第一章 緒論
第三節 古生菌感覺型視紫質
I- 3.5 演化探討
嗜鹽古生菌的視紫質目前並沒有一個完整的演化理論，但從蛋白質序列比對、
點突變及功能特性上，可以找出在演化上可能的相關性 [70]。 HsBR_D85T (D85 為 BR Schiff base 的拮抗離子，對應至 HR 的位置)，具有與 HR 相似的氯離子 幫浦功能 [71, 72]; 然目前仍無法以類似方法，將 HR 轉變為質子幫浦 [73, 74]。SRI 具有與BR 類似的質子幫浦功能，但 SRII 因為缺乏了胞內端的質子受體，質子 僅能在胞外端循環。在 NpSRII 的研究中，有個爭議的問題，在一些研究中顯示，
氯離子會跟 NpSRII 結合，並且會有吸收峰及光週期上的差異 [75]。BR 也可以 利用點突變的方式，將對應至 NpSRII 的 Thr189, Tyr199, Thr204 的胺基酸突變，
成功地利用 BR 變異株傳導光趨性的訊號 [66, 76]。本篇研究的 HmSRM 在蛋白 質序列的比對上 (圖 5a)，相較於 SRI，其相似度與 SRII 較近; SRII 在序列比 對上又與 BR 相似度較高，因此目前認為 SRII 可能是由 BR 演化而來。
第四節 傳導元的結構與特性 kinases, Adenylyl cyclases, Methyl binding proteins, Phosphatases) domain 及 MCP (Methyl-accepting chemotaxis protein) domain。 HtrI 的胞外環 (loop between TM1, 2) 普遍都很短， HtrII 的胞外環通常都長很多; 然而， NpHtrII 及 HmHtrM 的
在先前的研究中，傳導元與 SRs 的專一性由兩個穿膜區域及部分的胞內端 即可決定 [77]。在 HsSRI 的研究上，只需要 HsHtrI 由 N 端算起的 147 個胺基 酸，即可專一性地結合並穩定 HsSRI [58]。有趣的是，當把 NpSRII 接上一個複 合傳導元 (NpHtrII + E. coli Tsr) ，藉由 NpHtrII 的兩個穿膜區域及一個 HAMP domain，該傳導元可以傳遞 NpSRII 感受的藍光訊號，並且藉由大腸桿菌的化學 趨性受體 Tsr 的胞內端，改變化學趨性系統 (chemotaxis signaling pathway) 的活 性 [78]。在 NpSRII 與 HsBR 的結構比較上， SR 胞內端的表面電荷相較於 BR，
帶有許多正電荷，推測與傳導元胞內端負電荷胺基酸的電荷作用有關，因此 BR 無法與傳導元結合 [79]。
光子趨動 SRs 的 F-helix 推出後，造成了傳導元的 TM2 旋轉了 12-30 度
[80]，這個旋轉的動作導致了下游各個元件，包含 TM2、HAMP1、HAMP2、甲基 化區域及尖端，能動性 (dynamic) 的交替轉換。於 NpSRII / HtrII trimer of dimer 的研究中，發現在活化訊息的傳遞狀態下， TM2、HAMP2 及尖端的活動性較 高 [81]。因此，以雙聯體形式結合在尖端的 CheA/CheW 能夠被活化，而進行生 化訊息的傳遞。另外，甲基化區域可逆的甲基化 (methylation) 反應也影響了該 區域的能動性，在 CheR 的幫助下，該區域會被甲基化，並且因為電荷減少的緣 故，彼此靠近造成該區域的能動性下降 [81]。此舉會增加尖端的能動性 (因為能 動性的高低，是各元件間交替起伏的) ，而活化與尖端結合的 CheA kinase ，將 訊息以生化路徑傳遞至鞭毛 (圖 8) [81]。
第五節 嗜鹽古生菌的光趨性
I-5.1 SRs 於嗜鹽古生菌中的分佈
感覺型視紫質顯然並非嗜鹽古生菌必要的蛋白質，並且在不同的嗜鹽古生菌 中，分布的數量也不同 (表 1，圖 6b); 然而，它可以將菌體帶至適合 BRs 作用 並且輻射傷害較少的光照環境。藉由這些具有不同數量 SRs 的嗜鹽古生菌 (包 含了在基因體鑑定上沒有發現視紫質的菌株Hfx)，我們可以更廣泛地去探討，
HmSRM-HtrM 在調控光趨性的機制中，扮演的角色。
I-5.2 嗜鹽古生菌的光趨性
微生物感光的目的，通常為避開有害藍光或找到利用光源的最佳生態地理位 置。對於嗜鹽古生菌來說，生理上，他們必須在面對有害的藍光及利於 BRs 作 用，進而產生ATPs 的黃綠光，之間取得一個平衡。如前所述，目前主要以蛋白 質序列、感受的光源波段及其調控的生理功能，將感覺型視紫質分為三類：SRIs 可以感受橘至紅光波段光源，其M state 傳遞了趨光反應的訊息 [42]。 然而，如 果在 SRI 進入 M state (S373) 時，再給予另一個藍光光子，可以使其進入 M ’ state 則會傳遞避光反應的訊號 [82]。 SRMs 可以感受綠光 (𝜆𝑚𝑎𝑥 = 503 nm) ， 在生理上的泳動分析，推測它的作用是增加趨光反應的效應 (圖 7; unpublished data from Lin Y.C.)。SRIIs 感受藍光光源，並且傳遞避光的訊號 [43]，目前主要的 研究都在於，僅具有 SRII 的嗜鹽古生菌 Natromonas pharaonis 的 NpSRII 上。
目前僅有 Haloarcula 屬被發現，同時擁有這三種 SRs; 而 SRs 在嗜鹽古生菌中 也不是並非每個都是必要的 (表 1)。
先前於感覺型視紫質如何調控光趨性的機制，主要在於 NpSRII 的機制研究。
目前認為 SRI 及 SRII 共用了 Che (chemotaxis) proteins， (細菌調控化學趨性 的two-component system) 調控了嗜鹽古生菌的光趨性。SRs 受光激發後，藉由 推出的 F helix ，使傳導元的 TM2 位移。傳導元的整體結構有如蹺蹺板，有許 多元件間的節點，在活化及非活化的狀態下，各區域會在動態及靜態之間轉換
[81]。以此機制去調節CheA (藉由 CheW 的輔助而結合在傳導元尾端) 的活性，進 而磷酸化CheB 及 CheY 而使其活化， CheB-P 能將傳導元的 MCPs 去甲基化，
CheZ 則負責將 CheY-P 去磷酸化。 CheY-P 能夠調控菌體的鞭毛，使其產生 tumble 的反應而轉向，在整個系統重置後，菌體改為前進模式，最後產生避光的 折返現象 [81]。
圖 7、菌體泳動分析。a Haloarcula marismortui b Halobacterium salinarum，在 不同波長的光源脈衝(0.5 sec) 刺激後，菌體折返的機率 (偏移原路徑 > 90˚)。折 返率越高，代表越高的避光反應。 X 軸為使用光源之波長，單位： nm。
a b
(Lin YC, 2010) (Lin YC, 2010)
I-5.3 SRs 調控光趨性之機制
避光反應 (菌體折返) 的過程牽涉了許多的蛋白質，按順序為：Sensory rhodopsin (SR) 、 Transducer (Htr) 、 CheA/CheW 、 CheR 、 CheB 、 CheY 、 CheZ 及鞭毛。NpSRII/HtrII complex 本身就是一個感受光刺激的 two component system 。 CheR 是 一 個 持 續 活 化 的 酵 素 ， 持 續 地 將 傳 導 元 甲 基 化 ， 維 持 NpSRII/HtrII complex 在高光敏度，也是在一個週期的光刺激後，將感光系統重 置 (reset) 的酵素 [45]。訊息傳導的完整流程如下 ： (1) NpSRII 受藍光激發，
retinal 構型由 all-trans 變為 13-cis，帶動 F(G)-helix 向外推出。 (2) 推出的 F-helix，造成傳導元 TM2 旋轉，改變該區域的能動性。 (3) 藉由交替的能動性改 變，傳導元尖端活化與其結合的 CheA/CheW 雙聯複合體。 (CheA 為 kinase;
CheW 為幫助 CheA 結合在傳導元尖端的蛋白質) (4) 被活化的 CheA，會將 CheB 及 CheY 磷酸化而使其活化。 (5) CheB-P 會將傳導元的甲基化區域去甲 基化，傳導元失去活性 (負回饋抑制) (6) Che-Y 則跑去活化鞭毛，使其產 生 ”tumble” (順時針轉動) 的生理反應，藉此將菌體轉向。 (7) CheZ 會將 CheY-P 去磷酸化，將其重置。 (8) 當整個訊息傳遞完 ”tumble” 的訊息並且重置 後，細胞轉為 ”Run” (逆時針轉動) 的模式，產生了一個折返的生理反應 (圖 8)
[81]。
圖 8、NpSRII 傳遞避光反應的訊息路徑。NpSRII 及 CheA/CheW 都是以雙聯 複合體的形式存在，CheR 是一直具有活性的甲基化酵素，CheR 及 CheY 則是被 CheA kinase 磷酸化後，才活化的去甲基化酵素及鞭毛調控因子。另外，有個未 標示出的 CheZ 酵素，會將磷酸化的 CheY 去磷酸化，以重置訊息的傳遞。
第六節 研究動機及策略
本實驗室的傅煦媛博士於2010 年，發表了一篇關於在 Haloarcula marismortui 這株於死海發現的嗜鹽古生菌中，定義出截至目前為止，具有最多視紫質的古生 菌 [31]。其中，有個視紫質因為藉由胺基酸序列比對，發現既沒有類似光驅動離 子傳輸受體的序列，也沒有能夠與傳導元交互作用的保守胺基酸，因此命名為未 知功能的opsin: xop2 (HmSRM)。於光週期的研究中，發現 SRM 的光週期很慢，
與 SRs 的特性類似。並且在後續的基因體研究中，發現該基因下游有一個 184 個胺基酸的 HAMP domain 蛋白質，是可以與 HmSRM 作用的傳導元 HmHtrM。
因此，目前認為 HmSRM 是一個感覺型視紫質，並且與僅具有兩個穿膜區域及 一個 HAMP domain 的傳導元 HmHtrM 作用。由於這個蛋白質在生物資訊學上 的分析，不同於以往定義出的視紫質 (BR, HR, SRI, SRII)，因此我們對於這個蛋 白質在生理上，是否與先前研究的看法相同，有極大的興趣。
本篇研究著重於 HmSRM 的兩個層面： (1) 生理上，它在趨光反應中產生的效 應 (2) 機制上，HtrM 是否為光趨性調控的重要元件。
本實驗室在先前於SRM 的研究中，發現 H. marismortui 相較於只有 SRI 及 SRII
的H. salinarum，在面對接近綠光波段的光源時，會有一個明顯快速上升的趨光
反應 (圖 7)。並且由於 HtrM 的胞內端缺少許多結構，因此推測 SRM-HtrM 複合 體，可能會與CheR 或 CheB 結合，“間接”地調控光趨性系統的活性。本研究藉 由轉基因菌株 (HsSRM, HsSRM-HtrM) 及重新設計之光趨性分析系統，分析具有不同 數量 SRs 的菌株，觀察 SRM 對於嗜鹽古生菌光趨性的影響。
圖9、實驗流程表。本研究分為四大部分： HmSRM 蛋白質的性質、 HmSRM 在 H. salinarum 轉形株的建立、光趨性研究方法的建立及 H. salinarum 轉形株 之分理分析。
第二章 材料與方法
第一節 生物試劑
II-1.1 菌種
E. coli strain DH5𝛼，用以放大複製及保存質體。
E. coli strain BL21 (DE3)，用以表現重組可溶蛋白質。
E. coli strain C43 (DE3)，基因突變所致細胞膜增生之細胞株。用以表現 重組視紫質(穿膜蛋白質)。由中央研究院 王惠鈞博士實驗室提供。
Haloarcula marismortui ATCC 43049，於 2010 年由本實驗室 傅煦媛博士發表具 有六種視紫質之嗜鹽古生菌。本研究中之感覺型視紫質 HmSRM 及 HmSRM-HtrM 即為其視紫質之一。由國立陽明大學 生物技術研究所 吳韋訥 博士實驗室提供。
Halobacterium salinarum，具有 SRI 及 SRII 兩種感覺型視紫質的嗜鹽古生菌。
Chlamydomonas reinhardtii (137C)，野生株的單細胞綠藻，具有兩根鞭毛及眼點，
調控光趨性反應。由國立臺灣大學 生物科技研究所 陳仁治博士提供。
II-1.2 質體
pET-21b: 用於表達重組蛋白質 (包含 xop2, CheB, CheR)
pET-Duet: 用於建構及表現兩目標重組蛋白質之結合蛋白質。(包含 xop2-xHtrII)；
本研究中使用之基因為將 6His-tag 放在傳導元 xHtrII 兩個穿膜螺旋之間的胞外 環。
pGEX 4T-1: 用於表現 GST 蛋白質，並且建構 GST-CheR 及 GST-CheB 嵌合蛋白
質的載體。
Acrylamide/Bis-acrylamide, v/v = 37.5:1, 40% solution
J. T. Baker
Agar Bioshop
Agarose (Halo-plate) Bioman
酵素名稱 生產廠商
DNA T4 ligase Yeastern Biotech Restriction enzyme Fermentas fast digest 2x PCR Dye Master Mix II (Taq; red) GeneMark
GoTaq® Green Master Mix (2x) Promega 2x Pfu PCR MasterMix (blue) Genomics Penta His HRP Conjugate kit QIAGEN
all-trans retinal SIGMA
Ampicillin Bioman
Beta-mercaptoethanol Bioman Commassie Blue R-250 Biobasic Diaminobenzidine (DAB-HCl) SIGMA DNA ladder 100 bp marker Bioman Gel extraction kit Geneaid HealthView Nucleic Acid Stain Genomics High-speed plasmid mini kit Geneaid Hydrochloric Acid 36.5-38.0 % J. T. Baker 30% Hydrogen peroxide SIGMA
Imidazole Fluka Analytical Isopropyl 𝛽-D-1-thiogalactopyranoside
(IPTG)
Bioman
Luria-Bertani Broth Neogen Magnesium chloride hexahydrate SIGMA
MES hydrate SIGMA
Methanol GENEStar
N-dodecyl-beta-D-maltoside (DDM) Anatrace Ni-NTA resin GE Healthcare Oxido LP0034 peptone Oxoid
Potassium chloride J. T. Baker Prestain protein marker Geneaid Soldium chloride SIGMA
Sodium citrate Fluka Analytical Tetramethylethylenediamine (TEMED) SIGMA
Tris-HCl AMRESCO
Trisodium chloride J. T. Baker
第三節 儀器設備
II-3.1 核酸電泳
迷你水平電泳槽及鑄膠器：霈璟實業 MJ-105 電源供應器：Bio-Rad PowerPac Basic Power Supply
II-3.2 蛋白質電泳及轉印
蛋白質垂直電泳鑄膠器：Bio-Rad
蛋白質垂直電泳槽：Bio-Rad Mini-PROTEAN 3 Elextrophoresis cell 蛋白質轉印槽：Bio-Rad Mini Trans-Blot Cell
電源供應器：Major Science (MP-250V power supply)
II-3.3 離心機
桌上型低速離心機：CUBEE Mini Centrifuge 桌上型離心機：KUBOTA KM-15200
低溫桌上型離心機(置冰箱內)： GyroSpin Mini (10-001-04-0007)
落地式高速離心機：HITACHI CR 21 GII
落地式高速離心機：HITACHI CR 21 GII