實驗方法

實驗一、評估Chlorogenic acid 的抗氧化能力及清除自由基能力

（一） 清除 DDPH 自由基能力試驗 (A) 原理:

油脂在自氧化過程中，會產生自由基，接著發生連鎖反 應產生氫過氧化物或氫過氧化自由基，當兩個自由基相互結合 時，連鎖反應即終止(Thamas, 1995)，常見的抗氧化物是藉由 提供一個氫原子，來清除脂質過氧化自由基，進而抑制氧化連 鎖反應的進行。在抗氧化的研究上，通常使用DPPH（1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl）來評估抗氧化劑的供氫能力，DPPH 因其結構上可以產生穩定的共振結構，且其於517nm 波長下 有特定之吸光值。當DPPH與氧化劑作用時其吸光值也會隨 之降低(Willians et al, 1995)。利用此原理可測定出特定物質 清除自由基之效力。

DPPH˙ + A H (抗氧化劑) DPPH-H + A˙

(violet) (decolorized) (B) 步驟:

DPPH的甲醇溶液會隨著pH的不同及時間的長短而有所 變化，其在pH=5.0-6.5比較穩定，此外會隨著時間的增常而

劣化，故實驗時需新鮮配製(Blosi, 1958)。將CA溶於甲醇 中，與 DPPH (0.2 mM)等體積混合，反應 30分鐘後，以 Spectrophotometer在波長517測吸光值。整個實驗均需避光 進行，吸光值越低表示清除DPPH自由基的能力越強，以未 添加CA的吸光值定為捕捉DPPH百分率0 %來與其它濃度做 比較。( Blois, 1958 )

(C) 計算公式如下：

% 清除率 ＝ ( A0－ A ) / A0 × 100 ％ A0：不添加CA之吸光值（DPPH only）

A：加入不同濃度CA後之吸光值（CA＋DPPH）

（二） 抑制 LDL 氧化能力 ( IC50 ) 1. 分離 LDL

健康及飲食正常之成年人經隔夜禁食後，由真空採血管抽取血液 (約 30 mL )，將取出的血液於 37 ℃水浴中靜置 1.5 小時，再於 4 ℃冰 箱中靜置 1 小時；而後在 4 ℃的環境下進行低速離心（3000 rpm

“1200× g”，15 分鐘），以取得上層血清之部份。取 12 mL ( 2 ml ×6 ) 血清置入超高速離心管中( 3 PC 管)，於每管中加入 0.7 ml 0.9 % NaCl

境下進行超高速離心（100,000 rpm、10 ℃、3.5hr、Acc.5、Dec.7）。

3. 抑制 LDL 氧化能力

各加入 10.15.20.25.30 μl 的 2×10^-5 M CA，用鋁箔紙包住，於 37℃

120 rpm 水平震盪 1 小時（使 probucol 及 CA 插入 LDL 中），

再加入 PBS 及 CuSO4，37℃ 120 rpm 水平震盪 2 小時（使 Cu²⁺作用），各加入150 μl 2 mM EDTA（終止反應），Mix 後各 取 100 μl 於 eppendorf ( 標示 Blank, 1, 2, 3…. )，各加入 900 μl isopropanol 混合均勻（沈澱蛋白質），於 12000 rpm 離心 10 min，取上清液於 cavette 中，波長 232-234nm 測吸光值。

(C). 計算公式:

△ACu²⁺＝〔Cu²⁺〕-control △Acap＝〔Acap〕-control

抑制氧化％＝(△ACu²⁺－△Acap)/ △ACu²⁺ × 100%

（三）. Conjugate diene (CD)

脂質過氧化之重要特徵為其氧化產物共軛雙烯（Conjugate Diene）

之生成量會隨氧化時間增長而增加。利用共軛雙烯可在230~235nm 吸 光值下被偵測之原理，將不同濃度的CA溶於PBS中再以銅離子( 5mM ) 於37 ℃誘導LDL 960min，反應開始起每15 min 測量一次吸光值，以 Conjugate Diene 生成量（吸光值）為縱座標，氧化時間為橫座標做圖。

實驗二、CA 的細胞毒性

（一） 萃取臍帶內皮細胞（HUVEC）

將2 ml Gelatin 黏附在 flask 上，置於培養箱中約 1 小時，倒 500 ml cord buffer 於 1000 ml 燒杯中，再加入 5 ml 抗生素，臍帶放入含 cord buffer 的燒杯中泡一下，再取出臍帶以紗布擦拭，並找到靜脈腔，將 三向活塞一端插入靜脈端，並以束縛繩固定住，針筒抽cord buffer，

排出空氣再套在三向活塞的另一端，推動針筒洗臍靜脈 1-2 次，將臍

帶靜脈內的 cord buffer 排乾淨後，以束縛繩夾住另一端封住臍帶兩 端，以針筒取約20 ml collagenase 套在三向活塞上，打入其靜脈至 8-9

分滿左右，轉動活塞避免流出，即可抽出針筒，反應約 8 分鐘（要一

邊按摩臍帶），取 30 ml HBSS 於 50 ml 離心管中，針筒接到三向活塞 上，轉動活塞，將臍帶內的 collagenase 反推回針筒中，將針筒內收集 的置入 50 ml 離心管中，將 HBSS 打入臍帶內(wash)，鎖住活塞按摩 一下後推回針筒內，置入含collagenase 的離心瓶中，再離心 1200 rpm 10 min 倒掉上清液剩下約 3-5 ml，加入於培養箱中的 flask 中，HUVEC 10 ml 搖晃均勻，隔天再換新鮮 Medium，培養至固定代數進行( Marin et al., 2001)。

（二） 培養臍帶內皮細胞（HUVEC）

HUVEC 以 37 ℃, 5 % CO2 培養於 M-199 培養基中，培養基包括 10 % FBS, 1 % Penicillin/ Streptomycin（P/S）, heparin, endothelial cell growth supplement（ECG）, L-Glutamine。每兩天換一次 Medium，長 滿後將之分盤繼代培養在新的 T-75 flask 中，取 2-5 代的 HUVEC 進行 各項實驗 ( Marin et al., 2001; Bachetti and Morbidelli,2000 )。

（三） MTT test (A). 原理:

MTT 全名（3-〔4, 5-Dimethylthialzol-2-yl〕-2, 5- diphenyl tetrazolium bromide），為一黃色的 chemical reagent, 可被活細 胞細胞吸收，其 tetrazolium 在粒腺體（mitochondria）內被 酵素 succinate dehydrogenase 還原成藍紫色 formazan，此物在 590 nm 下具最大吸收波峰，可藉由 OD 570 的大小，得知活細 胞數目，常常用於檢測樣品對細胞毒性及存活測試上 ( Denizot And Lang, 1986 )。

(B). 步驟:

將 HUVEC 分盤於 96 well plate 中( 2×10⁴ /well ) 10 % FBS- medium 100 μl 培養約 24 小時後，以 HBSS wash 後以含 1 % FBS

之 medium 進行同步化 24 小時，wash 後再加入不同濃度含 CA 之 medium 培養 24 小時，加入 10 μl /well MTT 反應 4 小時，再 加入 100 μl/ well SDS-HCl over night 將細胞打破使色素溶出，隔 天以 OD 590 測吸光值。

實驗三、Ox-LDL 誘發 HUVEC 表現 IL-1β

（一）、Ox-LDL 的製備 1.Ox-LDL 促氧化

先定量LDL protein（0.9 mg/ ml）加 0.1 ml CuSO4 100 μM (最終 濃度為10 μM)，37℃下避光水平震盪 24 hr。

2.透析

將LDL 放入透析膜內，以透析夾固定後，放入血清瓶中，將瓶 子裝滿透析液，透析液的成分即含0.3 mM EDTA的PBS，於4 ℃環境 下避光攪動，先透析2小時後更換新的緩衝液，再於5及8小時後更換 一次，再進行透析over night，而後取出的LDL過濾（0.22 μM）再充 氮氣後於4 ℃下避光保存備用。

3.測 TBAR

Malondialdehyde ( MDA ) ，一分子的MDA與二分子thiobarbituric acid ( TBA )會生紅色聚合物TBARS ( thiobarbituric acid reactive substance )，此物質於OD 532 nm具最大吸收波長，而加入TCA可使蛋 白質沉澱，以不同濃度的MDA為標準液與TBA反應做檢量線而可定量 LDL氧化程度，單位為n mol/ ml，值越高表示脂質氧化程度越高。

4.氧化低密度脂蛋白蛋白質濃度之定量

取10 μL 之Ox-LDL，加入790 μL DDW及200μL Bio-Rad Dye Reagent (稀釋100倍)，在室溫下放5分鐘後，於OD 595 nm下測吸值，

所得吸光值越高則表示Ox-LDL 中所含的蛋白質量越高。所測出的吸 光值與小牛血清白蛋白（Bovine serum albumin, BSA）之標準曲線做 對照，便可求出Ox-LDL 中所含蛋白質含量。

（二）、Ox-LDL影響IL-1β m-RNA的表現 1. 細胞加藥處理

將細胞培養在10 cm²-dish中，細胞數約1×10⁶，以含10 % FBS之 medium培養24小時後，再以1 % FBS之medium同步化24小時後，控制 組不加OX-LDL，而另一組則加入100 μg/ ml OX-LDL於medium中，反 應24小時後以Trypsin-EDTA收細胞。離心後到掉上清液，其沈澱物即 為細胞。

2.Totol RNA的萃取

取沉澱後之細胞加入1 ml Trizol reagent，混勻後至於冰上5分鐘，

各管再加入200 μl CHCl3，震盪混合15秒後靜至於冰上15分鐘，接著 離心（12000xg, 15min, 4℃），吸取上清液600μl至新的1.5ml微量離心 管中，加入500 μl isopropanol上下混合均勻，在靜置於冰上10分鐘，

接著離心（12000xg, 10min, 4℃）。去除上清液，留下底下白色沈澱 物，加入1 ml 70% alcohol使RNA更純淨，接著離心（7500 xg, 5 min, 4℃）。去除酒精再加入適量( 20-50μl ) DEPC-treated H2O，將RNA 沈澱物溶解並保存於-80℃。

3.RNA定量

先將分光光度計暖機至少10分鐘以穩定光源，利用OD 260/OD 280nm波長之紫外光測量RNA的純度，利用OD 230及OD 270測有機 溶劑的殘留。先取石英管注入1000μl DEPC-treated H2O作為blank，接 著取1 μl Total RNA與999 μl DEPC-treated H2O混合均勻後，

Spectrophoto- meter測量。

計算Total RNA=OD 260 ×40 ×1000 ( μg/ml ) 4.反轉錄反應（Reverse transcription）

取固定量的RNA（4μg）來進行單管的RT反應。在200 μl PCR微

量離心管中加入下列試劑：

Volume per reaction 5x iScript Reaction Mix 4 μl

iScript Reverse Transcriptase 1 μl

Nuclease-free water 15-X μl

RNA template X μl

Total Volume 20μl

混合完全後置入PCR machine，進行反轉錄反應。

5.同步定量聚合脢鍊反應（Real-Time Polymerase chain reaction）

(A) 原理:

引子的設計是聚合酶連鎖反應成功與否的關鍵因素，包括了前置 引子( forward primer )和反置引子( reverse primer )，可分別 DNA 的 雙股配對結合，作為合成新股的起點。成功引子的要點有：

(a) 長度為 18-25 個鹼基，兩個引子的長度差距不可多於 3 個鹼基。

(b) 任一引子的組成不能含有會在引子內部產生互補現象的 3 個以 上連續鹼基，否則會在引子內部產生二級結構，影響引子和 DNA 模板的黏合效率。

(c) 四種鹼基要平均分佈，(G+C)/ (A+T)的比值大約是 0.4-0.6。

(d) 引子之間的鹼基序列也不能有互補的情形，否則會彼此黏合生 成引子二聚物( Primer Dimer )，減低引子和 DNA 模板的黏合效 率。

(e) 兩條引子之間的解鏈溫度( Melting Temperature )不可相差 5^。C 以上，解鏈溫度指的是雙股 DNA 有半數達成變性而分開成單 股 DNA 時的溫度。

(3) DNA 的合成酵素( Taq Polymerase )：

是從嗜熱性細菌所分離出來的酵素，目前最常用的 DNA 聚合酶是由學名為 Thermus aquaticus 細菌所分離出來的，因此 名為 Taq，可以將四種核甘酸催化聚合成一股新的互補 DNA 鏈。

(4) 合成的主要原料：

包括了 dATP、dTTP、dCTP、dGTP 等四種三磷酸去氧核甘酸 ( dNTPs，Deoxynucleoside Triphosphates )，還有提供合成酵素作用 活性的氯化鎂( MgCl2 )緩衝液( Buffer )，鎂離子是聚合酶活性的要 素，而且不同的PCR 需要不同的鎂離子濃度。

(C). 步驟:

取200 μl Optical grade PCR微量離心管，依序加入以下試劑：

2x SYBR green Ιmaster mix, forward primer ( 500 nM ), reverse primer ( 500 nM ), RT product 與DDW使總體積為25 μl，混合完全後置入 PCR machine中。

(1) 變性( Denaturation )：通常使用 92℃-95℃之間的高溫，使雙股 DNA 變性而分開成單股的 DNA，作為往後複製的模板。

(2) 結合( Annealing )：通常在 40℃- 60℃之間，使引子( Primer )附 著於單股的 DNA 模板上做配對結合。

(3) 延長( Elongation )：使用變性而來的單股 DNA 作為模板 ( Template )，以引子( Primer )為起點，在 DNA 的合成酵素( Taq Polymerase )的催化及適當溫度的作用下，將四種核甘酸催化聚 合成一股與模板互補的 DNA 新鏈。

實驗四、偵測細胞內自由基的形成 1.Time course

將細胞分盤至6 well plate細胞培養盤中，細胞數約為2×10⁵，以含 10 % FBS之medium培養24小時後，再以1% FBS之medium同步化24小 時後，接著以IL-1β 刺激2, 4,6小時後，以Trypsin-EDTA收細胞，離心 1200 rpm, 10分鐘後去除上清液，以PBS重新混懸細胞，再以1200 rpm 離心 10分鐘後去除上清液，最後加入含有螢光染劑的PBS，以流式細 胞儀觀察結果。

2.評估CA與probucol對IL-1β誘導ROS產生的影響

將細胞分盤至6 well plate細胞培養盤中，細胞數約為2×10⁵，以含 10 % FBS之medium培養24小時後，再以1% FBS之medium同步化24小 時後，再以含25 μM, 50 μM之CA或probucol的medium加入細胞反應18 小時後，接著以IL-1β刺激6小時後，以Trypsin-EDTA收細胞，離心1200 rpm, 10分鐘後去除上清液，以PBS重新混懸細胞，再以1200 rpm離心 10分鐘後去除上清液，最後加入含有螢光染劑的PBS，以流式細胞儀 觀察結果。

實驗五、評估CA與probucol對IL-1β誘導黏附因子：VCAM-1, ICAM-1, E-selectin產生的影響

1. 細胞加藥處理

將細胞培養在10 cm²-dish中，細胞數約1×10⁶，以含10 % FBS之 medium培養24小時後，再以1 % FBS之medium同步化24小時後，再以 含25 μM, 50 μM之CA或probucol的medium加入細胞反應18小時後，接 著以IL-1β刺激6小時後，以Trypsin-EDTA收細胞，離心1200 rpm, 10 分鐘後去除上清液。

2. Totol RNA的萃取

加入1 ml Trizol reagent，混勻後至於冰上5分鐘，各管再加入200μl

加入1 ml Trizol reagent，混勻後至於冰上5分鐘，各管再加入200μl