由於西藥（抗癌藥物）引起副作用的報告不斷，研究人員漸漸把 注意力轉移到中草藥。例如 :苦艾，華盛頓大學的生物工程研究員 Henry Lai 的報告顯示，此複合物可以在十六個小時內消滅了試管內 所有與其接觸的人體癌細胞（85）。此外，西元 1994 年，FDA 通過 的紫杉醇用於轉移性乳癌的第二線化學治療或在輔助性化學治療完 後六個月內復發的乳癌患者也非常有效（86）。因此中草藥對於預防 或治療癌症之潛力，成為治療癌症之保健食品或新藥開發之研究重 點。而抗癌藥物誘發細胞週期的停滯和細胞凋亡的作用是很重要的測 定抗癌藥物的治療效果。所以本研究選用中草藥－石斛，分析是否可 誘發人類乳癌細胞（ MDA-MB-231）之細胞週期的停滯和細胞凋亡的 作用
石斛，有文獻指出石斛具有抗癌的活性，如 HL-60 細胞株、小 鼠肝癌、腫瘤細胞株 K562 等（19-23）。但是石斛對於人類乳癌細胞
（MDA-MB-231）是否能有效抑制依然沒有足夠的資料。
因此本研究中將藉由石斛來探討是否其可抑制細胞增生、是否能 干擾細胞週期的運轉及誘發細胞凋亡。在 2001 年，張潔等人在探討 銅皮石斛水提液的抗癌活性及其誘導急性白血病細胞凋亡的發生機
制中，使用的劑量為 0.39、1.56、3.13 和 6.25 mg/mL。使用 0.39、1.56、
3.13 mg/mL 進行流式細胞儀的分析，而 6.25 mg/mL 進行 DNA fragmentation 及西方點墨分析，結果發現銅皮石斛水提液的抗癌活性 及其誘導急性白血病細胞凋亡。而本研究所使用的劑量為 18.75、
37.5、75、150 及 300 µg/mL，皆比上述所使用的劑量還低，尤其是 使用 300 µg/mL 劑量時呈現顯著的 G2/M arrest 和細胞凋亡。不過由於 所購買的中藥材沒有經過基原鑑定，只能從中藥行的老闆告知其為二 級品的霍山石斛。因此本研究使用的石斛需要再經過基原鑑定。
檢測石斛水提取物對人類乳癌細胞株（MDA-MB-231）細胞 增生的影響，圖 4.2 (a)為加藥後第 24 小時細胞增生的變化情形，由 圖中可發現石斛水萃取物對於人類乳癌細胞的增生之影響為隨著石 斛濃度的增加（150-300
µ
g/mL），其抑制乳癌細胞增生的作用越顯 著。圖 4.2 (b)為加藥後第 48 小時細胞增生的變化情形，同樣地也發 現了隨著濃度（150-300µ
g/mL）及時間的增加此抑制作用越顯著。利用倒立式位像差顯微鏡觀察細胞型態，發現投予石斛水萃取物（300
µ
g/ml）對人類乳癌細胞在 24 小時即有明顯改變。隨著時間的增加，其細胞數目明顯減少，也有受損、破裂及空泡化現象，如圖 4.3。
檢測石斛對人類乳癌細胞株（MDA-MB-231）細胞週期的影 響，圖 4.4-4.7 為投予不同濃度的石斛水萃取物（0-300
µ
g/mL）於第24、48 小時之乳癌細胞週期變化的情形，結果發現隨著石斛水萃取 物濃度的增加，尤其是濃度為 150
µ
g/mL 及 300µ
g/mL 發生顯著 G2/M phase arrest 和 apoptosis。另外投予 300µ
g/mL 石斛水萃取物於第 12、24、36 和 48 小時之乳癌細胞週期變化的情形，圖 4.8 結果發現於第 12 和 24 小時開始發生顯著的 G2/M phase arrest，第 36 和 48 小時 G2/M 所佔細胞週期的百分比逐漸降低，但產生顯著的細胞凋亡的現象（ 36 小時）。
接著進行檢測石斛水萃取物對人類乳癌細胞是否產生細胞凋亡 的情形，由細胞週期的分析可以發現投予 300
µ
g/mL 石斛水萃取物於 36 小時產生細胞凋亡的現象，所以進一步地利用 DNA 電泳檢測 36 小時細胞凋亡的情形，結果也發現顯著 DNA 裂解成梯度片段的產生。經由流式細胞儀分析細胞週期的分佈情形，發現明顯的 G2/M phase arrest；所以進一步利用反轉錄聚合酵素連鎖反應檢測投予 300
µ
g/mL 石斛水萃取物至人類乳癌細胞，經過 3、6、12 和 24 小時，乳 癌細胞之 G2/M 期相關 cyclin 、CDK 及 apoptosis 基因的表現。Cyclin B1 mRNA 之相對含量在 12 小時是相較於控制組為低，然在 24 小時 相較於控制組為高（圖 4.11）。Cdk1 mRNA 之相對含量於 6 和 24 小 時相較於控制組為高（圖 4.12）。Wee 1 mRNA 之相對含量於 3 和 6 小時增加，至 12 小時顯著降低（圖 4.13）。Chk1 mRNA 之相對含量在 3 和 6 小時是相較於控制組為低，然在 12 和 24 小時相較於控制組 為高（圖 4.14）。p21 mRNA 之相對含量在 3 和 24 小時是相較於控制 組為高（圖 4.15）。Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 mRNA 之相對 含量在 24 小時相較於控制組為高（圖 4.16-18）。
第五章 討論
由於西藥（抗癌藥物）引起副作用的報告不斷，研究人員漸漸把 注意力轉移到中草藥。例如 :苦艾，華盛頓大學的生物工程研究員 Henry Lai 的報告顯示，此複合物可以在十六個小時內消滅了試管內 所有與其接觸的人體癌細胞（85）。此外，西元 1994 年，FDA 通過 的紫杉醇用於轉移性乳癌的第二線化學治療或在輔助性化學治療完 後六個月內復發的乳癌患者也非常有效（86）。因此中草藥對於預防 或治療癌症之潛力，成為治療癌症之保健食品或新藥開發之研究重 點。而抗癌藥物誘發細胞週期的停滯和細胞凋亡的作用是很重要的測 定抗癌藥物的治療效果。所以本研究選用中草藥－石斛，分析是否可 誘發人類乳癌細胞（ MDA-MB-231）之細胞週期的停滯和細胞凋亡的 作用。
石斛，有文獻指出石斛具有抗癌的活性，如 HL-60 細胞株、小 鼠肝癌、腫瘤細胞株 K562 等（19-23）。但是石斛對於人類乳癌細胞
（MDA-MB-231）是否能有效抑制依然沒有足夠的資料。
因此本研究中將藉由石斛來探討是否其可抑制細胞增生、是否 能干擾細胞週期的運轉及誘發細胞凋亡。在 2001 年，張潔等人在探 討銅皮石斛水提液的抗癌活性及其誘導急性白血病細胞凋亡的發機
制中，使用的劑量為 0.39、1.56、3.13 和 6.25 mg/mL。使用 0.39、1.56、
3.13 mg/mL 進行流式細胞儀的分析，而 6.25 mg/mL 進行 DNA fragmentation 及西方點墨分析，結果發現銅皮石斛水提液的抗癌活性 及其誘導急性白血病細胞凋亡。而本研究所使用的劑量為 18.75、
37.5、75、150 及 300 µg/mL，皆比上述所使用的劑量還低，尤其是 使用 300 µg/mL 劑量時呈現顯著的 G2/M arrest 和細胞凋亡。不過由於 所購買的中藥材沒有經過基原鑑定，只能從中藥行的老闆告知其為二 級品的霍山石斛。因此本研究使用的石斛需要再經過基原鑑定。
檢測石斛水提取物對人類乳癌細胞株（MDA-MB-231）細胞 增生的影響，圖 4.2 (a)為加藥後第 24 小時細胞增生的變化情形，由 圖中可發現石斛水萃取物對於人類乳癌細胞的增生之影響為隨著石 斛濃度的增加（150-300
µ
g/mL），其抑制乳癌細胞增生的作用越顯 著。圖 4.2 (b)為加藥後第 48 小時細胞增生的變化情形，同樣地也發 現了隨著濃度（150-300µ
g/mL）及時間的增加此抑制作用越顯著。利用倒立式位像差顯微鏡觀察細胞型態，發現投予石斛水萃取物（300
µ
g/ml）對人類乳癌細胞在 24 小時即有明顯改變。隨著時間的增加，其細胞數目明顯減少，也有受損、破裂及空泡化現象，如圖 4.3。
檢測石斛對人類乳癌細胞株（MDA-MB-231）細胞週期的影 響，圖 4.4-4.7 為投予不同濃度的石斛水萃取物（0-300
µ
g/mL）於第24、48 小時之乳癌細胞週期變化的情形，結果發現隨著石斛水萃取 物濃度的增加，尤其是濃度為 150
µ
g/mL 及 300µ
g/mL 發生顯著 G2/M phase arrest 和 apoptosis。另外投予 300µ
g/mL 石斛水萃取物於第 12、24、36 和 48 小時之乳癌細胞週期變化的情形，圖 4.8 結果發現於第 12 和 24 小時開始發生顯著的 G2/M phase arrest，第 36 和 48 小時 G2/M 所佔細胞週期的百分比逐漸降低，但產生顯著的細胞凋亡的現象（ 36 小時）。
接著進行檢測石斛水萃取物對人類乳癌細胞是否產生細胞凋亡 的情形，由細胞週期的分析可以發現投予 300
µ
g/mL 石斛水萃取物於 36 小時產生細胞凋亡的現象，所以進一步地利用 DNA 電泳檢測 36 小時細胞凋亡的情形，結果也發現顯著 DNA 裂解成梯度片段的產生。經由流式細胞儀分析細胞週期的分佈情形，發現明顯的 G2/M phase arrest；所以進一步利用反轉錄聚合酵素連鎖反應檢測投予 300
µ
g/mL 石斛水萃取物至人類乳癌細胞，經過 3、6、12 和 24 小時，乳 癌細胞之 G2/M 期相關 cyclin 、CDK 及 apoptosis 基因的表現。Cyclin B1 mRNA 之相對含量在 12 小時是相較於控制組為低，然在 24 小時 相較於控制組為高（圖 4.11）。Cdk1 mRNA 之相對含量於 6 和 24 小 時相較於控制組為高（圖 4.12）。Wee 1 mRNA 之相對含量於 3 和 6 小時增加，至 12 小時顯著降低（圖 4.13）。Chk1 mRNA 之相對含量在 3 和 6 小時是相較於控制組為低，然在 12 和 24 小時相較於控制組 為高（圖 4.14）。p21 mRNA 之相對含量在 3 和 24 小時是相較於控制 組為高（圖 4.15）。Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 mRNA 之相對 含量在 24 小時相較於控制組為高（圖 4.16-18）。
利用西方點墨法檢測投予 0、18.75、37.5、75、150 及 300 µg/mL 石斛水萃物至人類乳癌細胞，經過 24 小時後，其細胞內與細胞週期 G2/M phase 相關蛋白質的影響。結果發現 cyclin B1、Cdk1 蛋白質的 表現量與控制組比較，其表現量是明顯上升（如圖 4.19-4.20）。Cdc25c 蛋白質的表現量與控制組比較則無明顯變化（如圖 4.21）； Wee 1 在 石斛水萃物（150 及 300 µg/mL）劑量時與控制組比較其表現量是顯 著上升（如圖 4.22）。於 G2/M phase 進行需要 Cdk1 的活性，cyclin B1 與 Cdk1 結合而正向調控 G2/M phase 進行（87），當 Cdk1 之胺基酸 序列 Thr14 和 Tyr15 受到磷酸化時，其活性受到抑制而負向調控 G2/M phase 進行造成 G2/M arrest（88-89）。由實驗結果發現 cyclin B1、Cdk1 蛋白質的表現量與控制組比較是明顯上升，這在其他的文獻也有報導 過（90-94）；因此石斛水萃取物對於 MDA-MB-231 細胞週期停滯於 G2/M phase 並非是藉由降低 cyclin B1 的機制。Wee 1 可使 Cdk1 之胺 基酸序列 Thr14 和 Tyr15 磷酸化造成 Cdk1 的活性降低（ 95）；由實驗 結果發現 Wee 1 蛋白質的表現量隨濃度增加而上升。因此可推測石斛
水萃取物引起細胞週期停滯於 G2/M phase可能是 Cdk1的活性降低所 造成。至於 Cdk1 活性則需要作更進一步的研究探討。另一方面，
p21WAF1/CIP1 的表現量也會隨著加入石斛萃取物而表現量增加（如圖
4.23），故推論 p2 1WAF1/CIP1也許是調控促使人類乳癌細胞引起細胞週 期停滯於 G2/M phase 的主要因子。有文獻報導過 p21 WAF1/CIP1的表現
4.23），故推論 p2 1WAF1/CIP1也許是調控促使人類乳癌細胞引起細胞週 期停滯於 G2/M phase 的主要因子。有文獻報導過 p21 WAF1/CIP1的表現