第四章 結果
第三節、 苦蘵萃取物及抽取出對人類 MDA-MB 231 乳癌細胞株細
MDA-MB 231 乳癌細胞株 3x105/well，種入 12 孔洞平盤，於 37
℃、 5％ CO2 的培養箱，經同步化孵育培養後 ，給予不同濃度
（0-600
µ
g/ml）苦蘵萃取物，經 12 小時分別取出細胞來檢測細胞 週期改變的情形。苦蘵萃取物於 150µ
g/ml 時就發生 G2/M phase arrest 及 S phase arrest；於 300µ
g/ml 時明顯發生 G2/M phase arrest，其比例增加為三倍(45%)之多，隨著濃度增加而越明顯。隨著時間 增加，G2/M phase arrest 有稍微的下降(圖八)。經統計後發現於 300
µ
g/ml 時明顯減低 G0/G1 phase，隨著濃度增加而減低越明顯，但對 G2/M phase 明顯增加，隨著濃度增加而越明顯(圖九)。所以可 確定苦蘵萃取物對 MDA-MB 231 乳癌細胞株抑制作用為產生 G2/M phase arrest，使細胞週期停滯。
經 24 小時分別取出細胞來檢測細胞週期改變的情形。苦蘵萃取物 於 150
µ
g/ml 時就發生 S phase 減低；於 300µ
g/ml 時明顯發生 G2/M phase 比例增加為 41%，隨著濃度增加而越明顯 (圖十)。經統計後發 現於 300µ
g/ml 時明顯減低 G0/G1 phase，隨著濃度增加而減低越明 顯，但對 G2/M phase 明顯增加，隨著濃度增加而越明顯(圖十一)。進一步發現 48 及 72 小時培養後，苦蘵萃取物於 150
µ
g/ml 時對MDA-MB231 乳癌細胞株就發生 S phase 減低；於 300
µ
g/ml 時明顯 發生 G2/M phase 比例增加，隨著濃度增加而越明顯 (圖十二、圖十 四)。經統計後發現於 300µ
g/ml 時明顯減低 G0/G1 phase，隨著濃度 增加而減低越明顯，但對 G2/M phase 明顯增加，隨著濃度增加而越 明顯 (圖十三、圖十五)。經進一步實驗發現，給予苦蘵萃取物 Ethyl Acetate 層不同濃度
（0-450
µ
g/ml）對於 MDA-MB 231 乳癌細胞株，經 24 小時取出檢測 細胞週期的改變，發現在 300µ
g/ml 時開始產生細胞凋亡約 20%，450
µ
g/ml 時達到 40% (圖十六)。綜合以上結果可確定苦蘵萃取物對 MDA-MB 231 乳癌細胞株抑 制作用為產生 G2/M phase arrest，使細胞週期停滯及產生細胞凋亡。
12h cell cycle
圖 八 .MDA-MB 231 乳癌細胞株經不同濃度之苦蘵萃取物處理 12 小 時，經酒精固定細胞，再以 PI stain solution 將細胞 DNA 染色，以流 式細胞儀評估 MDA-MB 231 乳癌細胞株週期的改變。
圖九.MDA-MB 231 乳癌細胞株週期的統計圖。MDA-MB 231 乳癌細 胞株經不同濃度之苦蘵萃取物處理 12 小時，隨著濃度增加，於 300
µ
g/ml 時 發 生 G2/M phase arrest。 數 據 結 果 以 平 均 值 ± 標 準 差 (mean±SD) 表示，n=8。P.A ( µ g/ml)
0 100 200 300 400 500 600 700
Percentage
0 10 20 30 40 50 60 70 80
G0/G1 G2/M S
12 h
24h cell cycle
圖 十 .MDA-MB 231 乳癌細胞株經不同濃度之苦蘵萃取物處理 24 小 時，經酒精固定細胞，再以 PI stain solution 將細胞 DNA 染色，以流 式細胞儀評估 MDA-MB 231 乳癌細胞株週期的改變。
圖十一.MDA-MB 231 乳癌細胞株週期的統計圖。MDA-MB 231 乳癌 細胞株經不同濃度之苦蘵萃取物處理 24 小時，隨著濃度增加，於 300
µ
g/ml 時 發 生 G2/M phase arrest。 數 據 結 果 以 平 均 值 ± 標 準 差 (mean±SD) 表示，n=8。P.A ( µ g/ml)
0 100 200 300 400 500 600 700
Percentage
0 10 20 30 40 50 60 70 80
G0/G1 G2/M S
24 h
48h cell cycle
圖 十 二 .MDA-MB 231 乳癌細胞株經不同濃度之苦蘵萃取物處理 48 小時，經酒精固定細胞，再以 PI stain solution 將細胞 DNA 染色，以 流式細胞儀評估 MDA-MB 231 乳癌細胞株週期的改變。
圖十三.MDA-MB 231 乳癌細胞株週期的統計圖。MDA-MB 231 乳癌 細胞株經不同濃度之苦蘵萃取物處理 48 小時，隨著濃度增加，於 300
µ
g/ml 時 發 生 G2/M phase arrest 。 數 據 結 果 以 平 均 值 ± 標 準 差 (mean±SD) 表示，n=8。P.A ( µ g/ml)
0 100 200 300 400 500 600 700
Percentage
0 10 20 30 40 50 60 70
G0/G1 G2/M S
48 h
72h cell cycle
圖 十 四 .MDA-MB 231 乳癌細胞株經不同濃度之苦蘵萃取物處理 72 小時，經酒精固定細胞，再以 PI stain solution 將細胞 DNA 染色，以 流式細胞儀評估 MDA-MB 231 乳癌細胞株週期的改變。
圖十五.MDA-MB 231 乳癌細胞株週期的統計圖。MDA-MB 231 乳癌 細胞株經不同濃度之苦蘵萃取物處理 72 小時，隨著濃度增加，於 300
µ
g/ml 時 發 生 G2/M phase arrest 。 數 據 結 果 以 平 均 值 ± 標 準 差 (mean±SD) 表示，n=8。P.A ( µ g/ml)
0 100 200 300 400 500 600 700
Percentage
0 10 20 30 40 50 60 70 80
G0/G1 G2/M S
72 h
Ethyl Acetate 24h cell cycle
圖 十 六 .MDA-MB 231 乳癌細胞株經不同濃度之苦蘵萃取物 Ethyl Acetate 層處理 72 小時，經酒精固定細胞，再以 PI stain solution 將細 胞 DNA 染色，以流式細胞儀評估 MDA-MB 231 乳癌細胞株週期的改 變。
第四節、苦蘵萃取物對乳癌細胞株之細胞週期相關蛋白質的影響 以流式細胞儀發現苦蘵萃取物對 MDA-MB 231 乳癌細胞株抑制 作用為產生 G2/M phase arrest，使細胞週期停滯及產生細胞凋亡。給 予不同濃度苦蘵萃取物的 MDA-MB 231 乳癌細胞株，於 10 cm 細胞 培養盤，擺進 37℃、5％ CO2的培養箱進行培養，於 24 小時培養後，
再加入 trypsin-EDTA 1 ml 約 2 分鐘，再加入 1 ml 10% FBS-DMEM 中斷 trypsin 作用，以抽吸方式將細胞沖散，再將培養瓶中細胞吸換 到離心試管中，再離心 (1500 rpm、5 分鐘)。倒掉上清液，再將細胞 完全打散後加入 2 ml/wells 的 PBS 緩衝液離心 (1500 rpm、5 分鐘)。
倒掉上清液，將細胞完全打散後，加入 200
µ
l 的 Lysis buffer。劇烈 震盪後置於冰上 30 分鐘處理樣品，再經離心 (4℃、10,000 rpm、10 分鐘) 取出上清液即含細胞蛋白質。再經西方點墨法於β
-actin 比對下 測定，分析乳癌細胞株細胞內與細胞週期相關蛋白質的影響，進而探 討其分子作用機轉。一、測定與細胞週期中的 G2/M 期相關的 cyclins (cyclin B1；Cyclin A) 經西方點墨法於
β
-actin 比對下測定 cyclin B1 及 Cyclin A。結果 發現苦蘵萃取物 150µ
g/ml 就可以有異差的減低 Cyclin A 濃度達 40%，隨藥物劑量升高抑制作用也加強 (圖十七)。而苦蘵萃取物 600µ
g/ml 才可以有異差的減低 Cyclin B1 濃度 (圖十八)。所以根據實驗結果顯示苦蘵萃取物，可以有異差的減低與細胞週期中的 G2/M 期相 關的 cyclin A 及 Cyclin B1。
二、測定與細胞週期中的 G2/M 期相關的 CDKs (cdc2; chk1)；
以西方點墨法於
β
-actin 比對下測定 cdc2。結果發現苦蘵萃取物 150µ
g/ml 就可以影響 cdc2 濃度。而 450µ
g/ml 才可以有異差的減低 cdc2 濃度 (圖十九)。所以根據實驗結果顯示苦蘵萃取物，可能有異 差的減低與細胞週期中的 G2/M 期相關的 Cdc2，但影響小 (圖二十)。三、測定與細胞週期中的G2/M期相關的 CDKIs (p21 Waf1/Cip1及 p27 Kip1) 經西方點墨法於
β
-actin 比對下測定週期蛋白依賴抑制激?p21 Waf1/Cip1
及 p27 Kip1濃度。結果發現苦蘵萃取物 150
µ
g/ml 處理 24 小時後，就可以有異差的增加 p21 Waf1/Cip1濃度，隨藥物劑量升高增加 濃度作用也加強 (圖二十)。而苦蘵萃取物 150µ
g/ml 處理 24 小時後，就可以有異差的增加 p27 Kip1濃度，隨藥物劑量升高增加濃度作用也 加強 (圖二十一)，但 600
µ
g/ml 處理 24 小時後，就可以有異差的增 加 p27 Kip1濃度作用反而減低(圖二十一)。所以根據實驗結果顯示苦蘵 萃取物，可以有異差的增加與細胞週期中的 G2/M 期相關的週期蛋白 依賴抑制激? p21 Waf1/Cip1及 p27 Kip1濃度。四、測定與細胞週期中的 G2/M 期相關檢查點的相關因子；Chk2、
Cdc25c、Wee1
經西方點墨法於
β
-actin 比對下測定 G2/M 期相關檢查點的相關 因子 Chk2 濃度。結果發現苦蘵萃取物 150µ
g/ml 處理 24 小時後，就 可以有異差的增加 Chk2 濃度，隨藥物劑量升高增加濃度作用也加強 (圖二十二)。經西方點墨法於
β
-actin 比對下測定 G2/M 期相關檢查點的相關 因子 cdc25c。結果發現苦蘵萃取物 150µ
g/ml 就可以有異差的減低 cdc25c 濃度達，隨藥物劑量升高抑制作用也加強 (圖二十三)經西方點墨法於
β
-actin 比對下測定 G2/M 期相關檢查點的相關 因子 Wee1 濃度。結果發現苦蘵萃取物 150µ
g/ml 處理 24 小時後，就可以有異差的增加 Wee1 濃度，隨藥物劑量升高增加濃度作用也加 強 (圖二十四)。
所以根據實驗結果顯示苦蘵萃取物處理 24 小時後，可以有異差 的影響細胞週期中的 G2/M 期相關檢查點的相關因子；Chk2、
Cdc25c、Wee1 濃度。
(A)
Cyclin A expression (% of control)
0
(A)
P.A (
µ
g/ml)0 150 300 450 600 Cyclin B1
β
-actin (B)圖 十 八 . (A) 以西方墨點法分析 MDA-MB 231 乳癌細胞株經不同濃 度處理苦蘵萃取物 24 小時後分析細胞中 Cyclin B1 蛋白的相對表現 量。
β
-actin 為 internal control。(B) Cyclin B1 蛋白相對表現量的統計 圖。數據結果以平均值±標準差 (mean±SD) 表示，n=3。*代表 P 值 小於 0.05。Cyclin B1 expression (% of control)
0 20 40 60 80 100
P.A (
µ
g/ml)0 150 300 450 600
*
(A)
P.A (
µ
g/ml)0 150 300 450 600 Cdc2
β
-actin(B)
圖十九. (A) 以西方墨點法分析 MDA-MB 231 乳癌細胞株經不同濃 度處理苦蘵萃取物 24 小時後分析細胞中 Cdk1 蛋白的相對表現量。
β
-actin 為 internal control。(B) Cdc2 蛋白相對表現量的統計圖。數據 結果以平均值±標準差 (mean±SD) 表示，n=3。*代表 P 值小於 0.05。Cdk
1expression (% of control)
0 20 40 60 80 100
P.A (µg/ml)
0 150 300 450 600
*
(A) 量。
β
-actin 為 internal control。(B) P21 Waf1/Cip1蛋白相對表現量的統計 圖。數據結果以平均值±標準差 (mean±SD) 表示，n=3。*代表 P 值 小於 0.05、**代表 P 值小於 0.01、***代表 P 值小於 0.001。P21 expression (% of control)
0
(A)
P.A (
µ
g/ml)0 150 300 450 600 P27 Kip1
β
-actin(B)
圖二十一. (A) 以西方墨點法分析 MDA-MB 231 乳癌細胞株經不同 濃度處理苦蘵萃取物 24 小時後分析細胞中 P27 Kip1蛋白的相對表現 量。
β
-actin 為 internal control。(B) P27 Kip1蛋白相對表現量的統計圖。數據結果以平均值±標準差 (mean±SD) 表示，n=3。*代表 P 值小於 0.05、**代表 P 值小於 0.01。
P27 expression (% of control)
0 50 100 150 200
P.A (
µ
g/ml)0 150 300 450 600
* **
*
(A) 量。
β
-actin 為 internal control。(B) Chk2 蛋白相對表現量的統計圖。數據結果以平均值±標準差 (mean±SD) 表示，n=3。**代表 P 值小於 0.01、***代表 P 值小於 0.001。
Chk
2expression (% of control)
0
(A) 量。
β
-actin 為 internal control。(B) Cdc25c 蛋白相對表現量的統計圖。數據結果以平均值±標準差 (mean±SD) 表示，n=3。*代表 P 值小於 0.05、**代表 P 值小於 0.01、***代表 P 值小於 0.001。
Cdc25c expression (% of control)
0
(A) 量。
β
-actin 為 internal control。(B) Wee1 蛋白相對表現量的統計圖。數據結果以平均值±標準差 (mean±SD) 表示，n=3。*代表 P 值小於 0.05、**代表 P 值小於 0.01、***代表 P 值小於 0.001。
wee1 expression (% of control)
0
第五節、以 RT-PCR 分析：檢測苦蘵萃取物對人類 MDA-MB 231 乳 癌 細 胞 株 細 胞 內 與 細 胞 週 期 相 關 mRNA 的 影 響
以流式細胞儀發現苦蘵萃取物對 MDA-MB 231 乳癌細胞株抑制 作用為產生 G2/M phase arrest，使細胞週期停滯及產生細胞凋亡。經 西方點墨法於
β
-actin 比對下測定 cyclin B1 及 Cyclin A。結果發現苦 蘵萃取物，隨藥物劑量升高可以有異差的減低 Cyclin A (圖二十五)。而苦蘵萃取物 600
µ
g/ml 才可以有異差的影響 Cyclin B1 濃度 (圖二 十六)。所以為進一步探討苦蘵萃取物對人類 MDA-MB 231 乳癌細胞株 細胞內與細胞週期相關 mRNA，以 RT-PCR 分析，苦蘵萃取物對人類 MDA-MB 231 乳癌細胞株細胞內與細胞週期相關 mRNA 的影響。結 果發現苦蘵萃取物 150
µ
g/ml 就可以有異差的減低 Cyclin A mRNA 濃度，隨藥物劑量升高抑制作用也加強 (圖二十五)。而 Cyclin B1 mRNA 則沒有明顯的差異 (如圖二十六)。(A)
P.A (
µ
g/ml)0 150 300 450 600 Cyclin A
β
-actin (B)圖二十五. (A) 以 RT-PCR 分析 MDA-MB 231 乳癌細胞株經不同濃度 處理苦蘵萃取物 24 小時後分析細胞中 Cyclin A mRNA 的相對表現 量。
β
-actin 為 internal control。(B) Cyclin A mRNA 相對表現量的統 計圖。Cyclin A expression (% of control)
0 20 40 60 80 100
P.A (
µ
g/ml)0 150 300 450 600
(A)
P.A (
µ
g/ml)0 150 300 450 600 Cyclin B1
β
-actin (B)圖二十六. (A) 以 RT-PCR 分析 MDA-MB 231 乳癌細胞株經不同濃度 處理苦蘵萃取物 24 小時後分析細胞中 Cyclin B1 mRNA 的相對表現 量。
β
-actin 為 internal control。(B) Cyclin B1 mRNA 相對表現量的統 計圖。Cyclin B
1expression (% of control)
0 20 40 60 80 100 120
P.A (
µg/ml)
0 150 300 450 600
第五章 討論
本研究在型態學方面，發現苦蘵對人類 MDA-MB 231 乳癌細胞 株抑制作用也隨之增強。經 12, 24, 48,72 小時培養後，苦蘵萃取物 150
µ
g/ml 已經有更明顯的產生抑制增殖作用；300µ
g/ml 有明顯的產 生細胞無法貼壁現象並制細胞生長，少有空泡化現象；而且 450µ
g/ml 除了已經有明顯的產生抑制增殖作用其細胞數目明顯減少，有細胞凋本研究在型態學方面，發現苦蘵對人類 MDA-MB 231 乳癌細胞 株抑制作用也隨之增強。經 12, 24, 48,72 小時培養後，苦蘵萃取物 150