第二章 材料與方法
第四節 實驗方法
II-4.1 生物資訊學分析
II-4.1.1 基因資料庫
基因序列之比對藉由National Center for Biotechnology Information (NCBI) 網站 上之 Nucleotide Basic Local Alignment Search Tool (BLASTx) 分析比對。
II-4.1.2 序列親緣比對
蛋白質之間之親緣與序列相似比對，為將蛋白質序列上傳至 Center for Integrative Bioinformatics VU 網站，以 PRALINE - Multiple sequence alignment 之公開資源 分析。
II-4.1.3 蛋白質結構分析
蛋白質結構主要以分析軟體 PyMol (maintained and distributed by Schrödinger) 分 析，包含結構胺基酸位置，表面電荷分佈及胺基酸變異策略分析。若已解出結構 之蛋白質，則以其公開之 protein data bank (pdb) 檔案呈現；若無結構之發表，
則以相似之結構分析 (視紫質以 bacteriorhodopsin 為模板) 。對於未知結構的蛋 白質，以 ExPASY Swiss Model 找尋最佳模板，及結構模型的模擬。
II-4.2 DNA 建構及轉形
II-4.2.1 小量核酸萃取
藉由實驗方法 4.2.6 將目標質體遞送至大腸桿菌株 DH5𝛼 中，並將菌液塗布至 具 50 µg/ml ampicillin 之 LB 培養基，隔夜培養於 37℃。將單一菌落接種至約 6 ml 添加 ampicillin 的 LB 培養液中，37℃ 培養 12-16 小時，使其生長至生長 穩定期。其後，使用 High-speed plasmid mini kit 將質體從菌液中抽出： (1) 以 12,000 rpm、 30 秒將菌液收集至菌塊; (2) 依序加入 PDI, II, III 試劑 200, 200, 300 𝜇𝑙，使其溶菌，破菌及沈澱蛋白質 ; (3) 以 15,000 rpm、5 分鐘，將蛋白質 沈澱離心成塊狀 ; (4) 將上清夜 (含質體 DNA) 吸取至核酸親和濾管，並以 12,000 rpm、30 秒將其流過濾膜; (5) 以 Wash buffer 清洗濾膜兩次，方法同(4);
(6) 最後，以 50 𝜇𝑙之 Elution buffer 及 12,000 rpm、2 分鐘將質體析出。
II-4.2.2 聚合酶鏈鎖反應 (PCR)
分成一般PCR 及菌落 PCR。一般 PCR，將目標基因片段放大，並賦予其限制酶 切位於兩端，通常會接續方法 4.2.3 將其純化出來：分別加入 DNA 模板, 順向 引子，反向引子， 2x Mastermix (<1 kbp, 用 Omega® Master Mix taq; >= 1 kbp, 用 2x Pfu PCR Master Mix)，無核酸切酶之水 1, 3, 3, 15, 8 𝜇𝑙，於 PCR 反應管。
菌落 PCR ，目的為初步檢測大腸桿菌轉形株之質體內含之目標基因大小：先於 PCR 反應管中加入順向引子，反向引子，2x PCR Dye Master Mix II，無核酸切酶 之水 1, 1, 7, 5 𝜇𝑙，並以牙籤將單一菌落先接種至新鮮 LB 培養皿後，再於反應 管中攪拌，使其懸浮。
II-4.2.3 DNA 膠體純化
使用 Gel Extraction kit 將 DNA 片段從瓊脂膠體內純化，流程如下： (1) 將具 有核酸片段之膠體切下，並放入微量離心管中; (2) 加入 500 𝜇𝑙 Gel/PCR solution，
並置60℃至膠體溶解; (3) 將混合液吸取至核酸親和濾管，並以 12,000 rpm, 30 秒 離下; (4) 以 600 𝜇𝑙 Wash Buffer 清洗兩次，方法同(3); (5) 以 20 𝜇𝑙 Elution buffer 靜置2 分鐘，離心 2 分鐘析出。
II-4.2.4 限制酶截切
(1) 將以下試劑依序加入 PCR 反應管中: DNA 載體，目標基因片段，10x buffer, 限制酶I, 限制酶 II 2.5, 10, 1.5, 0.5, 0.5 𝜇𝑙。(2) 靜置於 37℃中 2.5 小時。(3) 85℃、10 分鐘，使酵素失去活性。
II-4.2.5 DNA 黏合
(1) 將以下試劑依序加入 PCR 反應管中: 截切過之 DNA 載體及目標基因片段混 合液，10x buffer A, 10x buffer B, T4 ligase 7.5, 1, 1, 0.5 𝜇𝑙。(2) 靜置於 4℃中 12 小時或16℃中 4 小時。
II-4.2.6 大腸桿菌轉形
勝任細胞 (competent cell) 製作。 (1) 從凍菌，於 LB 培養皿中取出單一菌落，
接種至 3 ml LB broth, 37℃ 隔夜培養。(2) 次日，接種 500 𝜇𝑙至 500 ml LB，於 37℃培養至 OD600 = 0.3-0.5。(3) 以離心管收取，並置冰上 10 分鐘。(4) 以 3,500
rpm 離心後去除上清，再以 10 ml TB buffer 回溶後靜置冰上 10 分鐘。(5) 在離 心去除上清夜後，以2 ml TB buffer 回溶。(6) 每 100 𝜇𝑙分裝至微量離心管中，
並置-80℃存放備用。*TB (Transformation buffer): 15% glycerol, 2 mM NaOH, 10 mM MOPS, 85 mM CaCl2, 0.5& D-glucose
大腸桿菌轉形。(1) 將勝任細胞至於冰上 10 分鐘，待其退冰。(2) 將 1 𝜇𝑙質體加 入100 𝜇𝑙勝任細胞中，置冰上 15 分鐘。(3) 於 42℃，90 秒 (Heat shock)。(4) 靜 置冰上1 分鐘。(5) 加入 500 𝜇𝑙 LB，並於 37℃ 振盪培養 30 分鐘。(6) 取 100-150 𝜇𝑙菌液塗布至具篩選標記之培養基。(7) 於 37℃隔夜培養，接續方法 4.2.8。
II-4.2.7 嗜鹽古生菌 H. salinarum 轉形
(1) 將嗜鹽古生菌 H. salinarum 畫線於 Halomedium plate 上 ; (2) 挑取單一菌落，
並接種至 2 ml CM+ medium，於 42˚C, 200 rpm，培養至 O.D.600 = 0.4 – 0.6 ; (3) 放大培養150 µl 菌液至 15 ml CM+ medium，於 42˚C, 200 rpm，培養大約 18 - 24 小時至O.D.600 = 0.4 – 0.5 ; (4) 以 15 ml falcon tube， 750 xg, 15 min，收 2 ml 菌 液 ; (5) 去除上清液後，以 200 µl Spheroplast solution (SPS) 溫和地搖盪懸浮菌 體，並於 2 小時內使用完畢 ; (6) 準備下列材料： a. 加 10 µl 0.5 M EDTA 到 falcon tube 中 b. 10 µl DNA + 20 µl SPS 30 µl c. 120 µl PEG600 + 120 µl SPS
50% PEG600 SPS ; (7) 將 200 µl 懸浮菌液 直接加於 10 µl 0.5 M EDTA 上 ; (8) 馬上接著加入 30 µl DNA，等待 5-10 分鐘 ; (9) 將 240 µl 50% PEG SPS 從管壁 緩慢流下，溫和振盪20-30 週期，等待 30 分鐘，溶液應該要沒有絲狀雜質 ; (10) 準備CM+ sucrose medium (CM+ medium:75% sucrose = 4:1) ; (11) 加入 5 ml CM+
sucrose medium 至管中，以去除 PEG ; (12) 2,000 rpm (750 xg), 15 min ; (13) 去除 上清，再以 5 ml CM+ sucrose medium 懸浮 ; (14) 37˚C, 130 rpm, 24 h，recover 菌 體 ; (15) 將 50 µl 菌液塗布於 SRMEV plate (10 µg/ml MEV) 上，42˚C 培養 ; (16) 24 小時後，再重複步驟 15 (10 天可以知道有或無，15 天可以收穫菌體)。
II-4.2.8 轉形株鑑定
初步挑選3 個單一菌落做菌落 PCR。並挑選出可能含有成功建構之質體的菌體，
做DNA 定序服務 (由基龍米克斯生物科技股份有限公司提供)。最後以西方墨點 法，確認目標蛋白質在轉形株中的表現。
II-4.3 重組蛋白質之表現及純化
II-4.3.1 重組視紫質表現
按方法4.2.6 將建構好之目標載體送入大腸桿菌株 C43 中。取單一菌落接種至 3 ml LB broth (50 𝜇g/ml ampicillin) 中，37℃ 培養 12 小時。再將 2 ml 菌液放大培 養至100 ml (50 倍稀釋)，37℃ 隔夜培養至穩定生長期。於每一大瓶 LB 培養液 (800 ml) 中加入 16 ml 菌液，37℃培養約 1.5-2.0 小時至 OD600 = 0.4-0.6。加入 250 µM IPTG 及 5-10 nM all-trans retinal。37℃ 避光培養誘導 4 小時，進行純 化。
II-4.3.2 重組可溶蛋白質表現
按方法2-6 將建構好之目標載體送入大腸桿菌株 BL21 中。取單一菌落接種至 3 ml LB broth (50 𝜇g/ml ampicillin) 中，於 37℃ 培養 12 小時。再將 2 ml 菌液放大 培養至100 ml (50 倍稀釋)，37℃ 隔夜培養至穩定生長期。於每一大瓶 LB 培養 液 (800 ml) 中加入 16 ml 菌液，於 37℃ 培養約 1.5-2.0 小時至 OD600 = 0.4-0.6，
靜置於 25˚C 半小時。加入 50 µM IPTG 誘導 1 小時。(GST 蛋白質於 37℃ 誘導 2 小時)
II-4.3.3 重組視紫質純化
將菌液以 6,000 rpm, 4˚C 離心 10 min，並用 30 ml 預冷過的 Lysis buffer (4 M NaCl, 50 mM Tris, pH 7.8) 回溶菌塊。以 lysis buffer 將體積補至 40 ml 後，加入 1.43 mM 2-ME 及 100 µM PMSF。設定超音波破菌機 (5 sec pulse, 5 sec rest, 共 5 min; 能量：69 W)，將回溶後的菌液置入燒杯，放於冰上，啟動超音波破菌機。
將破菌後的均質液以 12,000 rpm, 4˚C 離心 10 min; 上清液進行超高速離心 (48,000 rpm, 70 min, 4˚C) 將細胞膜離下。以 2% DDM, lysis buffer 旋轉回溶(4˚C, 20 rpm, 16 h) 超高速離心後的膜塊。再以 18,000 rpm、離心 45 min, 於 4˚C 將未 回溶完全的殘骸去除，將上清液與預先以 20 mM imidazole, lysis buffer 洗過的 Ni-NTA 膠體混合，進行 Resin binding (4˚C, 20 rpm, 6 h)。在重力膠體管柱中，將 混合液中的液體流去 (flow through)。再分別以 20 mM, 50 mM, 250 mM imidazole, lysis buffer 流洗膠體。收集各個流洗液，並將 I250 的流洗液以 30 kD Amicon 濃縮後，透析至下一步試驗所需的溶液環境中。
II-4.3.4 重組可溶蛋白質純化 (Hexa-His-tagged) imidazole, lysis buffer 洗過的 Ni-NTA 膠體混合，進行 Resin binding (4˚C, 20 rpm, 1.5 h)。在重力膠體管柱中，將混合液中的液體流去 (flow through)。再分別以 20 (flow through)。以 6.8 mg/ml glutathione, elution buffer (50 mM Tris, pH 8.0) 回沖 膠體後，進行蛋白質的溶出 (4˚C, 20 rpm, 12 h)。收集流洗液，並以 10 kD Amicon 濃縮後，加入 20 mM DTT 貯存。* GST-CheR 蛋白質必須在 4˚C 下進行純化，
避免大量沈澱生成。
II-4.3.6 H. salinarum 細胞膜之純化
挑出H. salinarum 及轉形株的單一菌落至 20 ml Halomedium，42˚C, 180 rpm, 光 照培養至 stationary phase。再次培養 16 ml 至 800 ml halomedium 中，同條件培 養約4 天，至 OD600 值為 1.0 - 1.4。將菌體以 6,000 rpm, 4˚C, 10 min 收下，並 用 20 ml cold MES buffer (4 M NaCl, 50 mM MES, pH 5.8) 回溶。超音波振盪 (“ON”: 5 sec; “OFF”: 5 sec; total 4 min; energy: 69 W) 將菌體破碎後，以超高速離 心機將細胞膜離下(48,000 rpm, 4˚C, 1 h 10 m)。之後以 2 ml cold MES buffer 再次 將細胞膜回溶 (嗜鹽古生菌細胞膜不需要界面活性劑即可回溶)，4˚C, 12,000 rpm;
多餘殘骸去除。可見光譜的分析，以 MES buffer 稀釋 10 倍測量，光週期的分 析則以4 M NaCl, 50 mM (Tris/MES), pH (8.5/6.2) 稀釋五倍，最後以 pH meter 量 測pH 值。
II-4.4 蛋白質定量及定性
II-4.4.1 蛋白質定量
將蛋白質以12,000 rpm, 4˚C 將將沈澱及雜質離下。再將蛋白質存在的溶液 (Blank) 加 150 µl 在 cuvette 中，以拭鏡紙擦拭其觀測窗。在 Spectrometer U-1900 進 行 ”Baseline” (測量範圍：250 – 750 nm) 校正。將溶液倒出後，以去離子水洗 淨，再將蛋白質溶液150 µl 加入 cuvette 中，進行 ”Measure”。將目標蛋白質序 列，在ExPASy tool: ProtParam 中計算蛋白質的 Extinction coefficient。在按所測 得的280 nm 吸收值，以下列方程式計算蛋白質濃度:
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑡𝑖𝑜𝑛 (𝑚𝑔
* Solution A : commercial acrylamide and bis-acrylamide mixture。Solution B : 1.5 M Tris, TEMED, pH 8.8。Solution C : 0.5 M Tris, TEMED, pH 6.8。
將Bio Rad 垂直電泳鑄膠器架好，玻璃板以 95% 酒精擦拭。將溶液分別配好後，
最後加入 APS 後，馬上將 4.5 ml 的分離膠體混合液注入玻璃板之間，再以 100 µl isopropanol 將膠體壓平。待約 30 min 分離膠體凝結後，以濾紙將 isopropanol 吸出。加入APS 後，將焦集膠體注滿玻璃板間，並放入尺梳。待其凝結後使用，
若不馬上使用，則保存於4˚C, TBE buffer (90 mM Tris, 80 mM Boric acid, 2.5 mM EDTA) 中。
將電泳槽架好，注入足夠的TBE buffer 於陰陽極槽，並將尺梳平行拿出。以微量 吸管P200 清洗樣品槽，並預跑 20-30 min。將蛋白質樣品 1:1 與 2x sample buffer (8% SDS, 15% glycerol, 100 mM Tris, 2 mM EDTA, 160 mM DTT, pH 6.8, 0.2 mg/ml bromophenol blue) 混合。若為可溶蛋白質，則以 95˚C 加熱 10 min; 若為膜蛋白 質，則以55˚C 加熱 30 min (或 42˚C, 1 h)。若為全細胞裂解分析，E. coli 以 95˚C 加熱菌液與 sample buffer 之混合液 10 分鐘; 嗜鹽古生菌則以 120 µl ddH2O 回 溶從 3-5 ml 菌液收集之菌體 (回溶即破菌)，以超音波 microtip 破碎基因體 (“ON”: 1 sec; “OFF”: 1 sec; total 10 sec; energy: 6 W)，，再與 2x sample buffer 混 合後，置於 55˚C, 30 分鐘。將 15 µl 的樣品及 2.5 µl protein marker 依序注入樣品 槽。以 4˚C, 60 V 執行電泳至追蹤染劑通過焦集膠體後，以 4˚C, 150 V (若含有膜 蛋白質樣品，則以100 V 執行) 繼續跑電泳至追蹤染劑跑至膠體底端。完成電泳 後，以 CBR 染劑 (1 g Coomassie brilliant blue R-250 in 250 ml ddH2O, 250 ml methanol, 50 ml acetic acid) 染色膠體 30 min，並以脫色液 (20% Methanol, 10%
Acetic acid) 脫色至蛋白質條帶出現。以玻璃紙將完成染色的膠體封起，並護貝 保存。
II-4.4.3 蛋白質原態電泳
同上表格配製膠體。 Solution B & C without TEMED (配製膠體時再加入 1%
TEMED)。* Running Buffer: 25 mM Tris, 192 mM glycine，2x sample buffer: 62.5 mM Tris, pH 6.8, 25% glycerol, 1% bromophenol blue。電泳及染色步驟同上，惟以 4˚C, 60 V 跑完電泳全程。
II-4.4.4 蛋白質轉印
將轉印 cassette 依序如下組裝：黑夾 海綿 濾紙 膠體 以 methanol 預先活化的PVDF 膜 濾紙 海綿 白夾(y94transfer buffer 中進行，並避 免氣泡產生)。將 cassette 置入電泳槽，並放入降溫冰塊。以 Transfer buffer (25 mM Tris, 192 mM glycine, pH 8.3, 10% methanol) 填滿，並以 400 mA, 1 h 執行轉 印。完成後，將 PVDF 膜取出，進行免疫呈色。
II-4.4.5 免疫呈色
將轉印後的 PVDF 膜取出，浸泡於 Urea-PBST, 1 h 至隔夜。以 TBS buffer 清 洗三次 (清洗步驟皆為 10 分鐘)。以 BSA 及 TBS 配製 Blocking buffer，並進行 blocking 至少至少 1 h。再以 TBS-Tween/Triton 清洗兩次，以 TBS 清洗一次。接 著浸泡於含 1/3000 Penta-His HRP 抗體的 Blocking buffer 搖晃 1 h。再來用 TBS-Tween/Triton 清洗兩次。於避光環境下加入 HRP staining solution 呈色 5 – 10 min，風乾後護貝。
II-4.5 感光蛋白質光學分析
II-4.5.1 吸收光譜測定
同方法4-1.中的 ”Baseline” 及 ”Measure”。
II-4.5.2 視紫質光週期量測
將蛋白質樣品定量至特徵吸收峰 = 0.3 - 0.6，取 150 µl 置入三面透光的石英比色 管中。比色管單一光徑上只有一個開口的那端接受20 U 焦耳強度的 6 ns 雷射脈 衝 (可調整波長，若未特別說明則為 532 nm)。相對的兩個開口分別連接至：白 光監測光源; 單光儀 (選擇偵測波長) 光電倍增管 (放大訊號) 示波器 (擷取訊號)。如此重複數個週期，並以平均模式計算。
II-4.5.3 光驅動離子幫浦活性測定
將誘導表現視紫質的大腸桿菌200 ml，以 3,500 rpm, 15 min, 25˚C 收集。再用 50 ml unbuffered solution (10 mM NaCl, 10 mM MgSO4, 100 µM CaCl2)清洗兩次。再 以25 ml unbuffered solution 懸浮後，保存於黑暗中。使用時，以 unbuffered solution 調整OD600 至大約 2.0，並置於裝有攪拌磁石的玻璃瓶中，置於磁攪拌台上。攪 拌的同時，以pH meter 測量 pH 值，紀錄有照射光源及黑暗的條件下，細胞外環 境的pH 值變化。
II-4.6 嗜鹽古生菌生理分析
II-4.6.1 泳動菌株挑選
將H. marismortui, H. salinarum 及轉形株 HsSRM, HsSRM-HtrM於高鹽培養基劃四區，
將H. marismortui, H. salinarum 及轉形株 HsSRM, HsSRM-HtrM於高鹽培養基劃四區，