合度之程度，並得 水解產物葡萄糖、纖維二糖、纖維糊精，也可分解羧甲基化纖維素

（CMC）。

（2）外切型纖維素纖維分解酵素（exo-β-1,4-D-glucanase，E.C.

3.2.1.91）：

外切型纖維素纖維分解酵素又稱C1、avicelase、cellobiohydrolase

、exocellobiohydrolase、cellulose-β-1,4-glucancellobiohydrolase或 Exo-glucanase，也是為一種glycoprotein，分子量約為42 kDa - 65 kDa

（吳, 2005）。該酵素此酵素可分解結晶型纖維素，亦可從纖維素的 非還原端開始降解，每次以纖維二醣為一單位水解成纖維二糖，與內 切酶共同作用時，對分解結晶型纖維素具有良好的效果（程, 2001）。

（3） β-葡萄醣苷酵素（β-1,4-D-glucosidase, E.C. 3.2.1.21.）：

β-葡萄醣苷酵素，亦稱為β-glucosidase、cellobiase或β-1,4-gluco- hydrolase，同樣是一種glycoprotein，分子量約為50 kDa - 410 kDa。此 酵素是針對纖維雙醣或纖維寡醣自非還原端以葡萄糖為一個單位水 解（尤, 2003; 吳, 2005）。此外，該酵素可水解纖維二醣和水溶性

cello-oligosaccharides變成葡萄糖，而減少纖維二醣對Cx酵素或Cl酵素 抑制作用，而β-glucosidase的活性，亦會受產物葡萄糖的抑制。

2.4. 幾丁聚醣及其水解物的功能與應用

幾丁質與幾丁聚醣與生物體細胞有良好的生物相容性，不具毒性 且可以被生物體分解，並具有生物活性，因此可應用的領域非常廣 泛，包括機能保健食品、醫藥用品、食品加工、化妝品、紡織、環保、

農業、化學工業及抗菌等。

在醫藥方面，可作為人造皮膚、創傷敷材和手術縫紉線等醫療用 品。在保健食品方面，有增強免疫及防止老化等效果。於食品加工上，

可作為防腐劑、結合劑等。在農業上，屬於無公害農藥且能促進植物 之生長。在化工應用上，可用於製造保濕化妝品或機能性紡織品。在 環保應用上，能淨化水質和吸附重金屬。在生醫材料應用上，可作為 藥物或營養素之控制釋放性擔體（delivery system）或抗菌化材（莊, 2006），以下介紹其幾個重要生理活性：

2.4.1. 降低脂肪與膽固醇

幾丁聚醣本身的正電荷會與帶負電的脂肪結合，形成膠狀物質，

因此阻斷脂肪被小腸吸收代謝（Deuchi et al., 1994；Ormrod et al., 1998），目前市面常有所謂減肥之健康食品─甲殼素，便是利用此特 性降低脂肪，並配合適當飲食及運動達到減重瘦身效果（袁, 2000）。

2.4.2. 提高免疫力

幾丁質類物質能夠增進免疫球蛋白的活性，誘發巨噬細胞，有助 於增強免疫系統（Maeda et al., 1992；Shibata et al., 1997）。

2.4.3. 抗腫瘤活性

有研究指出幾丁質及其衍生物具有抑制腫瘤細胞生長的特性，其 會在腫瘤細胞外圍形成一個膜，導致腫瘤細胞生長受到限制（Saiki et al.,1990；Tsukada et al., 1990）。此外也有學者將幾丁聚醣製備成幾

丁聚醣奈米顆粒（chitosan nanoparticle, CNP），進行對肝癌細胞體外 及體內生長抑制之研究，在體外（in vitro）及體外試驗（in vivo）中，

CNP能殺死裸鼠肝癌細胞 (BEL7402)，顯示CNP具有高度的抗腫瘤活 性。在電子顯微鏡下發現CNP能誘導細胞壞死（necrosis）及DNA片 斷化 (DNA fragmentation)，造成腫瘤組織的型態有壞死的現象，對 正常肝組織並無異常現象發生（Qi, 2007）。

2.4.4. 抗氧化性

目前已發現幾丁質及其衍生物具有良好的抗氧化力，已發 現其能夠抑制脂質過氧化、抑制TBARS（thiobarbituric acid reactive substance）生成，且對羥基自由基（hydroxy radical）有良好的清除 能力（Matsugo et al., 1998；Xue et al., 1998；Xie et al., 2001；Huang et al., 2005；Chien et al., 2007；Kim and Thomas, 2007；Yen et al., 2007）。

2.4.5. 促進傷口癒合、凝血

幾丁質類物質使用在傷口上，除了具有抗菌的功效且其不會引起 發炎反應，在受傷部位會促進受傷區域重新生成，故有促進傷口癒合 之能力（Biagini et al., 1991；Chung et al., 1994）。除此之外幾丁質類 物質被發現具有凝集作用，會促進血小板分泌凝血因子，進而達到止 血的效果（Subar et al., 1992；Shigehiro, 1999）。

2.4.6. 幾丁聚醣及其水解物的抗菌活性

利用生物性物質如幾丁聚醣或其衍生物作為防制儲藏性的細 菌、真菌等微生物病害的抗菌劑，已受到相當的重視。因為化學防治 法已面臨了以下的問題，包含（1）對抗生素產品產生抗藥性，（2）

許多化學性抗菌劑普遍具有副作用，（3）消費者是水準提升，普遍 標榜「天然」的物質才具有吸引力。

先前研究發現在培養基中添加高濃度的幾丁聚醣（1-1.5%），以 2%醋酸調整pH值至5.5或6.5，於作用2天後即能對S. aureus，達到完 全抑制的效果（Wang, 1992）。此外由蝦殼萃取製成的幾丁聚醣，其 濃度只要超過0.02%以上即對Bacillus cereus有抑制效果，而對於E.

coli與Proteus vulgarls而言只需超過0.0075%以上便能抑制（Simpson et al., 1997 ）。Rege等學者發現，總括具有抗菌活性的幾丁聚醣其去 乙醯度介於70％至95％，而其分子量介於50至2000 kDa（Rege et al.,

2003）。而去乙醯度70％之幾丁聚醣可抑制革蘭氏陽性菌10 - 20％及 革蘭氏陰性菌20 - 40％，當幾丁聚醣之去乙醯度提高至90％可抑制革 蘭氏陽性菌15 - 35％及革蘭氏陰性菌40 - 60％（Chen et al., 2002）。

對抗真菌作用方面，研究以指出幾丁聚醣亦具有抗真菌活性，其

（含7.2% NH2）在高濃度下能明顯抑制Rhizopus stolonifer、Botrytis cinerea及Alternaria alternata等生長，且抑菌活性也是隨去乙醯度增加

而提升。此外有學者（Fang, 1994）將幾丁聚醣添加至低糖金桔蜜餞 中進行防腐試驗，其結果發現當濃度達4-5 mg/mL（pH5.4），對 Aspergillus niger有抑制效果，雖然能力較己二烯酸甲低（1.3

mg/mL），但可完全抑制A. parasiticus所生合成的黃趨毒素。雖然幾 丁聚醣具有抗真菌活性，但ㄧ般而言，其抗菌效果低於對細菌的作 用，除了對部份植物病原菌具良好的抑制效果，對許多食物污染的黴 菌，其效果普遍需在高濃度下才具可接受的抑制作用。

2.5. 影響抗菌活性之因子

有關於幾丁聚醣抗菌活性應用在各領域的議題，已受許多學者研 究及討論，影響幾丁聚醣的抗菌能力因素很多，主要包括以下幾點：

2.5.1. 去乙醯度

研究指出（蔡, 1993）利用蟹殼所製備的幾丁聚醣，針對幾丁聚 醣的去乙醯度對細菌的抗菌效果有明顯影響，此研究的抑菌效果分別

為Samonella typhi ＞E. coli ＞S. aureus ＞B. cereus。其他研究中發 現，幾丁聚醣去乙醯度的不同會影響其抑菌強弱，DD80、DD60對 Shigella sonnei的抑菌力分別為32.7及11.4%，而對Pseudomonas

fluorescens則為30.5及13.4%。雖然文獻間會因為所使用的菌種各有不

同，其抗菌活性也會有所差異，但皆受去乙醯度的影響。

幾丁聚醣的抗菌能力主要來自於胺基官能基的作用，皆呈現隨去 乙醯度增加，其抗菌活性會有所提升（Tsai and Su, 1999; Chen, 2002;

Chung, 2004）。

2.5.2. 分子量

幾丁聚醣之功能除了與化學結構有關，另外也與分子大小有關

（Babiker, 2002；Qin et al., 2002；Qin et al., 2004）。低分子量之幾丁 聚醣具有較佳之滲透性（Chen and Hwa, 1996），而研究指出幾丁聚 醣的聚合度大於六個才具有較強的生物活性（Tsai et al., 2000; Jeon et al., 2001; Muzzarelli, 2002; Kim and Rajapakse, 2005），但當分子過大

時會使其溶解度低，不適合應用於醫藥及食品工業上（Belmonte et al., 1997；Ilyina et al., 2000）。

2.5.3. 溶解度

因為幾丁聚醣在中性下溶解度差，縱使有不錯的生物活性，仍會 影響其在食品等領域上的應用。目前有許多幾丁質類的產品，可藉由

酵素、物理或化學水解降低分子量成寡醣或單醣等形式，有效提升免 疫力。

進年來，幾丁質及其衍生物有著不同的作用及應用範圍，不同分 子量與去乙醯度的幾丁聚醣，其溶解度都不一樣，因此幾丁聚醣的應 用形式與其用途，可根據其溶解特性不同，使用在不同領域，如低溶 解度可作為生醫材料的敷料、高溶解度可以用在食品、醫藥等抗菌或 抗腫瘤試劑（陳, 2000; 袁, 2000）。

2.5.4. 電荷密度

幾丁聚醣在酸性的條件下會受質子化作用成具帶正電荷（-NH3+） 的官能基，此電荷會干擾並中和細菌表面所帶的陰電荷（Strand et al., 2001, 2002, 2003），改變細胞壁結構並增加其通透性，造成其胞器外 漏，使細胞死亡，此研究中也指出幾丁聚醣的電荷密度越強，其抗菌 活性也會跟著提升；相反當細菌表面帶越多負電荷，其也越容易受幾 丁聚醣的影響。

2.6. 目前研究的抗菌機制

幾丁聚醣及其衍生物的抗菌活性已研究許多年，許多影響抗菌因 子皆已確定，但其確切的抗菌機制尚不明朗，但原因大致有二，一為 當幾丁聚醣溶於pH值小於6.0的溶液時，幾丁聚醣會呈現正電荷，而 所產生的正電分子會和細菌細胞膜所漏出的蛋白質或其他負電分子

形成交聯，而且幾丁聚醣會選擇性的與金屬離子結合，因此可將幾丁 聚醣視為一種螯合劑，可能會以吸附或穿孔的兩種狀態造成細胞膜之 瓦解（Tsai et al., 2000；Helander et al., 2001；Liu et al., 2004；Li et al., 2007）；二是小分子的幾丁聚醣可能會滲入菌體，之後與結合DNA 而阻止mRNA的轉錄及降低細胞活性。有研究指出，短鏈幾丁聚醣進 入細胞後，藉由與DNA錯合影響染色體結構，進而阻止RNA生合成 並降低細胞生命力，達到抑菌的效果（Hadwiger et al., 1986；Shahidi et al., 1999）。

根據學者的研究，幾丁聚醣其單體及寡聚體對革蘭氏陽性菌及革 蘭氏陰性菌的抗菌機制有所差異。對於革蘭氏陽性菌 B. cereus 主要 是以單體或寡聚體與細胞膜壁表面形成氫鍵，造成細胞膜壁的扭曲變 形，內部物質流出而造成菌體死亡。對革蘭氏陰性菌 E. coli 則是幾 丁寡醣會與脂多醣體（lipo-polysaccharide, LPS）作用，形成吸附於細 胞膜壁表面的情形，造成營養、代謝及通透的障礙（Tsai et al, 2000；

Helander et al., 2001；Vishu Kumar et al., 2005），圖八為兩種可能機 制的示意圖。

圖八、幾丁寡糖-單體混合物對B.cereus和E. coli的殺菌反應模擬 機制。（Vishu Kumar et al., 2005）

2.7. 細菌細胞壁的介紹

細胞壁是細菌外層的一種堅固結構，主要由胜肽聚醣

（peptidoglycan）所構成。胜肽聚醣顧名思義是胜肽（peptides）與多 醣glycans 的聚合物，主要成分有兩種醣類：N-acetylglucosamine

（NAG）和 N-acetylmuramic acid（NAM）。每條 glycan 接著很多短

胜肽，這些胜肽類一般以四個氨基酸連成一串接上NAM 上，形成側

鏈，各側鏈再以胜肽鍵（peptide bond）連接，如此的聯結使得細胞 壁形成複雜的網狀結構，緊密的堆積在細胞膜外。

細胞壁除了具有保護與支持菌體的作用，也是細胞生長與分裂所 必須。細胞壁的一些成分具有抗原性，可引發抗體的產生，也與病原 菌的致病性有關，更是決定對抗菌劑及噬菌體敏感性的所在。

細菌因細胞壁結構的不同，可透過染色鍵定，分為兩種類型︰革 蘭氏陽性（Gram-positive）菌和革蘭氏陰性（Gram-negative）菌，染 色的差異反映了結構和化學組成的不同（鄧, 1987）。

2.7.1. 革蘭氏陽性菌

革蘭氏陽性菌（圖九）的細胞壁，主要由厚的胜肽聚醣加上台口 酸（teichoic acid）所形成ㄧ層厚而堅固的結構，細胞壁厚達 15 - 35 nm。組成成分中的台口酸是由磷酸雙酯所連結的甘油或核糖醇

（ribitol）聚合物，台口酸與脂台口酸（lipo-teichoic acid）可由胜肽 聚醣層中伸出細胞外，是決定陽性菌表面抗原的所在，也與離子進出 細胞有關（Campbell and Reece, 2002; 楊, 2003）。

圖九、革蘭氏陽性菌結構。

2.7.2. 革蘭氏陰性菌

革蘭氏陰性菌（圖十）的細胞壁較薄（10 - 15 nm），在結構上 有明顯的差異，其中胜肽聚醣含量很少，主要為脂蛋白（lipoprotein）、

外膜（outer membrane）與脂多醣等結構組成。（1）脂蛋白是胜肽聚 醣層與外膜間的連接橋樑；（2）外膜是細胞膜的雙層磷脂質結構，

外膜內含特殊的蛋白質，提供一定的孔隙以供管控進出，對於大分子 物質如抗菌劑或酵素便有主阻礙的作用。（3）脂多醣，是由脂質 A

（lipid A）與多醣類（polysaccharide）所構成負電荷結構，其中脂質 A 與外膜相連，當菌體溶解後便會釋出，脂質 A 具有毒性且為細胞 壁的成分之ㄧ，所以也稱為內毒素（endotoxin）。脂多醣的多醣體是 由多種不同單醣聚集而成的核心多醣，利用側鏈附著在外膜上，形成 菌體的最表面結構，具有抗原性，稱為O 抗原（O-antigen）（Campbell

and Reece, 2002; 楊, 2003）。

圖十、革蘭氏陰性菌結構。

2.7.3. 革蘭氏陽性菌與陰性菌比較

（網路資料：http://www.tchcvs.tc.edu.tw/nerc/home/u1/ch7/poison/aaa-3.htm）

性 質 革 蘭 氏 陽 性 菌 革 蘭 氏 陰 性 菌

1.染色結果 仍維持紫色 由紫色變為紅色

2.細胞壁組成 脂質含量較少(1-4%) 脂質含量較多(11-22%) 3.細胞壁結構 單層，且較厚(15-80 nm) 三層，且較薄(10-15 nm) 4.對鹼液的抵抗力 不溶於 10% KOH 中 可溶於 10% KOH 中

5.孢子之產生 常見 少見

6.對物理狀況之抵抗力 大 小

7.營養需求 多數都較複雜 需求簡單

8.常見的菌種 大多數的球菌和產孢桿菌 非產孢桿菌

第三章、實驗材料與方法

3.1. 研究架構

幾丁聚醣 水解酵素

水解酵素

(DD80、DD92)

(chitinase, lysozyme, cellulase)

LMWC製備

LMWC物理LMWC物理 性質分析 性質分析

LMWC抗菌相關 特性分析

Staphylococcus aureus BCRC 10451、10780、10781

Escherichia coli BCRC 10314、10675

DNADNA

分 析 分 析

MICMIC

菌 體 吸 附 菌 體 吸 附

SEMSEM

溶溶 解解 度度

Zeta potentialZeta potential

粒粒 徑徑 分分 析析

殘 菌 分 析 殘 菌 分 析

Zeta potentialZeta potential

機制探討

3.2. 實驗器材

3.2.1. 儀器及設備

1. 無菌無塵操作台：晉暉機械股份有限公司, H2-VCM420, 台中 2. 低溫培養箱（low-temp incubator）：Kansin instrument co., LTD,

LTI601, 台灣

3. 迴轉式震盪培養箱：Kansin instrument co., LTD, RT01A, 台灣 4. 掃瞄式電子顯微鏡 (SEM)：Tescan s.r.o., Vega TS 5136 MM, Brno,

Czech

5. 鍍金機（gold and carbon sputter coater）：Cressington scientific instruments Ltd., cressington 108, England (U.K.)

6. 離心機：Hermle machine company LLC, Z323 MK-2, German 7. 顯微鏡：Nikon corporation, optiphot-2 upright, Japan

8. 滅菌釜：Tominaga co. LTD., SS320, Japan

9. 分光光度計：Thermo fisher scientific Inc., Bionate 3, U.S.A.

10. 水浴槽：Firstek scientific Co., Ltd, 台灣

11. pH meter：上泰儀器股份有限公司, Suntex SP-701 pH/mV/Temp meter, 高雄

12. 黏度計: 安邦儀器有限公司, Bro okfield HADV-Ⅱ＋

(Programmable DV-Ⅱ＋viscometer）, U.S.A.

灣

14. 微生物培養增殖分析儀（Bio-photorecorder）：Advantec MFS Inc., TN-1506, Tokyo（Japan）

15. MicroStation™ System : BioLog Inc., U.S.A.

16. Microstation ELISA reader：BioLog Inc.,E11010, U.S.A.

17. Microlog software : Biolog MicroLog3 release 4.2 18. Microlog Turbidimeter : BioLog Inc., U.S.A.

19. Biolog microplate : Biolog Inc., U.S.A.

20. 迷你電泳槽及鑄膠器：MJ-105, Violet Bioscience inc, U.S.A.

21. 紫外光透照箱 ( UV Transilluminators ): BioRed, U.S.A.

22. 影像分析系統（Digital gel image system）：BioRed, DGIS-7, U.S.A.

23. 數位相機：C765UZ, Olympus, Japan

24. 粒徑分析儀-分子量（Zetasizer nano S90）：ZEN1590, Malvern, U.K.

25. 粒徑分析儀-界達電位（Zetasizer nano Z）：ZEN2500, Malvern, U.K.

3.2.2. 樣品

幾丁質、幾丁聚醣購自應化企業有限公司，台北。幾丁聚醣去乙 醯度80 %、92 %，分子量約 300 kDa。

3.2.3. 實驗菌株

木黴菌（Trichoderma viride）：BCRC 32054。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）：BCRC 10451、BCRC

大腸桿菌（Escherichia coli）：BCRC 10314、BCRC 10675。

菌株皆購自於食品工業發展研究所，生物資源與發展中心。

3.2.4. 藥品清單

Acetic acid ( Fluka, Switzerland)；Glucose、sucrose、NaNO3、 MgSO4‧7H2O、KCl、FeSO4‧7H2O（Yakuri, Japan）；K2HPO4、 NaHPO4‧H2O、Na2HPO4（Merck, USA）；CH3COOH（Fluka,

Switzerland）；CH3COONa（RDH, Germany）；trytone soya broth （TSB）

(Himedia M011)；soyabean casein digest agar, trytone soya agar（TSA）

(Himedia M290)；potato dextrose broth（PDA）(Himedia M403) (Himedia, India)；agar bacteriological (agar No.1 )(Oxoid LP0011, UK)；ethidium brmide (Amrel S10, USA)；Agarose（VIO-A500）(Basic Life,USA) 3.2.5. 商購酵素

Cellulase（EC 3.2.1.4）：C2730, from Trichoderma reesei ATCC 26921 aqueous solution, ≥700 units/g

,

Lysozyme（EC 3.2.1.17）：L7651, from chicken egg white lyophilized powder, protein ≥90 %, ≥40000 units/mg, 購自於Sigma。（U.S.A.）

3.3. 實驗方法

3.3.1. 幾丁質酶粗酵素之誘發 1. 膠體幾丁質製備

將25 g幾丁質粉末緩緩加入500 mL濃硫酸中，並作充分攪拌約 2小時。加入5 L蒸餾水至該幾丁質懸浮液中，過程中持續進行攪 拌，待其成為白色沉澱的膠體幾丁質，以大量蒸餾水反覆洗滌，

使其pH值達中性，最後將固形物懸浮於蒸餾水中。取懸浮液利用 熱風乾燥測其固形物含量，最後將懸浮液配製成含量約1.5 %固形 物之膠體幾丁質 (

Roberts and Selitrenkoff, 1985）。

2. Trichoderma viride 之幾丁質粗酵素誘發

將Trichoderma viride菌種凍管於37^oC快速解凍，取100 μL菌種 保存液於PDA平板中，置室溫培養7天的條件下，連續接種兩代促 使菌株恢復活性。

以2 mL無菌蒸餾水將活化後之木黴菌孢子洗下，接種至一培 培養基中，在室溫下震盪 (150 rpm) 培養5天。無菌紗布過濾後，

取得菌絲體，用蒸餾水將菌絲體表面糖分洗去，接種至二培培養 基，在室溫下震盪培養4天（林, 2007），發酵液經離心去除沉澱 物後，視為幾丁質粗酵素液，並保存於-20^oC（Chen and Lin, 2004）。

幾丁質酵素誘發培養液配方如下：

一培培養基（菌絲體增殖培養基）：40 g glucose，12 g sucrose，

1.2 g NaNO3，0.2 g MgSO4‧7H2O，0.2 g KCl，0.004 g

FeSO4‧7H2O，0.4 g K2HPO4，ddH2O定量至400 mL，pH調至7.2。

二培培養基（酵素誘發培養基）：6 g 膠體幾丁質（final 1.5

%），1.2 g NaNO3，0.2 g MgSO4‧7H2O，0.2 g KCl，0.004 g FeSO4‧7H2O，0.4 g K2HPO4，ddH2O定量至400 mL，pH 調至7.2。

3.3.2. LMWC 製備

幾丁聚醣粉末溶於100 mM 醋酸緩衝液中（pH 4.0）配製成1 % (w/v) 幾丁聚醣溶液，分別加入三種酵素：幾丁質粗酵素液（200 Unit/g chitosan）、溶菌酶（4 x 10⁷ Unit/g chitosan）、纖維酵素（700 Unit/g chitosan），在42℃水浴下震盪反應，取水解時間1天之水解 產物，於100^oC下水浴加熱15分鐘使酵素失活，冷卻至室溫後再沸 水浴煮30分鐘，並重複冷卻及水浴三次，使水解產物達無菌狀態

（此方法可避免在121℃下造成樣品產生褐變反應）（陳, 2006）。

3.3.3. LMWC 分析

3.3.3.1. 分子量測定

使用黏度計Brookfield HADV-Ⅱ＋（programmable DV-Ⅱ＋

viscometer），探頭為H1 探頭，設定轉速為100 rpm。取不同組合的 酵素水解產物400 mL至燒杯中，於室溫下（30℃）測其黏度（cp）變 化，並以Mark-Houwink-Sakurada方程式求得intrinsic viscosity分子量

（Kasaai et al., 2000; Sobhanmanesh and Hajizadeh, 2005; Ramírez-

Coutiño et al., 2006; Li et al., 2007）。Mark-Houwink-Sakurada方程式：

[η] = K．q MHS．MW^a = 1.49 x 10^-4 ． MW^0.79 3.3.3.2. 溶解度

酵素水解產物於室溫下經過 200 mM phosphate buffer（pH 7.0）

以1：1 的比例中和後，6000 rpm 離心 20 分鐘，將上清液與沈澱

物分離，取其沈澱物水洗三次，以去除溶劑，於60℃的烘箱中烘

乾後秤重，計算其溶解度（林, 2007）。

溶解度（％）＝［（樣品重－烘乾後重）/ 樣品重］ × 100 為了解抗菌實驗之培養環境 pH 值對 LMWC 溶解度之影響，

將LWMC 加入至不同 pH 值的 TSB 培養基中（pH 4.5-7.5），混 勻後以濁度計偵測其透光率。

3.3.3.3. 粒徑與界達電位分析

將酵素水解物（溶在 pH 4.0 醋酸緩衝液中）以 0.2 μm 濾膜過 濾可能的雜質，菌體方面是先將細菌活化培養（16-24 小時），直 接吸取菌液進行偵測，在吸取樣品時，需小心避免產生氣泡將樣 品溶液打入界面電位測量槽中（cuvette），利用 zetasizer nano S90 及zetasizer nano Z 的動態光散射法測定平均粒徑、界達電位與分 佈，動態光散射之操作條件為：波長633.0 nm、室溫下、光散射 角度90^o。

3.4. 抗菌活性試驗與機制探討

3.3.4.1. 菌株培養

S. aureus（BCRC 10780, BCRC 10781, BCRC 10451）於TSB 培養基；E. coli（BCRC 10314, BCRC 10675）培養於NB，兩種菌 株皆在37^oC下培養14-16小時，此時為stationary phase，菌液菌數約 為1-5 x 10⁹ cfu/mL。

3.3.4.2. 菌種鑑定

利用針對表現型(phenotype)進行分析的Microstation Biolog微 生物鑑定套組，以測試生化特性進行菌種鑑定。此菌種鑑定系統 利用含95種脫水碳水化合物的生化套組（96孔微量盤）進行反應，

針對其對不同碳源產生表現型差異之數據，與Microstation Biolog 提供的菌種資料庫進行比對與鑑定。

菌株接種於含5 %羊血的BUG固體培養基（BUG + B），在37^oC 下培養14-16小時，利用無菌棉棒抹取培養於BUG+B培養基之菌株 菌落，並將沾有菌落之棉棒均勻在含3滴5 mM Sodium thioglycolate 試劑之GN/GP-IF溶液中，並配合使用Microlog Turbidometer調整接 種液透光度，達20 %T時，分別取150 μL之接種液至GP2 Microplate 之96孔洞，37^oC下培養16-24小時，使用Biolog Microlog 4.2軟體判 讀結果，進行菌種比對與鑑定。

3.3.4.3. 不同 pH 值培養條件下的影響

取20 μL活化後的菌液至調整不同pH值（pH 4.5-7.5）之TSB 培養基中，觀察pH對S. aureus與E. coli生長的影響。

3.3.4.4. 抑菌試驗

(1)96 微孔盤抗菌活性測試 (微量試驗)

水解物以20 mM acetic buffer （pH 4.0）作連續對半稀釋，取 50 μl置入96微孔盤中，再加入50 μl之40 mM phosphate buffer（ pH 7.0），最後加入100 μl活化後的菌液，培養於37 ℃下，以ELISA reader OD590於每12小時測其濁度變化，繪出生長曲線，判斷最低 抑制濃度（林, 2007）。

抑制時間（inhibitory time, IT）定義為菌株生長在遲滯期（lag phase）狀態所延長之時間。抑制時間＝（實驗組菌株生長於lag phase 之時間）－（對照組菌株生長於lag phase 之時間）。

最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration, MIC）定義 為。菌株在與樣品培養後，其遲滯期（lag phase）比對照組多48 小時的濃度。

(2) 微生物培養增殖分析儀抗菌活性測試 (增量試驗)

將水解物以100 mM acetic buffer（pH 4.0）稀釋，添加至裝有 TSB培養基的L型管中，加入與水解物等量的200 mM phosphate

buffer（pH 7.0），最後加入10 μL活化後的菌液，使用微生物培養 增值分析儀進行培養及觀測其濁度變化（陳, 2006）。

3.3.4.5. 菌體吸附試驗

將不同濃度水解產物加入事先培養之 10mL 菌液，震盪反應 1

小時，靜置約30 分鐘待其沉澱，隨後吸取上清液以塗抹方式計算

其尚未被水解物作用吸附的剩餘菌數。

3.3.4.6. 掃瞄式電子顯微鏡

分別將 S. aureus (BRCR10451、10780、10781) 與 E. coli（BRCR 10314、BCRC 10675）於 37℃下培養 14-16 小時 (1~5 x 10⁹

CFU/mL)。加入 800 ppm 之幾丁聚醣酵素水解物於菌液中，菌液 與幾丁聚醣水解產物震盪培養1 小時，沉澱靜置約 30 分後取樣。

樣品菌液分別以 (1)未經 100 mM 醋酸緩衝液洗滌幾丁聚醣水解 物，及 (2)有 100 mM 醋酸緩衝液將包覆細菌之幾丁聚醣水解物洗 下，稍後將兩種不同處理方式之菌液樣品以12,000 x g 離心 10 分 鐘，去上清液後加入1 - 2.5 % formaldehyde 或 glutaradehyde 電顯 固定液體中(以 200 mM 磷酸緩衝液配置，pH 7.0)，於 4℃下浸泡 1 小時，隨後以50-100 %乙醇進行系列脫水，將已乾燥之樣品粉末 黏附於載物檯上並進行鍍金包覆(120 秒)，最後在電子顯微鏡下檢 視樣品(20 kV)。

3.3.4.7. Genomic DNA 之抽取（使用 ZR Fungal/Bacterial DNA Kit

進行萃取）

取 2 mL 的菌液，4,000 x g 離心 10 分鐘，去上清液後將沉澱 物以二次水或200mM 磷酸緩衝液（等張溶液）回溶，並重複 2-3 次以去除培養基，最後將沉澱的菌以200 μL 回溶並移至裝有 lysis buffer 的 ZR bashingbead lysis tube 中高速震盪 5 分鐘，再以 10,000 x g 離心 1 分鐘。取 400 μL 上清液至 Zymo-Spin IV Spin Filter 並套 上收集管後，以7,000 x g 離心 1 分鐘，後加入 1,200 μL

Fungal/Bacterial DNA Binding Buffer 至 Zymo-Spin IV Spin Filter，

7,000 x g 離心 1 分鐘，收集管內取得 1,600 μL 混合液。取 800 μL 混合液至Zymo-Spin IIC Column 並接上新的收集管，10,000 x g 離 心1 分鐘，重複二次，隨後將此收集管丟棄。加入 200 μL DNA Pre-Wash Buffer 至已接上新收集管的 Zymo-Spin IIC Column，

10,000 x g 離心 1 分鐘，再加入 500 μL Fungal/Bacterial DNA Wash Buffer 並 10,000 x g 離心 1 分鐘。最後將 Zymo-Spin IIC Column 接 上無菌微量離心管，加入100 μL DNA Elution Buffer，10,000 x g 離心30 秒，可取得回溶於 buffer 中的 DNA。

0.2 g 洋菜粉末加入 20 mL 1x TBE buffer 製備 1% agarose gel，

置於微波爐中加熱使洋菜粒全溶，倒入鑄膠器內待其凝結。樣品

加入追蹤染劑，與DNA marker 進行電泳，連接電源插頭（黑色為

負極，紅色為正極）到電源，帶負電荷的DNA 分子會由負極移向

正極，在50V 下跑膠約 1 小時。之後以 EtBr（~0.5µg/mL）染色 30 分鐘，在以水退染 5 分鐘，把洋菜膠放在 UV 透射光源板上觀 察與拍照。

第四章、結果與討論

4.1. LMWC 分析

幾丁聚醣為一良好的天然殺菌劑，去乙醯度與分子量為影響幾丁 聚醣性質最主要之因素之一。然而幾丁聚醣水溶性低，因此利用酵素 水解製備LMWC 以增加溶解度，提升應用性。

幾丁聚醣可以在弱酸下溶解成膠體溶液 (colloidal solution)，透過 酵素水解可降低其分子量使其黏度下降。根據Kurita et al. (2000)的研 究指出，以lysozyme 作為水解酵素時，最佳的水解樣品去乙醯度為 56%，當去乙醯度為 11%或 97%時，會因為攜帶過多或過少的乙醯基 而造成水解程度不佳的現象。chitinase 則對 NAG 單體有較高的水解 專一性，當去乙醯度高時，僅能切割部分乙醯化的部位，大部分以大 分子產物為主 (Aiba, 1994a)。Cellulase 具有水解 NAG/AG 活性 (Pantaleome, 1992)，水解活性會隨去乙醯度的增加而有所提升 ，因

為較高的去乙醯度能增加幾丁聚醣的溶解度（通常高於70%），其溶

解度較佳，使得酵素作用較完全（Tsai, 2000）。本實驗使用 DD80 與DD92 作為酵素水解的基質，以商業酵素 lysozyme、cellulase 與實 驗室自行誘發之chitinase 作為水解酵素，製備高溶解度的 LMWC。

4.1.1. 分子量與粒徑變化

學者（Kasaai et al., 2000）已發現黏度與分子量之間的相關性，

透過Mark-Houwink- Sakurada方程式可以推算水解物的平均分子量。

雖然酵素活性的強弱會影響水解速度，但本實驗著重於酵素水解的結 果，由於酵素本身專一性特性所致，在充足反應時間內，水解產物的

分子量會趨向穩定。表一的結果顯示，幾丁聚醣的分子量（MV）會

在水解3小時內由300 kDa驟降至13-37 kDa，經過水解24小時後便會趨 近穩定的大小，其分子量（MV）大小排列依序為：DD92_lys (24.8 kDa)、DD80_lys (14.8 kDa)、DD92_chit (13.5 kDa)、DD80_chit (9.6 kDa)、DD80_cel (8.1 kDa)、DD92_cel (6.9 kDa)。從lysozyme和chitinase 水解產物皆出現高去乙醯度之幾丁聚醣產製之LMWC分子量大於低 去乙醯度者。由於lysozyme必須有三至六個N-乙醯葡萄胺醣((NAG)3-6) 才具有水解切點，chitinase只需一個N-乙醯葡萄胺醣 (NAG)，此說明 了lysozyme水解切點較少，因此LMWC_chit分子量會大於LMWC_

lys；同理低去乙醯度之切點較高去乙醯度者多，越容易被水解。

Cellulase能辨識β-1,4-葡萄醣苷鍵，幾乎能完全水解幾丁聚醣，得到分 子量最小的水解產物，然而LMWC_cel不同於其他兩種水解產物，其 分子量為DD80_cel大於DD92_cel，推測水解活性較不受N-乙醯葡萄 胺醣量的多寡影響，而是與溶解度有關，因為低去乙醯度的幾丁聚醣

其溶解度較低，故限制了酵素的作用速率，產生較高分子量的水解產 物。

粒徑分析的結果如同分子量皆隨水解時間增加，平均粒徑呈現大 幅下降的趨勢，經過水解24小時後粒徑大小排序與分子量的結果相 同，DD92_lys達到微米級約992 nm，由於所有產物皆過0.22 µm的濾 膜，但所測出的粒徑還會超過200 nm，推測幾丁聚醣屬於膠體物質，

經外力強行通過小孔徑孔洞時會使部份大分子的膠體變形得以0.22 µm的膜，通過隨後又恢復成原來的形狀，因此計算平均粒徑時會超 過200 nm。測得的水解產物最小的DD80_cel能達到100-300 nm接近於 奈米的層級，使得幾丁聚糖水解產物可能有不同於未水解之物理特性 及可能延伸的生物特性。

4.1.2. 溶解度測定

幾丁質和幾丁聚醣僅溶於酸性環境下，然而在食品類的產品中，

除了飲料外，易腐敗的產品中仍以中性環境居多，其在中性環境溶解 度不佳的問題，在食品等領域應用上便受到相當大的限制。影響幾丁 聚醣在中性環境下溶解度的主要因子為分子量及去乙醯度，透過酵素 水解不但能降低分子量，依chitosan及lysozyme的水解特性也有提高去 乙醯度的可能性，所製備的小分子量幾丁聚醣不但能提升溶解度，也 能影響其抗菌性

^（ Sekiguchi et al., 1994）

量，在至少不影響抗菌性的前提下來提升溶解度，為此領域的重要議 題。

先前得知幾丁聚醣水解後分子量便立即下降，其結果同樣反應在 溶解度方面，使得溶解度明顯提升，低分子量 (DD80_cel)的溶解度 高於高分子量(圖十一)，其中 cellulase 製備之 LMWC 的溶解度最佳，

甚至能在24 小時後達到 100%。若比較 DD92 與 DD80 的水解產物，

lysozyme 和 chitinase 以 DD80 產生之 LMWC 有較高溶解度；而 cellulase 產物卻與前者相反，其原因可能受基質溶解度高低（DD92

＞DD80）所影響。

4.1.3. 界達電位測定

幾丁聚醣及衍生物溶解在酸性環境下，為一帶陽電荷聚電解質，

此電荷可能會吸附、干擾細菌細胞壁表面所帶的負電荷，以達到抑菌 的效果 (Tsai et al., 1997)。

粒子在溶液中電性彼此相異之離子會於膜面附近極化，形成所謂 的電雙層(electric double layer)。由於介面間真實電位不易求得，習慣 上以界達電位來說明其所帶電荷之多寡 (Hunter, 1981)，因此本研究

分別測量LMWC 與細菌的界達電位，以評估其表面的帶電狀態，進

而探討兩者之間的吸附關係。

由於界達電位會受許多因素而影響，其中包含分子量與粒子型

態，因此可預期LMWC會因為水解時間而有所變化，表一的結果顯 示，六種水解產物的界達電位會隨分子量下降而減少，LMWC_cel更 低到25 - 27 mV，但在與分散體系穩定標誌（附錄）進行比對，指出 分子量8.3 kDa以上的LMWC仍具相當穩定的狀態（60 mV以上）。

若進一步探討分子量與界達電位的關係 (圖十ㄧ)，首先發現電位 隨分子量增加，但達到分子量高峰（LMWC_24 及 LMWC_168）時 電位便開始下降，推測原因可能為，lysozyme 需要辨識(NAG)3-5，導 致LMWC_lys 除了較大外，其攜帶正電的葡萄醣胺官能基減少 (即去 乙醯度較低)，造成電位有下降的現象。

4.2. 水解產物抗菌活性分析

4.2.1. 96 微量孔盤 (微量試驗)

水解產物因不同酵素、水解時間而有所差異，其生物活性亦然，

有關幾丁聚醣及其衍生物的抗菌活性，在過去學者研究及討論指出，

抗菌因子除了受其濃度強弱影響外，還包含菌株種類、去乙醯度、分 子量 (聚合度)及溶解度等，目前普遍接受去乙醯度的增加會提升其抗 菌性，而分子量大小與抗菌性的相關性影響則較沒定論。

本實驗是以常見病原菌 S. aureus 和 E. coli 分別作為革蘭氏陽性與

陰性菌的代表，並與實驗室製備之LMWC 作用，進行抗菌的探討。

由表二結果明顯的發現，高去乙醯度的LMWC_DD92 抗菌效果會大

於低去乙醯度的LMWC_DD80，分子量方面會隨著分子量降低致使 抗菌效果下降，分子量低於6 kDa 則會無法抑制細菌生長。而在 LMWC 的表面電荷方面，也可發現 LMWC 界達電位越強其抗菌效果 會越強。

就菌株而言，E. coli 對 LMWC 的敏感性大於 S. areus，若以菌的 種類區分，則顯示革蘭氏陰性菌對幾丁聚醣的抗性會小於革蘭氏陽性 菌，趨勢與Chen 等（2002）研究相符，推測原因可能與細菌表面的 電荷有關，因此本實驗也測量 S. aureus 和 E. col 表面所帶的電荷。由 結果可以發現陰性菌細胞壁表面帶的負電荷多於陽性菌帶的負電

荷，說明正電荷的LMWC 與負電荷的細菌所發生的電中和作用可導

致細菌死亡。

然而幾丁聚醣水解物對兩株 E. coli 和三株 S. aureusi 皆具有不同 的抗菌活性。E. coli 方面，其抗菌活性 BCRC 10314＞BCRC 10675，

而 S. aureus 為 BCRC 10451＞BCRC 10781＞BCRC 10780，其中甚至 出現大多數水解產物無法抑制BCRC 10780 的情形，因此必須更深入 探討為何同種不同品系的菌株，卻有如此的差異。

對於幾丁聚醣及其水解物對菌株產生不同的抗菌活性，許多學者 曾對其中的抗菌機制做深入的研究，雖然其抗菌機制尚未明確，仍歸 納出幾種可能，其中以電荷的影響較受重視。本研究在比較細菌界達

電位的結果發現，E. coli：BCRC 10314為-13.7 mV、BCRC10675為-7.84 mV；S. aureu：BCRC 1041為-5.99 mV、BCRC 10781為-5.47 mV、

BCRC10780為-4.26 mV（表二），分別就兩種菌株不同品系間作比較，

其負電荷帶的越多，越容易受到對帶正電的LMWC影響，其抗菌效果 也越強。若以全部菌株一起做比較，其趨勢同樣呈現帶負電荷最多的 BCRC 10314 (-13.7 mV)所需的MIC濃度越低；反之帶負電荷最少的 BCRC 10780 (-4.26 mV)是抗性最強的菌株，而本實驗結果與Chung

（2004）等學者所認為負電荷量為抗菌機制的理論是一樣的，而且 LMWC對菌體吸附量（力）和抑制效果成正比。另外，Liu於2004年 的研究中指出，在醋酸鹽下，E. coli 及S. aureus之細胞膜會吸附幾丁 聚醣，進而中和細菌的表面電位（Sashiwa et al., 2002, 2003），使細 胞膜結構改變（Liu et al., 2004），造成細胞膜破裂，最後造成細胞瓦 解、死亡。

此外，探討溶解度與MIC之間的關係發現。幾丁聚醣雖然可透過 酵素水解降低分子量以提高溶解度，然而可能會影響其抗菌性。因此 在製備LMWC同時必須兼顧溶解度及抗菌性等兩個重要因子。綜合表 一與表二結果發現，不同酵素所製備的產物，即使有接近的分子量，

抗菌性卻有所不同，但皆呈現溶解度提升則MIC也隨之提升的情形。

LMWC_cel雖然能提升溶解度達60 - 100%，卻也喪失了部份的抗菌