實驗方法

壹 、 藥 物 之 萃 取

將十公斤乾苦蘵植物放於甲醇水浴桶中室溫浸漬三天/一次，將 甲醇萃出液倒出，苦蘵再於甲醇水浴桶中室溫浸漬一次，再將甲醇萃 出液倒出，苦蘵最後再於甲醇水浴桶中 70℃浸漬一次，再將甲醇萃 出液倒出，合併甲醇萃出液於 Eyela rotary vacuum evaporator 於 50℃

進行減壓濃縮，並經冷凍乾燥後，得 950 公克粗抽出物於 -30℃冷凍 備用。

貳 、 冷 凍 細 胞 活 化

冷凍細胞之活化原則為快速解凍，以避免冰晶重新結晶而對細胞 造成傷害，導致細胞之死亡。細胞活化後，約需數日，或繼代一至二 代，其細胞生長或特性表現才會恢復正常﹙例如產生單株抗體或是其 他蛋白質﹚。

步驟：將新鮮培養基置於 37℃水槽中回溫，回溫後噴以 70% 酒 精並擦拭之，移入無菌操作台內。自液氮或乾冰容器中取出冷凍管，

檢查蓋子是否旋緊，由於熱脹冷縮過程，此時蓋子易鬆掉。取出冷凍 管，立即放入 37℃水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在 3 分鐘內全 部融化，以 70% 酒精擦拭保存管外部，移入無菌操作台內。取出解 凍之細胞懸浮液，緩緩加入有培養基之培養容器內 (稀釋比例為 1:10

∼1:15)，混合均勻，放入 CO₂ 培養箱培養。在解凍培養後隔日更換 培養基。

參 、 細 胞 冷 凍 保 存

欲冷凍保存之細胞應在生長良好﹙ log phase﹚且存活率高之狀 態，約為 80％-90％緻密度。注意冷凍保護劑之品質。DMSO 應為試 劑級等級，無菌且無色﹙以 0. 22 micron FGLP Telflon 過濾或是直接 購買無菌產品﹚，以 5~10 ml 小體積分裝，4℃避光保存，勿作多次 解凍。冷凍保存之細胞濃度：5~10 x 10⁶ cells/ml。冷凍保護劑濃度為 10％ DMSO。

步驟：冷凍前一日前更換半量或全量培養基，觀察細胞生長情 形。配製冷凍保存溶液（使用前配製）：將 DMSO 加入新鮮培養基 中，最後濃度為 5％，混合均勻，置於室溫下待用。取少量細胞懸浮 液（約 0. 1 ml）計數細胞濃度及凍前存活率。離心，去除上清液，加 入適量冷凍保存溶液，使細胞濃度為 1-5 x 10⁶ cells/ml，混合均勻，

分裝於已標示完全之冷凍保存管中，1 ml/vial。冷凍保存方法：冷凍 管置於 4℃ 10 分鐘 ? -20℃ 30 分鐘 ? -80℃ 16∼18 小時 （或隔 夜），最後以液氮槽長期儲存。

肆 、 人 類 乳 癌 細 胞 培 養

無菌操作台使用前先讓其抽氣運轉 10 分鐘，再以 70 %酒精擦拭

台面。所有進入無菌操作台的器物均需先噴灑 70 %酒精，有蓋容器 旋開瓶蓋前均需先過火。培養基若使用量小，則盡量置於室溫下回 溫，以避免 pH 值變化。

MDA-MB-231 培養在 10％ FBS-DMEM 培養基中（含 10％ fetal bovine serum、100 units/ml penicillin、100

µ

g/ml streptomycin、2 mM

L-glutamine），置於 37℃、5％CO₂的 T75 方形培養盒於培養箱中培 養。每二天更換 DMEM 培養基，當細胞約長九分滿則進行分盤，首 先將舊培養基吸乾淨，再以 7 ml 1xPBS 緩衝液(pH=7.4)洗清一次，再 加入 trypsin-EDTA 1 ml 約 2 分鐘，再加入 1 ml 10% FBS-DMEM 中 斷 trypsin 作用，以抽吸方式將細胞沖散，再將培養瓶中細胞吸換到 離心試管中再加入 10% FBS-DMEM 達 10 ml，取部分利用血球計數 盤（Hemocytometer）計數細胞數目，其他以 1500 rpm 離心五分鐘，

進行分盤培養。

伍 、 細 胞 數 目 計 數 及 存 活 測 試

首先將舊培養基吸乾淨，再以 7 ml 1xPBS 緩衝液(pH=7.4)洗清一 次，再加入 trypsin-EDTA 1 ml 約 2 分鐘，再加入 1 ml 10%

FBS-DMEM 中斷 trypsin 分離細胞作用，以抽吸方式將細胞沖散，再 將培養瓶中細胞吸換到離心試管中再加入 10% FBS-DMEM 達 10 ml，計算細胞數目是用血球計數盤，血球計數盤一般有二 chambers，

每個 chamber 中細刻 9 個 1 mm²大正方形，其中 4 個角落之正方形再 細刻 16 個小格，深度均為 0. 1 mm。當 chamber 上方蓋上蓋玻片後，

每個大正方形之體積為 1 mm² x 0. 1 mm=1. 0 x10^-4 ml。使用時，計數 每個大正方形內之細胞數目，乘以稀釋倍數，再乘以 10⁴，即為每 ml 中之細胞數目。（如下圖所示）

(細胞計數盤)

存活測試之原理為 dye exclusion，利用染料會滲入死細胞中而呈 色，而活細胞因細胞膜完整，染料無法滲入而不會呈色。一般使用藍 色之 trypan blue 染料。

步驟：取 50

µ

l 細胞懸浮液與 50

µ

l trypan blue ( 0. 4% w/v trypan blue) 等體積混合均勻於 1. 5 ml 小離心管中。取少許混合液﹙約 15

µ

l﹚

自血球計數盤 chamber 上方凹槽加入，蓋上蓋玻片，於 100 倍倒立顯 微鏡下觀察，活細胞不染色，死細胞則為藍色。計數四個大方格之細 胞總數，再除 4，乘以稀釋倍數﹙至少乘以 2，因與 trypan blue 等體 積混合﹚，最後乘以 10⁴，即為每 ml 中細胞懸浮液之細胞數。若細胞

1 2

3

4 5

細胞計數區域 放大簡圖

含細胞密度過高，則算出的數目誤差較大（每一大格過 50 個細胞），

需再加入更多的培養液稀釋。

陸 、 檢 測 苦蘵萃取物對 人 類 乳 癌 細 胞 株 細 胞 增 生 的 影 響 一 、 利 用 流 式 細 胞 儀 計 數 存 活 的 細 胞 數

利用流式細胞儀評估存活細胞數和存活率其原理如下：無論細胞 是進行細胞壞死（Necrosis）或細胞凋亡（Apoptosis）的路徑，只要 細胞死亡，其細胞膜就會失去完整性（membrane integrity）⁶⁶。 Propidium iodine（PI）是一個核酸染劑，進行 PI 染色時，若細胞死 亡，細胞膜破裂，PI 會進入細胞內和核酸結合。若細胞存活，細胞膜 完整，PI 則無法和細胞內的核酸結合。PI 染色完成的細胞經由流式 細胞儀 488 nm 的雷射光激發後，若死亡的細胞會有較高的紅色螢 光，而存活的細胞則有較弱的紅色螢光 ⁶⁷。再用 Cell Quest 軟體分析 細胞增殖率。（如下圖所示）

細胞增殖率以下列公式計算：

Dead cells

Viable Cells

實驗組：乳癌細胞加入待測的苦蘵萃取物

對照組：乳癌細胞加入待測苦蘵萃取物相同體積的溶媒 (DMSO) 於實驗進行的前一天，乳癌細胞需以離心去除上清液後加入新鮮 的培養基，並使細胞密度在 2-4 ×10⁵ cells/ ml。在給予藥物時，首先 利用細胞計數盤，求出其準確的細胞密度，至少二重複，接著加入培 養基把細胞密度稀釋至 5 ×10⁴ cells/ ml。 接著取六個 50 ml 無菌離心 管，每個加入 35 ml 含乳癌細胞的培養基，接著依序加

35 µ

l 的 DMSO 和 150、300、450 及 600

µ

g/ml 素混合均勻。取八個 12 孔洞平盤，兩 個 12 孔洞平盤為一組，總共四組進行不同時間點的實驗。每種濃度 作四重複。每個孔洞加入 2 ml 含乳癌細胞的培養基，其最終濃度為 0、

150、300、450 及 600

µ

g/ml 的苦蘵萃取物，其濃度分配如下：

C 150 300 450 600 C 150 300 450 600 C 150 300 450 600

把種好的乳癌細胞的 12 孔洞平盤，擺進 37℃、5％ CO2的培養 箱（incubator）進行培養，在培養 12、24、48 和 72 小時後各取一組 細胞來檢測細胞生長的情形。

利用流式細胞儀檢測細胞生長情形的方法如下，每個孔洞取 500

µ

l 的培養基，至 5 ml 的流式細胞儀專用管，接著加入 5

µ

l 的 PI Stock Solution（400

µ

g/ml），混合均勻後，即可進行流式細胞儀分析，固

定計數秒數（20 秒）及流速（35

µ

l/min），計數細胞增殖率。

柒、 利用倒立式位像差顯微鏡檢測檢測苦蘵萃取物對人類乳癌癌細 胞 株 細 胞 型 態 的 影 響

給予不同濃度苦蘵萃取物（0-600

µ

g/ml）的乳癌細胞種入 12 孔 洞平盤，擺進 37℃、5％ CO₂的培養箱進行培養，在培養 48 小時後，

於倒立式位像差顯微鏡下照相分析。

捌、 利用流式細胞儀檢測苦蘵萃取物對人類乳癌細胞株細胞週期的 影 響

給予不同濃度苦蘵萃取物（0-600

µ

g/ml）的乳癌細胞種入 12 孔 洞平盤，擺進 37℃、5％ CO₂的培養箱進行培養，在培養 48 小時後，

每個孔洞取 500

µ

l 的培養基，至 5 ml 的流式細胞儀專用管，混合均 勻後，即可進行流式細胞儀分析。給予不同濃度苦蘵萃取物（0-600

µ

g/ml）的乳癌細胞種入 12 孔洞平盤，擺進 37℃、5％ CO₂的培養箱 進行培養，12、24、48 和 72 小時後各取一組細胞來檢測細胞週期改 變的情形。

將不同組別，經 trypsin-EDTA 處理過的細胞懸浮液分別移到 15 ml 離心管中離心 (1500 rpm、5 分鐘)。倒掉上清液，再將細胞完全打 散後加入 2 ml/wells 的 PBS 緩衝液離心 (1500 rpm、5 分鐘)。倒掉上 清液，將細胞完全打散後，以 4℃冰的 70%酒精進行細胞固定步驟

(以”SHAKE 3”速度震盪，一滴一滴緩慢將酒精滴入)，隨後將細胞固 定步驟完成的樣品置於-20℃冰箱隔夜存放。隔天，將樣品從冰箱取 出後離心 (1500 rpm、5 分鐘) 以去除酒精，之後將細胞完全打散。

加入 2 ml 的 PBS 緩衝液清洗 1 次後將細胞完全打散。最後在每個試 管中加入 500

µ

l 的 PI stain 染劑 (其量可視細胞數目增減)，避光反應 30 分鐘。在檢查 FACS 專用管是否破損後，於管子外標上樣品編號 備用。以 1 ml pipette 在 15 ml 離心管中抽吸次後，將細胞移到 FACS 專用管後避光置於冰上。最後以流式細胞儀 (Flow cytometry; FACS) 進行樣品分析，一秒細胞數不超過 300 顆細胞，每個數據收集 12000 顆細胞，數據以 Modfit LT^軟體進行處理分析⁽⁹²⁾。

1X Phosphate buffer saline (PBS) ： ( pH=7. 4)

組 成 重 量 (g)

NaCl 8. 0

KCl 0. 2

Na₂HPO₄ 1. 44

KH₂PO₄ 0. 24

加 DDW 到總體積 1000 ml

PI stain 染劑配製： (4℃保存)

組 成 最終濃度 初濃度 體積 (ml)

Propidium iodide (PI) 0. 4 mg/dl 2 mg/dl 5

Triton 1 % 5 % 5

RNase A 0. 1 mg/ml 2 mg/ml 1. 25

1X PBS - - 13. 75

總體積 25 ml

*RNase A 配好後需以 70℃加熱 20 分鐘處理後分裝。

玖、 檢測苦蘵萃取物對人類乳癌細胞株細胞內與細胞週期相關蛋白 質 的 影 響

一 、 西 方 墨 點 法 (Western Blotting) (一 )、 細 胞 蛋 白 質 抽 取

給予不同濃度苦蘵萃取物的乳癌細胞種入 10 cm 細胞培養盤，擺 進 37℃、5％ CO₂的培養箱進行培養，於不同時間從培養箱中取出 後，將將不同組別，經 trypsin-EDTA 處理過的細胞懸浮液分別移到 15 ml 離心管中離心 (1500 rpm、5 分鐘)。倒掉上清液，再將細胞完 全打散後加入 2 ml/wells 的 PBS 緩衝液離心 (1500 rpm、5 分鐘)。倒 掉上清液，將細胞完全打散後，加入 200

µ

l 的 Lysis buffer。劇烈震 盪後置於冰上 30 分鐘處理樣品，再經離心 (4℃、10,000 rpm、10 分 鐘) 取出上清液即含細胞蛋白質。

(二 )、 蛋 白 質 定 量

蛋白質標準品檢量線製作：以胎牛血清白蛋白 (Bovine serum albumin; BSA) 為蛋白質標準品，依下面表格製作蛋白質標準品樣品：

濃度 (ug/ml).

組 成

0 5 10 15 20 25

0. 1 mg/ml BSA (

µ

l) 0 50 100 150 200 250 DDW (µl) 800 750 700 650 600 550 Bradford 染劑 200

µ

l

總體積 1000

µl

將配製好的蛋白質標準品樣品以每個樣品放在 3 個 wells 的方式 依序放入 96 孔細胞培養盤中，利用酵素免疫分析儀 (ELISA reader) 在 590 nm 測定各蛋白質標準品吸光值之平均值。以蛋白質標準品吸 光值與濃度畫出標準品檢量線，並求出趨勢線方程式及 R²值。(R²值 必須有

≥

0. 99 以上的準確度，否則需重新製作檢量線)

(三 )、 樣 品 蛋 白 質 定 量 ：

取 10

µ

l 的蛋白質樣品與 790

µ

l 的二次水混合，再加入 200

µ

l 的 Bradford 染劑，混勻 5 分鐘後以每個樣品放在 3 個 wells 的方式依

取 10

µ

l 的蛋白質樣品與 790

µ

l 的二次水混合，再加入 200

µ

l 的 Bradford 染劑，混勻 5 分鐘後以每個樣品放在 3 個 wells 的方式依

在文檔中 苦蘵引起人類乳癌細胞G2/M期停滯和細胞凋亡; Physalis angulat induces G2/M phase arrest and apoptosis in human breast cancer cells (頁 52-73)