第四章 結果
第七節 反轉錄聚合酵素連鎖反應 (Reverse-transcription
Apoptosis 基 因 的 表 現
一 、 Cyclin B mRNA 之 相 對 含 量 變 化
將 300 µg/mL 石斛水萃取物加入於 10 cm dish 中，於 37 ℃、5
﹪CO2的培養箱進行培養。經過 3、6、12 和 24 小時後，抽取細胞中 的 total RNA，利用 RT-PCR 分析乳癌細胞其 Cyclin B mRNA 之相對 含量變化。由圖 4.11 可觀察到投予石斛水萃取物（300 µg/mL）經過 12、24、36 和 48 小時後，乳癌細胞 Cyclin B mRNA 之相對含量與控 制組（將 3 小時控制組設定為 1）比較，其值分別為 0.95、0.96、1.02 和 1.32。
二 、 Cdk1 mRNA 之 相 對 含 量 變 化
將 300 µg/mL 石斛水萃取物加入於 10 cm dish 中，於 37 ℃、5
﹪CO2的培養箱進行培養。經過 3、6、12 和 24 小時後，抽取細胞中 的 total RNA，利用 RT-PCR 分析乳癌細胞其 Cdk1 mRNA 之相對含量 變化。由圖 4.12 可觀察到投予石斛水萃取物（ 300 µg/mL）經過 12、
24、36 和 48 小時後，乳癌細胞 Cdk1 mRNA 之相對含量與控制組（將 3 小時控制組設定為 1）比較，其值分別為 0.86、0.75、0.45 和 0.52。
三 、 Wee 1 mRNA 之 相 對 含 量 變 化
將 300 µg/mL 石斛水萃取物加入於 10 cm dish 中，於 37 ℃、5﹪
CO2的培養箱進行培養。經過 3、6、12 和 24 小時後，抽取細胞中的 total RNA，利用 RT-PCR 分析乳癌細胞其 Wee1 mRNA 之相對含量變 化。由圖 4.13 可觀察到投予石斛水萃取物（300 µg/mL）經過 12、24、
36 和 48 小時後，乳癌細胞 Wee 1 mRNA 之相對含量與控制組（將 3 小時控制組設定為 1）比較，其值分別為 1.5、0.91、0.14 和 0.18。
四 、 Chk1 mRNA 之 相 對 含 量 變 化
將 300 µg/mL 石斛水萃取物加入於 10 cm dish 中，於 37 ℃、5
﹪CO2的培養箱進行培養。經過 3、6、12 和 24 小時後，抽取細胞中 的 total RNA，利用 RT-PCR 分析乳癌細胞其 Chk1 mRNA 之相對含量 變化。由圖 4.14 可觀察到投予石斛水萃取物（ 300 µg/mL）經過 12、
24、36 和 48 小時後，乳癌細胞 Chk1 mRNA 之相對含量與控制組（將 3 小時控制組設定為 1）比較，其值分別為 0.34、0.84、0.75 和 0.81。
五 、 p21 mRNA 之 相 對 含 量 變 化
將 300 µg/mL 石斛水萃取物加入於 10 cm dish 中，於 37 ℃、5
﹪CO2的培養箱進行培養。經過 3、6、12 和 24 小時後，抽取細胞中 的 total RNA，利用 RT-PCR 分析乳癌細胞其 p21 mRNA 之相對含量
變化。由圖 4.15 可觀察到投予石斛水萃取物（ 300 µg/mL）經過 12、
24、36 和 48 小時後，乳癌細胞 p21 mRNA 之相對含量與控制組（將 3 小時控制組設定為 1）比較，其值分別為 1.25、1.29、0.95 和 0.78。
六 、 Caspase-3 mRNA 之 相 對 含 量 變 化
將 300 µg/mL 石斛水萃取物加入於 10 cm dish 中，於 37 ℃、5
﹪CO2的培養箱進行培養。經過 3、6、12 和 24 小時後，抽取細胞中 的 total RNA，利用 RT-PCR 分析乳癌細胞其 Caspase-3 mRNA 之相對 含量變化。由圖 4.16 可觀察到投予石斛水萃取物（300 µg/mL）經過 12、24、36 和 48 小時後，乳癌細胞 Caspase-3 mRNA 之相對含量與 控制組（將 3 小時控制組設定為 1）比較，其值分別為 1.23、1.27、
1.24 和 1.30。
七 、 caspase-8 mRNA 之 相 對 含 量 變 化
將 300 µg/mL 石斛水萃取物加入於 10 cm dish 中，於 37 ℃、5
﹪CO2的培養箱進行培養。經過 3、6、12 和 24 小時後，抽取細胞中 的 total RNA，利用 RT-PCR 分析乳癌細胞其 Caspase-8 mRNA 之相對 含量變化。由圖 4.17 可觀察到投予石斛水萃取物（300 µg/mL）經過 12、24、36 和 48 小時後，乳癌細胞 Caspase-8 mRNA 之相對含量與 控制組（將 3 小時控制組設定為 1）比較，其值分別為 1.26、1.13、
0.95 和 1.58。
八 、 Caspase-9 mRNA 之 相 對 含 量 變 化
將 300 µg/mL 石斛水萃取物加入於 10 cm dish 中，於 37 ℃、5
﹪CO2的培養箱進行培養。經過 3、6、12 和 24 小時後，抽取細胞中 的 total RNA，利用 RT-PCR 分析乳癌細胞其 Caspase-9 之相對含量變 化。由圖 4.18 可觀察到投予石斛水萃取物（300 µg/mL）經過 12、24、
36 和 48 小時後，乳癌細胞 Caspase-9 之相對含量與控制組（將 3 小 時控制組設定為 1）比較，其值分別為 0.86、1.40、1.63 和 2.25。
第 八 節 西 方 點 墨 法 探 討 探 討 細 胞 週 期 相 關 蛋 白 質 的 表 現 將 0、18.75、37.5、75、150 及 300 µg/mL 石斛水萃取物加入於 10 cm 平盤中，於 37 ℃、5﹪CO2的培養箱進行培養。經過 24 和 36 小時後以西方墨點法分析，石斛水萃取物對人類乳癌細胞株細胞內與 細胞週期相關蛋白質的影響。
一 、 細 胞 週 期 中 調 控 G2/M 期 相 關 蛋 白 質 的 表 現
經不同濃度之石斛水萃取物處理 24 小時後分析 cyclin B1 蛋白 質的表現量與控制組比較，其蛋白質的表現量明顯上升（如圖 4.19）。
Cdk1，經不同濃度之石斛水萃取物處理 24 小時後，與控制組比較其 蛋白質的表現量明顯上升（如圖 4.20）。另外經不同濃度之石斛水萃 取物處理 24 小時後，Cdc25c 與控制組比較其蛋白質的表現量無明顯 變化（如圖 4.21）；Wee 1 在石斛水萃取物（150 及 300 µg/mL）劑量 時與控制組比較其表現量顯著上升（如圖 4.22）。
二 、 cyclin-dependent kinase inhibitor（ CDKI） 蛋 白 質 的 表 現 經不同濃度之石斛水萃取物處理 24 小時後分析 p21 蛋白質的表 現，與控制組比較其表現量明顯上升（如圖 4.23）。
三 、 Bcl-2 和 Bax 蛋 白 質 的 表 現
經不同濃度之石斛水萃取物處理 24 小時後，antipoptosis protein：Bcl-2 蛋白質的表現明顯降低（如圖 4.24），36 小時後 Bcl-2 表現量也呈現降低的情形（如圖 4.26）。經不同濃度之石斛水萃取物 處理 24、36 小時後， proapoptotic protein：Bax 蛋白質的表現量則明 顯上升（如圖 4.25、4.27）。
四 、 Caspase 3 和 Caspase 9 蛋 白 質 的 表 現
經不同濃度之石斛水萃取物處理 36 小時後，分析 caspase-3 及 caspase-9 蛋白質的表現量，在 75-300 µg/mL 濃度時與控制組比較，
其活化型之蛋白質表現量明顯上升（如圖 4.28、4.29）。
第五章 討論
由於西藥（抗癌藥物）引起副作用的報告不斷，研究人員漸漸把 注意力轉移到中草藥。例如 :苦艾，華盛頓大學的生物工程研究員 Henry Lai 的報告顯示，此複合物可以在十六個小時內消滅了試管內 所有與其接觸的人體癌細胞（85）。此外，西元 1994 年，FDA 通過 的紫杉醇用於轉移性乳癌的第二線化學治療或在輔助性化學治療完 後六個月內復發的乳癌患者也非常有效（86）。因此中草藥對於預防 或治療癌症之潛力，成為治療癌症之保健食品或新藥開發之研究重 點。而抗癌藥物誘發細胞週期的停滯和細胞凋亡的作用是很重要的測 定抗癌藥物的治療效果。所以本研究選用中草藥－石斛，分析是否可 誘發人類乳癌細胞（ MDA-MB-231）之細胞週期的停滯和細胞凋亡的 作用
石斛，有文獻指出石斛具有抗癌的活性，如 HL-60 細胞株、小 鼠肝癌、腫瘤細胞株 K562 等（19-23）。但是石斛對於人類乳癌細胞
（MDA-MB-231）是否能有效抑制依然沒有足夠的資料。
因此本研究中將藉由石斛來探討是否其可抑制細胞增生、是否能 干擾細胞週期的運轉及誘發細胞凋亡。在 2001 年，張潔等人在探討 銅皮石斛水提液的抗癌活性及其誘導急性白血病細胞凋亡的發生機
制中，使用的劑量為 0.39、1.56、3.13 和 6.25 mg/mL。使用 0.39、1.56、
3.13 mg/mL 進行流式細胞儀的分析，而 6.25 mg/mL 進行 DNA fragmentation 及西方點墨分析，結果發現銅皮石斛水提液的抗癌活性 及其誘導急性白血病細胞凋亡。而本研究所使用的劑量為 18.75、
37.5、75、150 及 300 µg/mL，皆比上述所使用的劑量還低，尤其是 使用 300 µg/mL 劑量時呈現顯著的 G2/M arrest 和細胞凋亡。不過由於 所購買的中藥材沒有經過基原鑑定，只能從中藥行的老闆告知其為二 級品的霍山石斛。因此本研究使用的石斛需要再經過基原鑑定。
檢測石斛水提取物對人類乳癌細胞株（MDA-MB-231）細胞 增生的影響，圖 4.2 (a)為加藥後第 24 小時細胞增生的變化情形，由 圖中可發現石斛水萃取物對於人類乳癌細胞的增生之影響為隨著石 斛濃度的增加（150-300
µ
g/mL），其抑制乳癌細胞增生的作用越顯 著。圖 4.2 (b)為加藥後第 48 小時細胞增生的變化情形，同樣地也發 現了隨著濃度（150-300µ
g/mL）及時間的增加此抑制作用越顯著。利用倒立式位像差顯微鏡觀察細胞型態，發現投予石斛水萃取物（300
µ
g/ml）對人類乳癌細胞在 24 小時即有明顯改變。隨著時間的增加，其細胞數目明顯減少，也有受損、破裂及空泡化現象，如圖 4.3。
檢測石斛對人類乳癌細胞株（MDA-MB-231）細胞週期的影 響，圖 4.4-4.7 為投予不同濃度的石斛水萃取物（0-300
µ
g/mL）於第24、48 小時之乳癌細胞週期變化的情形，結果發現隨著石斛水萃取 物濃度的增加，尤其是濃度為 150
µ
g/mL 及 300µ
g/mL 發生顯著 G2/M phase arrest 和 apoptosis。另外投予 300µ
g/mL 石斛水萃取物於第 12、24、36 和 48 小時之乳癌細胞週期變化的情形，圖 4.8 結果發現於第 12 和 24 小時開始發生顯著的 G2/M phase arrest，第 36 和 48 小時 G2/M 所佔細胞週期的百分比逐漸降低，但產生顯著的細胞凋亡的現象（ 36 小時）。
接著進行檢測石斛水萃取物對人類乳癌細胞是否產生細胞凋亡 的情形，由細胞週期的分析可以發現投予 300
µ
g/mL 石斛水萃取物於 36 小時產生細胞凋亡的現象，所以進一步地利用 DNA 電泳檢測 36 小時細胞凋亡的情形，結果也發現顯著 DNA 裂解成梯度片段的產生。經由流式細胞儀分析細胞週期的分佈情形，發現明顯的 G2/M phase arrest；所以進一步利用反轉錄聚合酵素連鎖反應檢測投予 300
µ
g/mL 石斛水萃取物至人類乳癌細胞，經過 3、6、12 和 24 小時，乳 癌細胞之 G2/M 期相關 cyclin 、CDK 及 apoptosis 基因的表現。Cyclin B1 mRNA 之相對含量在 12 小時是相較於控制組為低，然在 24 小時 相較於控制組為高（圖 4.11）。Cdk1 mRNA 之相對含量於 6 和 24 小 時相較於控制組為高（圖 4.12）。Wee 1 mRNA 之相對含量於 3 和 6 小時增加，至 12 小時顯著降低（圖 4.13）。Chk1 mRNA 之相對含量在 3 和 6 小時是相較於控制組為低，然在 12 和 24 小時相較於控制組 為高（圖 4.14）。p21 mRNA 之相對含量在 3 和 24 小時是相較於控制 組為高（圖 4.15）。Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 mRNA 之相對 含量在 24 小時相較於控制組為高（圖 4.16-18）。
第五章 討論
由於西藥（抗癌藥物）引起副作用的報告不斷，研究人員漸漸把 注意力轉移到中草藥。例如 :苦艾，華盛頓大學的生物工程研究員 Henry Lai 的報告顯示，此複合物可以在十六個小時內消滅了試管內 所有與其接觸的人體癌細胞（85）。此外，西元 1994 年，FDA 通過 的紫杉醇用於轉移性乳癌的第二線化學治療或在輔助性化學治療完 後六個月內復發的乳癌患者也非常有效（86）。因此中草藥對於預防 或治療癌症之潛力，成為治療癌症之保健食品或新藥開發之研究重 點。而抗癌藥物誘發細胞週期的停滯和細胞凋亡的作用是很重要的測 定抗癌藥物的治療效果。所以本研究選用中草藥－石斛，分析是否可 誘發人類乳癌細胞（ MDA-MB-231）之細胞週期的停滯和細胞凋亡的 作用。
石斛，有文獻指出石斛具有抗癌的活性，如 HL-60 細胞株、小
石斛，有文獻指出石斛具有抗癌的活性，如 HL-60 細胞株、小