細胞增殖與調控

第二節 細胞增殖與調控

人體各種細胞皆由幹細胞 (stem cell) 分化到完整的真核細 胞，這些真核細胞 (eukaryotic cell) 不是處於有絲分裂就是停止在休 眠狀態。當細胞接受了生長因子的刺激後，便會推動整個細胞週期的 進行。

壹 、 細 胞 週 期 (Cell Cycle)

在正常細胞的生長過程中，DNA 的套數會由 2N 變為 4N，然 後細胞由一分為二。在這整個過程中，大致可區分為四個時期，分別 為：G0/G1 期 (Gap 1 phase)、S 期 (DNA synthesis phase)、G2 期 (Gap 2 phase)、M 期 (Mitotic phase) 等，細胞經由 G0/G1 時期進入 S 期，然後開始進行 DNA 的複製，接著進入 G2 時期，最後進入可 使細胞分裂成子細胞 (daughter cell) 的 M 時期，才算是結束一整個 細胞週期的進行 ⁽¹⁶⁾。大致而言，我們可將複雜的細胞增殖現象分為 Inter phase (G0, G1, S phase, G2) 及 M phase⁽¹⁷⁾。這個過程稱為細胞週 期。

Gap 0 (G0) ：細胞處於休眠期，可能為暫時性或永久性的停止

生長，若細胞以發展到最後階段便不再生長。（如神經細胞；neuron）

當細胞處在屬於停滯期的 G0 期時，細胞內包括 mRNA 的生成，蛋 白質的製造等，都會減到最小的產量。

Gap 1 (G1) ：當細胞接受了生長因子的刺激後，便會推動整個 細胞週期的進行 ⁽¹⁸⁾。此期之細胞開始生長，細胞大小增加，同時產 生 RNA 及合成蛋白質，目的是為 DNA 複製做好準備。

Synthesis (S) phase：為了使分裂後的二個子細胞相似，必須複 製使含量增加一倍。

Gap 2 (G2) ：DNA 複製到有絲分裂的期間，細胞會持續生長並 產生新的蛋白質。

Mitosis (M) phase：這個階段的細胞停止生長及蛋白質合成，所 有細胞的能量集中在複雜而有規律性的細胞分裂以期得到兩個相似 之子細胞。

而其中G1及G2期各含有檢查點 (check point)，以每次進入S期或 M期檢查是否一切準備就緒，才可以接著進行DNA的合成或是細胞分 裂作用。在文獻中指出，當 DNA受損時，週期便無法通過檢查哨而停 下 (Cell cycle arrest)，此時細胞內會進行DNA的修復，一旦修補完成 時才進入下一期，若是發現有無法彌補的錯誤時，細胞則選擇走向凋 亡 (apoptosis)，以避免錯誤遺傳至下一代⁽¹⁹⁾。

貳 、 影 響 細 胞 週 期 之 蛋 白 和 激 ?

在真核細胞中，為了維持整個細胞週期的正常運轉，細胞內會利 用許多不同的蛋白，形成許多不同的複合體，來掌控細胞週期的正常 運行。細胞週期的進行可被許多的蛋白激? 複合體 (Protein kinase complex) 所調控，而這類的蛋白複合體是由細胞週期素 (Cyclin) 和 細胞週期激? (Cyclin- dependent kinase, CDK) 所組成；當二者結合 在一起時，會在特殊位置產生磷酸化，藉由連續的訊息，經過活化，

與隨後一系列特殊的Cyclin-CDK (Cyclin-CDK complex) 的活化與否 來調控細胞週期進行，讓細胞增生，然後達到活化的目的⁽²⁰⁾。對於多 樣的抑制增生 (antiproliferative) 訊號，包含有DNA損傷 (DNA damage)、分化 (differentiation)、接觸性抑制 (contact inhibition)、和 衰老 (senescence) 也會促使CDK的抑制者來負向調控細胞週期的進 行⁽²¹⁾。CDK在細胞週期的進行中，會常態性的表現，而Cyclin則會受 到Cyclin gene 的活化，或是Ubiquitin 的水解作用所調控 ⁽²²⁾。

Cyclin-CDK複合物的活化是經由多層次的調控，包含：

(1) Cyclin 蛋白的表現 (induction) 並與 CDK 結合⁽²³⁾ (2) CDK 被 CAK (Cyclin-activation kinase) 磷酸化⁽²⁴⁾

(3) 合成可抑制 CDK 的蛋白 (CDK-inhibitory proteins) 的調控⁽²⁵⁾。 一 、 Cyclins 週 期 蛋 白 家 族

Cyclins 家族，主要在細胞週其中被合成。目前已知至少有 8 種 Cyclins 的存在，分別為 A、B_1,2,3、C、D_1,2,3、E、F、G 及 H，他們在 N-端與 CDKs 鍵結的地方都具有約 150 個胺基酸的相同區域，稱之為 cyclin-box ⁽²⁶⁾。Cyclins C、D 以及 E，主要存在於 G1 時期，並在 G1-S 的過渡期間被分解⁽²⁷⁾。而 Cyclins A 與 B 被稱為 mitotic cyclins，穩定 的存在於 interphase，但在 mitosis 時會迅速分解⁽²⁸⁾。而 Cyclin H 則 會和 CDK 7 形成一具有? 活性的複合物，進而活化cdc 2 (CDK1) 及 CDK2 ⁽²⁹⁾。

(一 ) Cyclin A；Cyclin A在細胞週期的G²/S 期出現⁽³⁰⁾。它目前較為 了解的功能，是促進DNA 複製或中心體複製 ⁽³¹⁾，所以它與cyclin B 一起被稱為mitotic cyclin。然而現今對cyclin A 的研究仍稍嫌不 足，所以在功能方面，仍需更多研究加以闡述。

(二 ) Cyclin B 細胞週期進行至G²/M，B 型態的cyclin 會作用在此 間期，它與cdc2 複合成maturation-promoting factor (MPF)，啟始了 染色體凝集、核膜破裂與紡垂絲形成的機制，進而引導染色體在子 細胞作均等的分裂。

(三 ) Cyclin D 分為D1、D2 及D3 三種基因序列相似的蛋白，他們 經由生長因子 (mitogen) 的作用，在短時間內濃度突然增高，進行 細胞週期的啟動。所以有研究指出，他們是細胞內與細胞外生長環

境溝通的橋樑 ⁽³²⁾。一般而言，cyclin D1 是促使細胞由G⁰ 期進入 G¹期的因子 ⁽³³⁾，D2 與D3 則具有組織專一性 (tissue specificity)，

較常在T 細胞型態的白血球出現，其他組織例如乳癌組織則較少或 沒有表現 ⁽³⁴⁾。他們分別會與cdk4 或cdk6 形成複合物，促進細胞 經由G⁰ 期進入G¹ 期，進行細胞生長。

(四 ) Cyclin E 則與cdk2 作用，會磷酸化RB1 蛋白，促使E2F 蛋白 釋放，執行由G¹ 期轉入S 期作DNA 複製的功能 ⁽³⁵⁾。cyclin E 會 因本身調節機制或經由E2F、TGF-ß 的誘導而在G¹/S 增高濃度

(36)，之後作用在細胞週期其他基因上，以促使細胞週期持續進行

(37)，現有研究發現，cyclin E 也作用於中心體的複製功能 ⁽³⁸⁾。 二 、 Cyclin-dependent kinases (CDKs) 週 期 蛋 白 依 賴 激 ? 家 族

Cyclin-dependent kinases (CDKs) 是一群蛋白激? 家族，會和特 殊的 Cyclin 結合而活化。目前已知共有 7 種 CDKs 被發現，分別是 cdc 2 (CDK1)、CDK2、3、4、5、6、7。細胞在 G0/G1 時期，CDK4、

5 及 6 會和 Cyclin D 家族結合；而 CDK2 也會與 Cyclin D 家族結合，

但主要還是在 G1 及 G1-S 過渡期與 Cyclin A 及 E 結合。如上述所提 及，CDK7 會與 Cyclin H 結合，並磷酸化 cdc2、CDK2 或 RNA polymerase ? 的 C 端次單元體^(39-40)。cdc2 主要存在 S、G2 以及 M 時 期，並與 Cyclin A 及 B 結合⁽⁴¹⁾。

三、Cyclin-dependent kinase inhibitors

(CDKI)

Cyclin-dependent kinases (CDKs) 是一群蛋白激? 家族細胞週期 中，除了上述 Cyclin 與 Cyclin-dependent kinases 的正向調控因子外，

另有一家族擔任著負向調控的角色，稱之為 Cyclin-dependent kinases inhibitors (CDKI) ⁽⁴²⁾。根據目前研究得知，CDKIs 分為兩類，它們 各有不同功能。

第一類為 Kip/Cip family，包含三種分子結構相似的蛋白，了 p21 (CIP1/WAF1/SDI1)

，p27 ^(KIP1) 以及 p57 ^(KIP2)。KIP/CIP 家族所影響的層 級較 INK4 家族為廣，其所調控的蛋白包括 Cyclin E/CDK2，Cyclin D/cdc2，Cyclin D/ CDK6，Cyclin A/CDK2 及 Cyclin B/cdc2 等^(43-44)， 作用可抑制大部份 cyclin-cdk 的複合物，阻斷這些複合物去磷酸化

期以修復受損傷的基因組 ⁽⁴⁶⁾。p27^(KIP1) 基因會因細胞生長接觸而 誘導，停止細胞週期，間接抑制細胞再持續生長 ⁽⁴⁷⁾。

四 、 細 胞 週 期 檢 查 點 (Cell cycle check points)

當細胞遭受到一些外在壓力時，會活化某些機制來抑制細胞週期 的進行，以便於細胞進行修補的工作，這些機制稱為細胞週期關卡 (Cell cycle checkpoints) ⁽⁴⁸⁾，當細胞無法進行適當的修補時，便會走向 凋亡之路徑。在整個細胞週期中存在著三個重要的Checkpoints，分別 為G1-S Checkpoint、G2 Checkpoint 和Mitotic spindle checkpoint，分 述如下：

(一 )、 G1-S Checkpoint

這一個時期的停滯，主要由CDK inhibitors (CDKIs) 來負責，

CDKIs 主要的功能在於抑制G1 時期的Cyclin-CDK 活性，來達到週 期停滯的目的。目前知道CDKI 可分為兩個族群：INK4 inhibitors 和 Cip/Kip inhibitors ⁽²⁰⁾。INK4 家族，如：p16INK4A、p15INK4B，會 特異性的抑制CDK4、CDK6 的活化，來引發不經由p53 路徑的G1 時期停滯。Cip/Kip 家族，如：p21^Waf1/Cip1、p27^Kip1，對於所有細胞週 期的CDK 都有抑制性，會受到p53 腫瘤抑制蛋白 (tumor suppressor protein) 的調控⁽²⁰⁾。而不管是INK4 家族或是Cip/Kip 家族，最後都 是經由抑制CDK 對Rb 的磷酸化，來造成G1時期的停滯 ⁽⁴⁹⁾。

(二 )、 G2 Checkpoint

DNA 受到傷害時，細胞內會啟動ATM (ataxia telangiectasia mutated) /ATR (ATM and Rad3-related) 路徑，來造成G2 時期的停滯

(50)。ATM/ATR 分別會使Chk2 (checkpoint kinase 2) /Chk1 (checkpoint kinase 1) 磷酸化轉為活化態；而活化態的Chk2/Chk1，則會磷酸化 CDC25C 上的14-3-3 結合位：serine 216 ⁽⁵¹⁾。當CDC25C上14-3-3 結 合位被磷酸化時，便會吸引14-3-3 與CDC25C 結合，而使CDC25C 滯 留在細胞質中，然後CDC2 的活化被抑制，造成G2 時期的停滯。另 外，ATM/ATR 也會造成p53 路徑的活化：p53 會造成14-3-3s 和p21 的表現量上升，14-3-3 會使CDC2 停留在細胞質中，而使G2 時期的

進行中斷 ⁽⁵²⁾；而p21 則是藉由抑制Cyclin B/CDC2 複合體的活性來

阻止G2 時期運行。另有文獻指出，p21 也會阻斷CDC25C 與PCNA (proliferating cell nuclear antigen) 之間的交互作用，來達到造成G2 時 期停滯的目的 ⁽⁵³⁾。

(三 )、 Mitotic spindle checkpoint

這個關卡主要是在掌控微小管在分裂時期的動作。當染色體以錯 誤的方式排列在赤道板上，此時微小管的動作會中斷，無法與染色體 上的動粒 (kinetochore) 結合，這個機制便會啟動，使細胞分裂中斷。

這個關卡的作用蛋白包含了：BUB1、BUB3、BUBR1 和MAD2，其

中BUBR1 和MAD2 會直接與APC 結合，並抑制APC 的作用，使得 細胞無法進入anaphase；而BUB1 和BUB3 則是在微小管動作中斷 後，造成分裂期停滯 (mitotic arrest) 的主因 ⁽⁵⁴⁾。

五 、 細 胞 週 期 與 各 週 期 蛋 白 和 激 ? 之 間 的 關 連 性

在G1時期主要由Cyclin D-CDK4、Cyclin D-CDK6、Cyclin E-CDK2、Cyclin A-CDK2 這幾個複合體所調控。在G1 時期初期，

Cyclin D-CDK4 、Cyclin D-CDK6 這兩個複合體會先對Rb (retino- blastoma protein) 蛋白產生部份的磷酸化，然後使得Cyclin E-CDK2 被製造出來，進而使Rb 產生完全的磷酸化。此時，被未磷酸化態Rb 所抓住的轉錄因子E2F 便會完全釋放出來，啟始DNA 開始製造出進 入S 時期所需的蛋白 ⁽⁴⁹⁾。

而在G2/M 時期，則是由Cyclin B-CDC2 (CDK1) 來調控。CDC2 與Cyclin B 結合後，形成一稱為M-phase promoting factor (MPF) 的複 合體，受到CAK (CDK-activating kinase) 在Thr-161 的位置磷酸化 後，會形成有活性的複合體 ⁽⁵⁵⁾，此時Wee-1 和Myt-1這兩個激? 會 在CDC2 的Thr-14 和Tyr-15 的抑制位置上，產生磷酸化使其失去活 性。

沒有活性的Cyclin B-CDC2 複合體會在G2 時期開始累積，在將 進入M 時期時，去磷酸? CDC25C 會將CDC2 上，抑制位的磷酸化

去除，使其轉為活化態，此時Cyclin B/CDC2 複合體會將一些相關蛋 白磷酸化，如Lamin 的磷酸化造成核膜崩解、Histone H1 的磷酸化 造成DNA 結構鬆開、Kinesin 的磷酸化造成微小管運動等，而使細 胞開始進入M時期 ⁽⁵⁶⁾。

當細胞在M 時期末期時，Cyclin B 會被anaphase-promoting complex (APC) 所引發的蛋白水解作用所水解，同時CDC2 也轉為不 活化的形態，此時細胞便離開M 時期 ⁽²²⁾。

另外RB1 蛋白則是整個細胞週期的主宰，它控制細胞分裂與分 化 ⁽⁵⁷⁾。當細胞處在細胞週期G0/G1、不生長的細胞或分化完成的細 胞，RB1 蛋白是呈現無功能狀態。RB1 未被磷酸化前，細胞轉錄因 子E2F 蛋白會與RB1 結合在一起，經由cyclin- cdk 作用，RB1 才會 被磷酸化 (phosphorylation)，被磷酸化的RB1 蛋白會釋放細胞轉錄因 子E2F，作用在其他基因的轉錄，進行細胞生長。研究顯示RB1 基因 也對細胞週期進行抑制作用，限制DNA 在S 期的複製作用，進一步 抑制細胞生長。近來亦有研究指出，RB1 蛋白對染色體分離 (chromo- some segregation) 和chromatin ⁽⁵⁸⁾ remodeling 佔有重要的角色，所以 RB1 維持基因體穩定扮演很重要的角色，藉由 hsHec1p，Rb1 蛋白 維持染色體分離的完整性，因此RB1蛋白功能若受抑制，則可能引起 G1/S 或G2/M 機制異常 ⁽⁵⁹⁾。