實驗方法

一 、 石 斛 水 萃 取 物 的 製 備 及 配 製

秤取 50 g 的石斛，加入 750 mL 去離子水浸泡 4 小時。將含有 750 mL 去離子水之浸泡液的石斛一起放入自動煎藥壺（麥登保溫自動煎 藥壺，型號 MD-318/628）進行 90 min 的煎煮。原藥材再加入 750 mL 去離子水進行第二次煎煮。將兩次煎煮好的藥汁混合均勻，使用一號 濾紙過濾，將濾液分裝至 50 mL 離心管並放至-80℃冰箱中凍結，然 後進行真空冷凍乾燥（如圖 3.1）。

稱取經冷凍乾燥之石斛水提取物 0.045 g，溶於 1.5 mL DMSO，

配製成石斛水提取物之原始溶液（stock solution），從 stock solution

（30 mg/mL）分別取 1.25、2.5、5、10 及 20

µ

L（其最終濃度為 18.75、

37.5、75、150 及 300

µ

g/mL）加入 12 孔洞平盤 (12 well plate)中進行 細胞增生及細胞週期測試。加入 10 cm dish 中進行細胞凋亡的測試

（DNA fragmentation electrophoresis analysis）和反轉錄聚合酵素連鎖 反應（Reverse-transcription polymerase chain reaction, RT-PCR）等分 析。

50 g 石 斛

加 入750 mL D.I. water

浸 泡 4小 時

放 入 自 動 煎 藥 壺

藥 汁 藥 材

過 濾

濾 液

冷 凍 乾 燥

石 斛 水 萃 取 物

圖 3.1 石斛水萃取物之製備流程圖

二 、 冷 凍 細 胞 之 活 化

冷凍細胞之活化原則為快速解凍，以避免冰晶重新結晶而對細胞 造成傷害，導致細胞之死亡。細胞活化後，約需數日，或繼代一至二 代，其細胞生長或特性表現才會恢復正常﹙例如產生單株抗體或是其 他蛋白質﹚。冷凍的細胞快速解凍的方法為：將冷凍管由液氮或乾冰 容器中取出，立即放入 37 ℃水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在 3 分鐘內全部融化，以 70﹪酒精擦拭保存管的外部，移入無菌操作台 內。取出解凍之細胞懸浮液，緩緩加入有培養基之培養容器內 (稀釋 比例為 1:10∼1:15)，混合均勻，放入 CO₂ 培養箱培養。在解凍培養 後隔日更換培養基。

三 、 細 胞 冷 凍 保 存

注意事項：欲冷凍保存之細胞應在生長良好﹙log phase﹚且存活 率高之狀態，約為 80-90﹪緻密度。注意冷凍保護劑之品質。DMSO 應為試劑級等級，無菌且無色﹙以 0.22 micron FGLP Telflon 過濾或是 直接購買無菌產品﹚，以 5-10 mL 小體積分裝，4 ℃避光保存，勿作 多次解凍。冷凍保存之細胞濃度：5 × 10⁶∼10 × 10⁶ cells/mL。冷凍 保存劑濃度為 5﹪DMSO。

細胞冷凍保存之操作步驟為：冷凍前一日前更換半量或全量培養 基，觀察細胞生長情形。配製冷凍保存溶液（使用前配製）：將 DMSO

加入新鮮培養基中，最後濃度為 5﹪，混合均勻，置於室溫下待用。

取少量細胞懸浮液（約 0.1 mL）計數細胞濃度及凍前存活率。離心，

去除上清液，加入適量冷凍保存溶液，使細胞濃度為 1× 10⁶∼5× 10⁶ cells/mL，混合均勻，分裝於已標示完全之冷凍保存管中，1 mL/vial。

冷凍保存方法：冷凍管置於 4 ℃ 10 分鐘 ? -20 ℃ 30 分鐘 ? -80

℃ 16∼18 小時 ? 液氮槽長期儲存。

四 、 人 類 乳 癌 細 胞 （ MDA-MB-231） 之 培 養

實驗進行前，無菌室和無菌操作台以紫外燈照射 36-60 分鐘，以 70﹪ethanol 擦拭無菌操作台面，並開啟無菌操作颱風扇運轉 10 分鐘 後，才開始實驗操作。所有進入無菌操作台的器物均需先噴灑 70%酒 精，有蓋容器旋開瓶蓋前均需先過火。

人類乳癌細胞（human breast cancer, MDA-MB-231）購自食品工 業發展研究所（Food Industry Research and Development Institute），培 養於 MEM（Modified Eagle Medium）中（含 10﹪fetal calf serum、2 mM

L-glutamine、100 µg/mL of streptomycin 和 100 units/mL of penicillin）

。將細胞放置於 37℃、5﹪CO₂的培養箱中培養。定期以 Trypan blue 染色，利用血球計數盤（Hemocytometer）計數細胞數目及存活率，

並控制持續培養的數目，使其細胞密度維持在 2 × 10⁵∼5 × 10⁵ cells/mL。

五 、 細 胞 數 目 計 數 及 細 胞 存 活 測 試

計算細胞數目是用血球計數盤，血球計數盤一般有二個槽 chambers，每個槽（chamber）中細刻 9 個 1 mm²大之正方形，其中 4 個角落之正方形再細刻 16 個小格，深度均為 0.1 mm。當 chamber 上 方蓋上蓋玻片後，每個大正方形之體積為 1 mm² × 0.1 mm = 1 × 10^-4 mL。使用時，計數每個大正方形內之細胞數目，乘以稀釋倍數，再 乘以 10⁴，即為每 mL 中之細胞數目（如下圖 3.2 所示）。

(細胞計數盤)

圖 3.2 細胞計數盤結構

存活測試之原理為 dye exclusion，利用染料會滲入死細胞中而呈 色，而活細胞因細胞膜完整，染料無法滲入而不會呈色。一般使用藍 色之 trypan blue 染料。

存活測試之步驟，首先取 50

µ

L 細胞懸浮液與 50

µ

L trypan blue ( 0.4﹪w/v trypan blue)等體積混合均勻於 1.5 mL 離心管中。取少許混

1 2

3

4 5

細胞計數區域 放大簡圖

合液（約 15

µ

L）血球計數盤之 chamber 上方凹槽加入，蓋上蓋玻片，

於 100 倍倒立顯微鏡下觀察，活細胞不被染色，死細胞則被染成藍 色。計數五個大方格之細胞總數，再除 5，乘以稀釋倍數﹙至少乘以 2，因與 trypan blue 等體積混合﹚，最後乘以 10⁴，即為每 mL 中細胞 懸浮液之細胞數。若細胞位於線上，只計上線與右線之細胞﹙或計下 線與左線之細胞﹚。如所含細胞密度過高，則算出的數目誤差較大（每 一大格過 50 個細胞），需再加入更多的培養液稀釋。完成存活測試之 步驟後，即可計算所需的細胞數，將所需的細胞數培養至 12 孔洞平 盤或 10 cm dish 中利用流式細胞儀進行存活率的測試。

六、 石斛水萃取物對人類乳癌細胞株（MDA-MB-231）細胞增生 的 影 響

細胞增生的測試中 存活的細胞數是利用流式細胞儀（Flow Cytometer）計數。流式細胞儀包括液流系統、光學系統、分選系統 和電子系統。待測樣本經液流系統傳送後，依序地通過流式細胞儀中 雷射照射的區域，受雷射的激發產生信號，被信號接收器接受並放 大，這些放大的信號經電腦分析處理，並以圖表的形式顯示出來。流 式細胞儀產生並分析的信號主要有光散射信號和螢光信號。依螢光素 的不同，用不同波長的光激發，發射出不同波長的螢光，可顯示不同 的顏色（79）。

利用流式細胞儀評估存活細胞數和存活率其原理如下：當細胞死 亡時會進行細胞壞死（Necrosis）或細胞凋亡（Apoptosis）的路徑，

死亡的細胞其細胞膜會失去完整性（ membrane integrity）（ 79）。

Propidium Iodine（PI）是一種核酸染劑，以 PI 進行染色時，死亡的 細胞，因其細胞膜破裂，PI 可進入細胞內和核酸結合；存活的細胞，

因其細胞膜完整，PI 無法和細胞內的核酸結合。經 PI 染色完成的細 胞可由流式細胞儀於 488 nm 的雷射光激發後，死亡的細胞會呈現較 強的紅色螢光，而存活的細胞則呈現較弱的紅色螢光（ 80）。以 CellQuest 軟體分析細胞的增殖率（如下圖 3.3 所示）。

圖 3.3 利用 PI（Propidium Iodide）單染細胞時細胞型態變化 Dead cells

Viable Cells

細胞增殖率以下列公式計算：

（實驗組存活細胞數目÷對照組存活細胞數目）× 100﹪

實驗組：乳癌細胞加入石斛（stock solution： 30 mg/mL DMSO）

對照組：乳癌細胞加入含有 20 µL DMSO 之 2 mL 新鮮的培養液 進行分盤實驗的前一天，乳癌細胞需以離心去除上清液後加入新鮮的 培養液，並使細胞密度在 2 × 10⁵∼4 × 10⁵ cells/mL。

進行分盤時，首先需利用細胞計數盤計數細胞（至少二重複）以 求出其準確的細胞密度，接著加入培養液把細胞密度稀釋至 1 × 10⁵ cells/mL 並將 2 mL 含 2 × 10⁵ cells 種植至 12 孔洞平盤中，然後放置 於 37℃、5﹪CO₂的培養箱（incubator）進行培養。隔天加藥。試藥 的配製為秤取 0.045 g 試藥溶於 1.5 mL DMSO 中，從 stock solution 分別取 1.25、2.5、5、10 及 20 µL 加入 12 孔洞平盤中，每種濃度作 四重複。其最終濃度為 18.75、37.5、75、150 及 300 µg/mL，12 孔洞 平盤中石斛水萃物濃度分配如圖 3.4。培養 24 和 48 小時後，各取一 組細胞來檢測細胞生長的情形。

C C C C 75 75 75 75 18.75 18.75 18.75 18.75 150 150 150 150

37.5 37.5 37.5 37.5 300 300 300 300

圖 3.4 12 孔洞平盤中石斛水萃物濃度分配情形

取 15 mL 離心管並於其上標示各個藥物濃度。利用塑膠吸管從 每一個孔洞中的 medium 吸取至 15 mL 離心管，加入 2 mL PBS 緩衝 液（表 3.1）至平盤中清洗，輕搖晃平盤並吸取 PBS 緩衝液至離心管，

加入約 1 mL 胰蛋白? 貼附的細胞從平盤上分離，接著加入 2 mL PBS 緩衝液至平盤並吸取 PBS 緩衝液至離心管，進行 1500 rpm，5 min 的 離心。倒掉上清液，將細胞完勻打散後，再加入 2 mL PBS 緩衝液至 平盤並吸取 PBS 緩衝液至離心管，進行 1500 rpm、5 min 的離心。於 離心管中加入適量經 5 倍稀釋後的 PI 染劑（450∼550 µL，視細胞數 而定）（表 3.2），混合均勻後，即可進行流式細胞儀分析，固定計數 秒數（20 秒）及流速（35 µL/min），計數細胞增殖率。

表 3.1 1 倍磷酸緩衝鹽類溶液（1X phosphate buffer saline, PBS, pH=7.4）之組成

組 成 重 量(g)

NaCl 8.0

KCl 0.2

Na₂HPO₄ 1.44

KH₂PO₄ 0.24

加 DDW 至總體積 1000 mL

表 3.2 PI（propidium iodide）stain 染劑之組成

組 成 最終濃度 初濃度 體積 (ml)

Propidium iodide (PI) 0.4 mg/dl 2 mg/dl 5

Triton 1 % 5 % 5

RNase A 0.1 mg/mL 2 mg/mL 1.25

1X PBS - - 13.75

總體積 25 mL

*RNase A 配好後需以 70 ℃加熱 20 分鐘處理後分裝。

*PI stain 染劑儲存於 4℃。

七、 檢測石斛水萃取物對人類乳癌細胞株（MDA-MB-231）細胞 型 態 的 影 響

將 2 mL 含 2 × 10⁵ cells 種植至 12 孔洞平盤之每個孔洞中，放入 37 ℃、5﹪CO₂的培養箱進行培養。隔天加入 300

µ

g/mL 的石斛水提 取物至 12 孔洞平盤中，放入 37 ℃、5﹪CO₂的培養箱進行培養。經 過 12、24、36 及 48 小時培養後，以倒立式位像差顯微鏡觀察細胞型 態的改變。

八、 檢測石斛水萃取物對人類乳癌細胞株（MDA-MB-231）細胞 週 期 的 影 響

將 2 mL 含 2 × 10⁵ cells 種植至 12 孔洞平盤之每個孔洞中，放入 37 ℃、5﹪CO₂的培養箱進行培養。隔天加入不同濃度的石斛水萃取 物（0-300 µg/mL）至 12 孔洞平盤中，放入 37 ℃、5﹪CO₂的培養箱 進行培養， 於 24 和 48 小時後檢測細胞週期改變的情形。

將離心管標示各個藥物濃度，同時取出胰蛋白? 回溫。利用塑膠 吸管從每一個孔洞中的 medium 吸取至 15 mL 離心管，加入 2 mL PBS 緩衝液至平盤中清洗，輕搖晃平盤並吸取 PBS 緩衝液至離心管，加 入約 1 mL 的胰蛋白? 使貼附的細胞從平盤上分離，接著加入 2 mL PBS 緩衝液至平盤並吸取 PBS 緩衝液至離心管，進行 1500 rpm，5 min

離心。倒掉上清液，將細胞完全均勻打散後，再加入 2 mL PBS 緩衝 液至平盤並吸取 PBS 緩衝液至離心管，進行 1500 rpm，5 min 的離心。

倒掉上清液，再將細胞完全均勻打散後，以冰的 70﹪酒精（4 ℃）

進行細胞固定步驟（震盪器以”SHAKE 3”速度震盪，一滴一滴緩慢將 酒精滴入），隨後將細胞固定步驟完成的樣品置於-20 ℃冰箱隔夜存 放。

隔天，將樣品從冰箱取出後離心（1500 rpm、5 分鐘）以去除酒 精，之後將細胞完全打散。加入 2 mL 的 PBS 緩衝液清洗並離心。將

隔天，將樣品從冰箱取出後離心（1500 rpm、5 分鐘）以去除酒 精，之後將細胞完全打散。加入 2 mL 的 PBS 緩衝液清洗並離心。將

在文檔中 石斛對人類乳癌細胞株(MDA-MB-231)的細胞週期及細胞凋亡之影響; Effects of Shihu on cell cycle and apoptosis in human breast cancer cell line (MDA-MB-231) (頁 45-68)