第三章 實驗結果
第四節 嗜鹽古生菌之生理探討
III- 4.1 細胞型態
首先，我們需確認外源蛋白質表達，並不會對於 H. salinarum 菌體本身造 成細胞型態及泳動能力上之影響。我們將培養至 stationary phase 的 H. salinarum, HsSRM 及 HsSRM-HtrM 以高鹽培養基稀釋1000 倍，並於 10 x 40 (物鏡 x 目鏡) 及 連接 CCD camera 的顯微鏡下觀察單一細胞型態。(圖 31) 藉由顯微觀察， H.
salinarum 之野生株及轉形株並沒有太多形態上之差異，並且皆具有泳動能力。
圖 31、H. salinarum 野生株及轉形株型態。於 400x 視野下觀察之細胞型態。
III-2.3 生長曲線
初步，我們想得知不同光照環境下，對於嗜鹽古生菌的生長是否有影響。在 不同菌株的生長比較上 (表 4; 圖 32)，因為轉形株的培養基中，具有生長抑制劑 mevinolin， H. salinarum 轉形株普遍的生長速率都較野生株來得慢，其中 Hs
SRM-HtrM 轉形株中，猜測因為表現大量 SRM-HtrM 蛋白質複合體的緣故，生長速率
又比 HsSRM 還慢 (SRM-HtrM 在 H. salinarum 上的表現量比 SRM 高出很多) 。 在 H. salinarum 的結果中，其於橘光的生長速率有明顯提升，並且隨著光源往 短波長移動，其生長速率也隨之減少。然而，當 H. salinarum 表現微量的 SRM 或大量的 SRM-HtrM 後，其在不同光源照射下的生長速率，與波長呈現負相關，
並且相較於黑暗條件，在橘光下的生長速率都略為緩慢。
表4、嗜鹽古生菌於不同光照環境下之世代時間。
Haloarchaea
Illumination Condition
Dark Orange Green Blue
H. marismortui 15.66 15.98 15.44 13.82
H. salinarum 12.76 10.76 11.69 13.42
HsSRM 13.76 13.81 12.71 12.36
HsSRM-htrM 13.30 14.78 13.28 13.31
＊單位： 小時 (hour)
圖 32、嗜鹽古生菌於不同光照下之生長曲線。不同嗜鹽古生菌及轉形株在以 橘、綠及藍光 LED 燈的照射下，所測定之生長曲線。
a b
c d
H. marismortui H. salinarum
Hs SRM Hs SRM-HtrM
III-2.3 光趨性研究
在此小節中，我們想回答以下兩個問題： (1) SRM-HtrM 複合蛋白質所調控 的光趨反應為趨光或避光 (2) 因為其傳導元結構上的構件缺失， HtrM 是否為 其調控光趨性時必要的元件？
首先，在單一菌體的行為分析上，以 3.2.1 小節所述的顯微鏡架設，在高倍 率稀釋的菌液中，觀察單一隻菌體泳動行為差異 (表 5)。單一菌體的行為記錄中，
少數的菌體對光刺激的反應很低，因此主要以會對藍光產生反應的菌體，作為可 信的研究對象。嗜鹽古生菌 (H. salinarum) 在橘光脈衝的照射下，大部分菌體泳 動路徑不受影影響，有些則產生 tumble，有些則會與原路徑偏離小於 90˚ 的角 度 ;在綠光脈衝的刺激下，唯有 HsSRM-HtrM 轉形株會產生 tumble 的反應，此行為 與其野生株 H. salinarum 及 Hs SRM 不同; 而在藍光脈衝的照射下，三種菌體皆 一致性地產生避光的折返現象 (惟如上所述，很小一部的菌體對其沒有反應)。
表 5、單隻嗜鹽古生菌對 RGB 光源刺激之反應。
橘光 (590 nm) 綠光 (530 nm) 藍光 (460 nm)
H. salinarum Run Reverse Reverse
Hs SRM Run Reverse Reverse
Hs SRM-HtrM Run Tumble Reverse
其次，我們欲觀測嗜鹽古生菌面對長期的光源刺激，所產生的群體泳動現象。
第一部分，在顯微鏡的設置下，可以觀測並分析長期照光區域內菌量變化 (圖 33)。
黑暗組的結果，揭示此分析系統可能存在最大到 10% 的計算誤差。接著，在橘 光照射組的結果中，發現野生株及轉型株都具有趨光的效應 ; 在綠光的刺激下，
HsSRM-HtrM 相對於其野生株 H. salinarum 及 HsSRM 轉形株，初步地發現避光反 應有明顯地減少 ; 在藍光的刺激下，三種菌株一致地產生顯著的避光反應，但
HsSRM-HtrM 轉形株的避光反應，仍然有顯著地被抑制。
圖33、嗜鹽古生菌在顯微鏡之光趨性分析。在黑暗、橘光、綠光及藍光四組照光
條件下， H. salinarum 之野生株及兩個轉形株的光區趨性。Ｙ軸為計算照光區 域內外的菌數比值後，再計算照光五分鐘前後，該比值的變化百分比。比值變化 相對黑暗組為正值，視為趨光反應 ; 反之則是為避光反應。數值絕對值越大，則 表示該光趨性反應的程度越高。
以相同的概念移植到 96 孔盤進行類似的分析 (圖 34)。橘光結果中，顯示三
第四章 結論與探討
第一節 微生物之光趨性研究
動物與植物的光趨性研究往往能夠藉由肉眼的觀察與計數而統計，但微生物 的光趨性研究卻與顯微鏡技術的發展有密不可分的關聯。隨著顯微鏡解析度及軟 硬體的發展，我們從觀察微生物巨觀的行為至觀察2D 平面上菌體的泳動，再到 能夠追蹤菌體在三維空間中的運動；配合了電腦的運算，可以統計出單一菌體或 是多隻菌體受光源刺激後的行為改變 [85]。在族群整體的行為上，亦有相關研究 指出本研究中使用的嗜鹽古生菌菌株H. salinarum，在不同光照下的集體趨光性 (菌體聚集) 及避光反應 (菌體驅散) [84]。
在本篇研究中，我們嘗試從單一菌體及微生物族群兩個面向來解釋光趨性的 行為。單一菌體的觀察上，可藉由不同波段的LED 光源脈衝刺激，以顯微鏡觀 察到嗜鹽古生菌的泳動行為、趨光 (tumble) 及避光反應 (reverse; tumble and run) 。在族群整體的光趨行為上，單細胞綠藻的泳動行為，可以在培養皿上被巨 觀地觀察到 (圖 26)。 接著，根據前人研究的例子 [84]，我們將此概念延伸到顯 微鏡及 ELISA Reader 上進行光趨性的定量分析。在分析結果中，初步的確可以 觀察到嗜鹽古生菌的趨光及避光反應，並且量化比較出他們在不同光照條件下，
族群的光趨性行為。若要分析不同的菌體樣品，可以再進行條件上的優化，使光 趨性分析更為精確。
第二節 光趨性在生理上之意義
從部分嗜鹽古生菌中 MRho 的分佈來看 (表 1) ，SRI 的存在 (調控趨光反 應)，皆與 BR 伴生，在 N. pharaonis 的例子中，Np 同時缺乏了 BR 及 SRI ; 而在 H. salinarum 及 H. marismortui 的 SRI 及 SRII 吸收峰中，HsSRI 及 HsSRII 同 時相較於HmSRI 及 HmSRII 紅移了 10 nm 以上 (表 1)。因此，SRI 所調控的趨 光反應，可能是為了使菌體能夠停留在適合BR 運作的光源環境下。嗜鹽古生菌 是個能夠同時代謝有機碳源，及利用 BR 產生的質子梯度製造 ATP 的物種。通 常在比較嚴苛的環境下 (低氧、高光照) ，會活化古生菌調控 BR 表現的啟動子 bop promoter; 促使嗜鹽古生菌去尋求適合 BR 作用的環境，也因此增加了光趨性 活性。
H. marismortui 在 不 同波 長下 的 泳動分 析 結果 中 (圖 7) ， 相較 於 H.
salinarum ，其在大約 540 nm 的光源刺激時，就會產生明顯的趨光現象 (折返率 減少至20%)，而 H. salimarum 則是在約 555 nm 時，折返率才以線性的方式達 到20% ; 有趣的是，這兩株菌在同樣達到 20% 折返率所對應的光源波長，相差 了約15 nm，這個差值剛好也與 HsSRI, HsSRII 及 HmSRI, HmSRII 特徵吸收峰 的差值差不多。另外，在菌體胡蘿蔔系列色素 (carotenoids) 的研究中，尤其是 bacterioruberin 的合成，這些色素能減少嗜鹽古生菌在高光照環境下，菌體 DNA 之損害 [86]。在菌體顏色的觀察中，我們發現在藍光的照射下， H. salinarum 會 產生粉紅色的色素 (附圖 3) ; 然而，H. marismortui 的顏色不管在什麼光照條件 下，都是呈現橘色。這個顏色的差異，也顯示出 H. marismotui 所產生的色素，
之光源波段) ，也對應了 H. marismotui 會停留在比較短波長光源下的現象。
從 MRho 的分佈來看，SRII 所調控的避光反應似乎是普遍存在於嗜鹽古生 菌中 (表 1)，如在 Natromonas pharaonis 中，僅具有 SRII 一個 SR ; 並且，從序 列比對的演化觀點來看，MRho 的演化路徑，有可能是從 BR SRII SRM SRI。因此，對於微生物來說，避免有害的光源，應該是生存上的首要策略。另 外，在本篇研究中，趨光反應的現象往往是在族群密度較高的條件下，最容易被 觀察到。因而能夠推斷，趨光反應是幫助嗜鹽古生菌在營養缺乏的條件下，尋求 能夠利用光能的環境。
第三節 H. salinarum 的 SRM-HtrM 功能獲得型轉殖株
為了解在 H. marismortui 中所發現的新型感覺型視紫質 ： SRM-HtrM 複合 蛋白質，在嗜鹽古生菌光趨性調控中的角色 ; 我們首先將此蛋白質轉殖到，缺 乏此蛋白質的嗜鹽古生菌 (H. salinarum) 系統中。在轉形株確認的結果中，我們 利用菌落 PCR (圖 27) 及西方墨點法 (圖 28) 確認 SRM & SRM-HtrM DNA 的 存在及蛋白質表現。在西方墨點法的結果中，顯示出了傳導元 HtrM 可以幫助穩 定SRM，因此 SRM-HtrM 相較於 SRM，在 H. salinarum 上的表現量明顯高很多，
此結果與先前在 SRs 的研究相符。另外，藉由 SRs 在與傳導元 (transducer) 作 用的條件下，於不同pH 值環境中，會有較穩定的光週期動力學(photocycle kinetic) 的特性，確認 SRM 及 SRM-HtrM 在轉形株中具有光週期活性，同時也顯示 SRM 與 HtrM 的正確交互作用 (圖 30)。同時， 由細胞型態及生長曲線的結果，
可以確認 Hs 野生株及轉形株的生長及泳動能力。
第四節 嗜鹽古生菌的光趨性機制
在先前嗜鹽古生菌的光趨性研究中 (圖 8)，可以得知這個感光的 two-component 系統利用 SR 當作光源的感受器，並利用傳導元將 SR 產生結構改變 帶動的訊號，轉化為化學訊號，藉由化學趨性調控蛋白質組 (chemotaxis proteins) 傳遞訊號至鞭毛。然而，傳導元 HtrM 的結構中，相較於 HtrI 及 HtrII ，缺乏 了與 CheB, CheR 作用的 methyl accepting domain 、與 CheA/CheW dimer 結合 的尖端，以及少了一個 HAMP domain ，使我們對於 SRM-HtrM 所調控的趨光 反應之機制很有興趣。因此假設，SRM-HtrM 的活化態會與 CheR 結合，導致細 胞中 CheR 的量變得很少，間接地減少細胞對於藍光的避光反應 (CheR 能夠維 持 SRII-HtrII 對於藍光的敏感度 [81])。此外，不同於以往在 SR-Htr 複合體上的 觀察， SRM-HtrM 仍舊維持了將質子幫浦至細胞外的能力，此現象在生理上是 否具有意義，目前也不清楚。
本篇研究，將 SRM 及 SRM-HtrM 轉殖到 H. salinarum 中，並利用顯微鏡及 ELISA Reader 的測定，分析野生株及轉形株之間，光趨性行為的差異。實驗結 果初步地指向， SRM-HtrM 在異源表達系統 H. salinarum 中，可以表現並執行 功能，能夠改變菌體對於綠光及藍光的光趨性行為。更深入地分析， HsSRM 轉 形株的光趨性行為，可以在缺乏傳導元 HtrM 的情況下，光趨性行為改變並無法 被完整地執行 (與 H. salinarum 野生株差異不大)。因此，得出以下結論 ： HtrM 對於 SRM-HtrM 在 H. salinarum 中，抑制避光反應的行為，是重要的。
第五章 未來展望
第一節 感覺型視紫質的轉介
由於在嗜鹽古生菌上進行基因編輯的不方便性，我們將 SRM-HtrM 以載體 (pJS005) 的形式放入 H. salinarum 中，並研究其功能。然而，若能將 SRM-HtrM
由於在嗜鹽古生菌上進行基因編輯的不方便性，我們將 SRM-HtrM 以載體 (pJS005) 的形式放入 H. salinarum 中，並研究其功能。然而，若能將 SRM-HtrM