SRM 及 SRM-HtrM 之移植

嗜鹽古生菌 (H. salinarum) 僅具有 SRI 及 SRII 兩種 SR，因此我們將可感受 綠光波段的 SRM 及 SRM-HtrM 移植入其中，使其成為功能獲得型菌株。由於 H. salinarum 的質體基因轉殖方法相對較成熟，加上目前對於嗜鹽古生菌的基因 體編輯的研究較少，並且較難執行，我們以 Polyethylene glycol 添加的方式，將 HmSRM 及 HmSRM-HtrM 複合體之基因放於 bop promoter 後 (vector: pJS005)，

並接上六個His 的標記，轉入嗜鹽古生菌 (H. salinarum) 中。再以嗜鹽古生菌的 生長抑制劑 4 µg/ml mevinolin ，篩選出候選轉形株。此篇章確認 SRM 及 SRM-HtrM 在 H. salinarum 轉形株細胞上的表現及功能。

III-2.1 DNA 之確認

為了確認篩選出來的Hs 轉形株是否帶有送入的 SRM 及 SRM-HtrM 基因，

首先以兩段基因頭尾之引子 (forward and reverse primer) 進行菌落 PCR。結果顯 示，我們所篩選並保存之轉形菌株帶有送入的質體基因 (圖 27)。

III-2.2 蛋白質表現確認

由Anti-His 抗體所做的西方墨點法，確認轉形株表現了 SRM 及 SRM-HtrM 蛋白質(圖 28)。然而， SRM 在 Hs 上的表現量相較於 SRM-HtrM 少很多，猜 測為缺乏 HtrM 的伴護下， SRM 在細胞膜上的穩定性會下降。

圖 27、 H s 轉形株的菌落 培養至stationary phase 後，細胞膜 fraction 的染色結果。由於，訊號的片段過於

III-2.3 SRM 功能性測試

膜蛋白質在界面活性劑 (detergent, e.g. DDM) 及磷脂 (phospholipid) 等不 同環境下，其物理及生物化學特性往往會有一些差異。因此，我們將表現 SRM 及 SRM-HtrM 的 H. salinarum 之細胞膜純化出來，並做紫外光/可見光波譜的分 析 (圖 29)。相較於 H. salinarum 的細胞膜溶液，Hs^SRM及Hs^SRM-HtrM的細胞膜於 大約480 及 500 nm 部分的吸收有相對明顯的上升 (視該吸收峰與~550 nm 的吸 收峰之比值)。並且，在 300-400 nm 的波段，兩者的吸收峰，相較於 H. salinarum_wt，

都有顯著的上升，可能跟SRs 在光照環境下培養，導致的 M-state 累積有關。

圖29、H. salinarum 野生株及轉形株細胞膜的可見光吸收波譜。a 每個樣品的吸 收波譜藉由H. salinarum_wt 750 nm 的吸收值 (視為細胞膜的定量) normalized，

位於550 nm 的波峰，推測為 HsBR 的吸收峰。b 將標準化後的可見光波譜扣除 H. salinarum_wt，可以得到各波段吸收值之消長。

另外， SRM 在有無傳導元結合的條件下，光週期動力學對 pH 值敏感度差 異之現象，同樣可以在 Hs 轉形株的細胞膜上觀測到 (圖 30)。不論在界面活性 劑形成的 bicelle，或者 Hs 的細胞膜上，都可以觀測到 SRM-HtrM 在弱酸及弱 鹼性下，光週期動力學的高穩定度。同時，再次確認 SRM 在 Hs 轉形株中的表 現，並且傳導元 HtrM 與其有作用。

圖30、SRM 及 SRM-HtrM 於不同條件之光週期分析。測量 503 nm 的吸收值在 飛秒雷射 (532 nm; 2 ns pulse) 刺激後的變化，分析 SRM 及 SRM-HtrM 在 Bicelle 環境及H. salinarum 細胞膜上的光週期。 a, b SRM 及 SRM-HtrM 在由界面活 性劑 DDM 所形成的 bicelle 環境中，其光週期動力學在不同 pH 值下之差異。

c, d SRM 及 SRM-HtrM 在 Hs 細胞膜上，其光週期動力學在不同 pH 值下之差 異。