綠原酸抑制 IL-1β 所誘導之黏附因子的表現及

一. 綠原酸抑制 IL-1β 所誘導之單核球的黏附作用

在動脈粥狀硬化的研究模式中，常利用人類單核球細胞株U-937，

來觀察單核球與內皮細胞間的交互作用。根據研究顯示，血管內皮細胞 不 僅 是 一 個 具 半 透 性 的 膜 ， 它 更 是 一 個 非 常 活 潑 的 分 泌 組 織 細 胞 (Imagami et al., 1995)。內皮細胞功能不良是心血管疾病的一個明顯指標 (Anderson et al., 1995)，與動脈粥狀硬化的發展息息相關(Hashimoto et al., 1999)。而此次單核球黏附試驗結果顯示，綠原酸在濃度25 μM及50 μM 可減少由IL-1β所誘導之單核球黏附情形。之前的研究中顯示，Vit E在濃 度40 μM時，可以明顯抑制單核球黏附於內皮細胞上(Meydani et al., 1999)；綠茶的兒茶酚在濃度100 μM時，也可以抑制單核球黏附於內皮 細胞(Stangl et al., 2004)；而50 μM的類黃酮luteolin和apigenin也幾乎可完 全的抑制經由TNF-α所誘導之單核球的黏附(Choi et al., 2004)。

二.黏附因子的特性

單核球與血管內皮細胞間的交互作用主要是透過黏附因子， 包括 VCAM-1 (Cybulsky and Gimbrone, 1991)、ICAM-1 (Poston et al., 1992) 和E- selectin (Richardson et al., 1994)與血管內皮表面之間的作用而形

成。促發炎反應的細胞激素可誘導細胞黏附因子的表現，進而引發發炎 反應(Ross, 1999)。在動脈粥狀硬化的研究模式，血管的細胞黏附因子 (VCAM-1) 也會結合到單核球或淋巴球細胞而導致在血管發炎區堆積 (Osborn et al., 1989; Elices et al., 1990; Cybulsky and Gimbrone, 1991)。

VCAM-1及ICAM-1的表現會受到細胞激素如IL-1β 或TNF-α 所誘發，

E-selectin可在IL-1β 和TNF-α 刺激下合成(Bevilacqua et al., 1995)。而單 核球及淋巴球明顯出現在動脈硬化早期脂肪條區域，也顯示了黏附因子 表現在動脈粥狀硬化發展上的重要性(Cimbrone er al., 1990)。

三.單核球黏附在不同階段黏附因子的作用（參照圖V.）

1. 單核球的滾動（Monocytes Rolling on Endothelial Cells）

單核球與血管內皮細胞的交互作用中首先是單核球的滾動 （rolling）。不論血管內皮細胞或是白血球有無受到刺激，都會 由表面原本就存在（constitutive existence），黏著力不高的分子 selectins，讓靠近血管壁的白血球和血管內皮細胞產生微弱的箝 合（tethering）。舉例來說，若內皮細胞受到促發炎反應物質 （pro-inflammatory cytokines），如IL-1（interleukin-1）、TNF-α（tumor necrosis factor-α）和氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）刺激，會快速（3-5 分鐘）暴露出原本內化（internalization）於Weible- Palade bodies 的

P-selectin這種黏著分子，而它會跟單核球（monocyte）、淋巴球 （lymphocyte）或嗜中性白血球（neutrophil）上的配合基（P-selectin glycoprotein ligand-1, PSGL-1）結合(Liao et al., 1997; Giuffre et al., 1997)；同樣的，原本就存在於白血球表面上的黏著分子E-selectin 及 L-selectin，也會被這些促發炎反應物質活化而切除（shedding），

使白血球於內皮細胞表面產生滾動（Tedder et al, 1995）。這種黏著 反應會促使單核球的趨化因子（monocyte chemoattractant protein, MCP-1）增加，並向上調節（up-regulation）另一種黏著力更強的分 子integrin表現。

而在本實驗中在加入了25 μM或50 μM之綠原酸或probucol，皆 可以降低IL-1β所誘發之E-selectin 表現，並且綠原酸及probucol 之抑 制效果皆呈劑量相關性。

2.單核球與血管內皮細胞緊密結合（Arrest and Firm Adhesion）

Integrin 是由兩個次單元組合而成的，包括α 及β 次單元（α and β subunits ），在不同細胞上的種類也各有不同，如白血球表面的 LFA-1（lymphocyte functional-associated antigen-1）在接受刺激後，

會由不活化態轉成活化態，並使白血球內的一種物質diacylglycerol （DAG）增加，進而活化蛋白酵素C（protein kinase C, PKC），使

細胞內鈣離子濃度上升，產生細胞骨骼（cytoskeletal）上的改變，

然後鑽入因發炎反應而通透性（permeability）變大的血管內皮細胞 間隙中(Mine et al, 2002)。而另一種白血球黏著分子Mac-1則是從 細胞內被快速表現出來，進而使白血球與血管內皮細胞的ICAM-1，-2 （intercellular adhesion molecule-1, -2）緊密結合，然後停止住（adhesion /arrest）。根據學者研究發現，這些黏附因子都和β²-integrin 相關 (Luscinskas et al, 1994; Lehr et al, 1995; Ragab et al, 1996; Kita et al, 1999)。另外嗜伊紅性球（eosinophil）或淋巴球上的VLA-4（very late antigen-4）則會和內皮細胞上的VCAM-1（vascular adhesion molecule- 1）結合。這些白血球與內皮細胞的黏著分子交互作用便是動脈粥狀 硬化的驅動源頭。

本實驗亦探討綠原酸對內皮細胞所表現之VCAM-1及ICAM-1兩 種黏附因子的作用，結果發現無論加入了25 μM或50 μM之綠原酸或 probucol，皆可以降低IL-1β 所誘發之VCAM-1表現，並且綠原酸及 probucol 之抑制效果皆具有劑量相關性，同時，發現綠原酸之抑制效 果優於probucol。而由圖6-1之結果也發現，無論加入了25 μM或50 μM 之綠原酸或probucol，亦可以降低IL-1β所誘發之ICAM-1表現，並且綠 原酸及probucol 皆具有劑量相關性，亦發現綠原酸之抑制效果優於

probucol。

3.單核球變形鑽入血管內層（Monocyte Trans-endothelial Migration）

而最後則是白血球被活化後，經由變形鑽入血管內皮細胞間隙的 過程（ trans-endothelium migration via diapedesis through the junctions between endothelial cells），這是由單核球趨化因子（MCP-1）與氧化 低密度脂蛋白等趨化物吸引而成的，目的是誘導單核球變形鑽入血管 內膜層(Takei et al,2001)。

第六節、 綠原酸藉由抑制IL-1β 誘導 NF-κB 的活化來降低黏附因子的表 現

基因進行轉錄作用時主要仰賴 RNA polymerase 及許多轉錄因子

（transcription factors，TFs）的作用，轉錄因子主要可以分為兩種類型︰

（1）basal factors；在轉錄作用中負責promoter 的辨認與實際轉錄作用 的進行，如TFII-D；

（2）regulatory factors：在轉錄作用中扮演基因活性調控的主要因子，

如NF-kB。(Koleske et al. 1994)調節性轉錄因子 （regulatory transcription factors）與基因上游啟 動子（promoter）區域結合，調控該基因之轉 錄效能，為影響誘導性（inducible）基因，如 iNOS, CAM 之轉錄活性的主要因素。

一般狀況下，NF-κB 持續表現並存在於細胞質中，但由於IκB 與其 結合，使其NLS 區域覆蓋住，而NF-κB 無法進入細胞核中，失去了調 節基因表現的能力。因此，NF-κB之活化通常是當細胞受到外來刺激， 之 後引發 proteasome-mediated IκB degradation，而當IκB 降解後，NF-κB 露出的NLS 便會造成NF-κB 移入（translocation）細胞核中，執行其轉 錄因子的功能(Karin et al., 2000)。由於NF-κB 的活化必須自細胞質外移

入（translocation）細胞核中，再執行其調節作用，因此，NF-κB 移入 細胞核的能力，也是討論NF-κB 活性的重要指標。

可以活化NF-κB的訊號包括(1)細胞激素：如TNF-α 和IL-1β；(2) PKC ( protein kinase C )的活化：如phorbol ester和血小板活化因子；(3)氧化物 質：如過氧化氫和臭氧；(4) 病毒：如感冒病毒、腺病毒或E-B病毒；(5) 免疫刺激：如T-淋巴球的活化；(6)其他：如LPS或UV (Kopp and Ghosh, 1995; Siebenlist et al., 1994; Baeuerle and Baltimore, 1996)。轉錄因子 NF-κB/Rel家族調節許多基因的表現，並且在免疫、壓力反應、發炎及 細胞凋亡上扮演重要角色(Barnes and Karin, 1997; Baeuerle ana Henkel, 1994; Baeuerle and Baltimore, 1996; Baichwal and Baeuerle, 1997)。許多研 究 也 證 實 動 脈 粥 狀 硬 化 形 成 相 關 的 蛋 白 質 包 括: TNF-α, IL-1β, macrophage CSF, granulocyte CSF, granulocyte-macrophage CSF, MCP-1, tissue factor, VCAM-1, ICAM-1和E-sclectin也受到轉錄因子NF-κB的調 節。而且有些研究證實給予atherogenic dite或以Ox-LDL刺激下，也會造 成 轉 錄 因 子NF-κB 的 活 化 (Liao et al., 1993; Parhami et al., 1993;

Rajavashisth et al., 1995; Brand et al., 1997)。此外，在動脈粥狀硬化病灶 區發現一些細胞激素或生長因子，如TNF-α和 IL-1β也會活化巨噬細 胞、內皮細胞、平滑肌細胞和淋巴球中的NF-κB (Collins and Cybulsky,

2001)。

過去研究中指出 IL-1β 及 TNF-α 可以經由活性氧族群調控轉錄因子 NF-κB 的活性(Christman et al., 1998)，進而引發各種免疫反應及發炎反 應，並進而增加黏附因子（adhesion molecules）在細胞表面之分佈。所 以活性氧族群已被認為是一種二級訊息傳遞訊息以調節細胞生理功能 (Wang et al,1999; Lum and Roebuck, 2001; Schreck et al., 1991)。而處理抗 氧化劑，如 PDTC 和 NAC，可以抑制 NF-κB 的活化更證實了 ROS 對 於NF-κB 的活化的重要性(Schrect et al., 1992; Weber et al., 1994)。紫草 素衍生物具有之抗發炎能力認為與其抗氧化活性與 reactive oxygen species（ROS）scavenging activity (Kourounakis et al. 2002)有很大的關 係。而此抗發炎能力很可能是與調控NF-κB 活化的能力有關。而本實驗 由流式細胞儀結果證實綠原酸可抑制IL-1β 所誘發之細胞中 ROS，所以 我們推論具有抗氧化能力之綠原酸，藉由抑制氧化還原敏感型之轉錄因 數NF-κB 的活性，進而抑制下游黏附分子（adhesion molecules）的表現。

所以推論綠原酸可能具有保護心血管，及預防動脈粥狀硬化發生的作 用，與其抗氧化及抗發炎的特性有關。

而依照細胞種類、發育階段、環境因數等因素，細胞可能會表現出 其他型態的NF-κB DNA-binding subunits，NF-κB家族在哺乳類細胞可分

為p50/p105、p52/p100、p65 ( RelA )、Rel B及c-Rel 五種 ( Mattson and Culmsee, 2000)。NF-κB 會以p50 或p52 與p65 或Rel A/c-Rel 形成 heterodimers，或形成p50/p50、p52/p52、Rel A/Rel A 之homodimers，其 中p65/p50 是第一個被發現且含量最豐富，為大部分細胞主要存有的 NF-kB heterodimer，並與生物活性最有關係 (Baldwin, 1996；Barnes and Karin, 1997；Huxford et al., 1998)。而研究發現不同的NF-κB 組成與其 transactivation 能 力 有 關 ， 但 是 只 有 p65/p50 的 組 合 具 有 很 強 的 transactivational activity。而形成homodimer 之p50/p50 則可能是具有調 控transcriptional repression 的功能(Siebenlist et al., 1944; Karin et al., 2000)。

而在我們研究中發現綠原酸可以同時抑制p65、p50、p52、Rel B及 c-Rel 五種NF-κB family的活化，而p65/ p50的活化和調控VCAM-1, ICAM-1和E-sclectin基因表現有關，而c-Rel/p65的活化與調控ICAM-1基 因表現有關。而綠原酸抑制p52、Rel B的活化其作用未明，其主要影響 尚須進一步的研究。

第七節、 其它具有抗氧化、抑制黏附因子表現及單核球黏附之物質 一、維生素C

維生素C 會改善 endothelium-dependent vasodilation 並減少單核細 胞黏著 (monocyte adhesion) (Heitzer et al.,1996; Reilly et al., 1996; Ting et al., 1997)，推論與其所具有的抗氧化特性有關，一般而言，維生素C

富含於柑橘類水果、草莓、番茄、萵苣及綠葉蔬菜中。

二、維生素 E

維生素 E 可在細胞膜上預防多不飽和脂肪酸的過氧化，其在自然 界中之分類有α, β, γ, δ-tocopherol 等四種，其中最具生物活性者為α- tocopherol。在氧化型LDL 的預防上，維生素 E 的作用為嵌入脂蛋白及 細胞膜中，經此減少活性氧的含量以降低LDL 的氧化。 維生素 E 不 僅在實驗數據上甚至在臨床應用上皆被認為是LDL 的最有利的抗氧化 劑 (Jha et al., 1995; Odeh and cornish, 1995)。此外，維生素E 還具有抑 制血小板活化 (減低凝血作用)及抑制單核球黏著的作用。維生素 E 大 量存在於蔬菜油及種籽油中。

三、多酚類( Polyphenols )

目前對多酚類化合物抗氧化的報告多集中在可抑制LDL 的抗氧化 修飾方面，如紅酒中的resveratrol 與其它多酚類化合物在體外實驗中被

證實其抗氧化性 (Frankel et al., 1993; Kerry and Abbey, 1997)，而在體外 實驗中亦可增加血清中的總抗氧化力 (Maxwell et al., 1994)。此外細胞 實驗中發現，紅酒中的resveratrol 亦是藉由抑制LPS所誘發HUVEC之轉 錄因子NF-κB及AP-1的活化，來降低VCAM-1的表現和單核球的黏附 (Carluccio et al., 2003)。而橄欖油中的多酚類oleuropein 及hydroxytyrosol 同樣是藉由抑制LPS所誘發HUVEC之轉錄因子NF-κB及AP-1的活化，來

證實其抗氧化性 (Frankel et al., 1993; Kerry and Abbey, 1997)，而在體外 實驗中亦可增加血清中的總抗氧化力 (Maxwell et al., 1994)。此外細胞 實驗中發現，紅酒中的resveratrol 亦是藉由抑制LPS所誘發HUVEC之轉 錄因子NF-κB及AP-1的活化，來降低VCAM-1的表現和單核球的黏附 (Carluccio et al., 2003)。而橄欖油中的多酚類oleuropein 及hydroxytyrosol 同樣是藉由抑制LPS所誘發HUVEC之轉錄因子NF-κB及AP-1的活化，來