實驗一、評估Chlorogenic acid 的抗氧化能力及清除自由基能力
根據體外試驗結果發現，綠原酸清除 DPPH 自由基的 IC50 值約為 36.3 ±2.7μM，而正控制組 Probucol 之 IC50值約為41.8 ±3.1μM；在抑制 LDL 氧化能力方面，綠原酸之 IC50為3.1 ±0.4 μM，Probucol 之 IC50值為 5.5 ±0.7 μM，由此兩種抗氧化試驗結果可知，綠原酸具有捕捉 DPPH 自
由基及抑制 LDL 氧化的能力，且其抗氧化效果優於已知的脂溶性抗氧
化劑probucol。結果如圖 1-1, 1-2 所示，及表ㄧ所整理。
另ㄧ方面，我們探討綠原酸是否具有抑制氧化發生，以及延長氧化 遲滯期的作用，我們利用測量Conjugate diene (CD)的生成，結果發現當 加入了 25 μM 或 50 μM 的綠原酸後，可以明顯的較正常組有較低的 Conjugate diene 生成量，且具有較長的氧化遲滯期。結果如圖 1-3 所示。
實驗二、利用MTT 測試 CA 的細胞毒性
再進行各項細胞實驗前，先進行 MTT test 測量細胞存活率，可得
到綠原酸及Probucol 不會造成細胞毒性的濃度範圍。首先將人類臍靜脈 內皮細胞分盤於96 well plate 細胞培養盤中（2×104 cell/well），接著以含 1 % FBS 之 medium 同步化 24 小時，再分別加入不同濃度之綠原酸或
probucol ( 0-300 μM )培養 24 小時，結果如圖 2-1, 2-2 所示。結果顯示無 論是綠原酸或者是 probucol，在濃度 200 μM 以下時皆不具有細胞毒性 (細胞存活率＞90%)，而在參考其他文獻之後，本實驗選定 25 μM 及 50 μM 兩個濃度去進行以下的實驗。
實驗三、以同步定量聚合脢鏈反應探討Ox-LDL 是否誘發 HUVEC 表 現 IL-1β
首先先分離出 LDL 再以 CuSO4促氧化，測量 Ox-LDL 之 TBAR，
其值約在25 μ mol/ml 左右，再進行透析後其 TBAR 值降至 7 μ mol/ml 左右。接著定量 Ox-LDL 之蛋白質濃度，再參考其他文獻之後，決定加 入細胞的最終濃度為 100 μg/ml。另一方面，將內皮細胞分盤於 6 well plate 中（2×105 cell/well），接著以含1 % FBS 之 medium 同步化 24 小時，
再加入Ox-LDL（100 μg/ml）反應 24 小時，以 Trypsin-EDTA 收集細胞，
再利用Trizol reagent 萃取 RNA，再將所萃取之 RNA 定量及進行反轉錄 作用，之後以同步定量聚合脢鏈反應觀察IL-1β mRNA 的表現。結果發 現 Ox-LDL 與正常組相較下，其會誘導內皮細胞表現大量的 IL-1β，並 達到統計上的差異( p＜0.05)，如圖 3-1 所示。而在圖 3-2 中可觀察到 IL-1β
在同步定量聚合脢鏈反應中，螢光強度變化的情形，隨著反應之 cycle
數增加，其螢光強度逐漸超過閾值(Ct)，而利用 Ct 值來計算其相對表現 量。而圖3-3 中，利用測定所合成 PCR 產物之 melting temperature 來確 定其專一性，由結果可看出產物之 melting temperature 均落在同一溫度 上，即可確定其合成的產物具有專一性。
實驗四、利用流式細胞儀偵測IL-1β所誘發細胞內自由基的生成及綠 原酸之抑制作用
先將內皮細胞分盤於 6 well plate 中（2×105 cell/well），接著以含 1 % FBS 之 medium 同步化 24 小時，再分別以 IL-1β 刺激 2、4、6 小時，以 Trypsin- EDTA 收集細胞，離心去除上清液，再加入含有螢光染劑之 PBS 重新混懸細胞，避光作用 30 分鐘後，以流式細胞儀觀察細胞中的 ROS。
結果如圖 4-1 所示，發現以 IL-1β 刺激 6 小時後可明顯增加細胞中的 ROS，並達到統計上的差異( p＜0.05)，所以在接下來的實驗中，IL-1β 刺激的時間點定為6 小時。
另一方面，將內皮細胞分盤於 6 well plate 中（2×105 cell/well），接 著以含1% FBS 之 medium 同步化 24 小時，再分別加入 25 μM 或 50 μM 之綠原酸或probucol 預培養 18 小時，並以 IL-1β 刺激 6 小時，以 Trypsin- EDTA 收集細胞，離心去除上清液，再加入含有螢光染劑之 PBS 重新混
所誘發之細胞自由基。結果如圖 4-2 所示，發現不論是加入 25 μM 或 50 μM 之綠原酸或 probucol，皆可以降低 IL-1β 所誘發之細胞自由基，其可
將細胞中 ROS 降至與正常組相似的範圍，亦再次證實綠原酸具有抗氧
化的作用。
實驗五、評估CA與probucol對IL-1β誘導黏附因子：VCAM-1, ICAM-1, E-selectin產生的影響
將內皮細胞分盤於6 well plate中（2×105 cell/well），接著以含1 % FBS 之medium同步化24小時，再分別加入25 μM或50 μM之綠原酸或probucol 預培養18小時，並以IL-1β刺激6小時，以Trypsin- EDTA收集細胞，離心 去除上清液，再利用Trizol reagent萃取RNA，再將所萃取之RNA定量及 進行反轉錄作用，之後以同步定量聚合脢鏈反應觀察VCAM-1, ICAM-1, E-selectin mRNA的表現。結果發現加入IL-1β與正常組相較下，其會誘 導內皮細胞表現大量的VCAM-1, ICAM-1, E-selectin，並達到統計上的差 異( p＜0.05 )，如圖5-1, 6-1, 7-1所示。
由 圖 5-1 之 結 果 發 現 ， 無 論 加 入 了 25 μM 及 50 μM 之 綠 原 酸 或 probucol，皆可以降低 IL-1β所誘發之 VCAM-1表現，並且綠原酸及 probucol之抑制效果隨劑量增加而增強，同時發現綠原酸之抑制效果優
於probucol。而由圖6-1之結果也發現，無論加入了25 μM及50 μM之綠原 酸或probucol，亦可以降低IL-1β所誘發之ICAM-1表現，並且綠原酸及 probucol之抑制效果隨劑量增加而增強，亦發現綠原酸之抑制效果優於 probucol。而圖7-1之結果中，無論加入了25 μM及50 μM之綠原酸或 probucol，皆可以降低IL-1β所誘發之E-selectin表現，並且綠原酸及 probucol之抑制效果皆呈劑量相關性。
而在圖5-2, 6-2, 7-2中分別可觀察到VCAM-1, ICAM-1, E-selectin在 同步定量聚合脢鏈反應中，螢光強度變化的情形，隨著反應之cycle數增 加，其螢光強度逐漸超過閾值(Ct)，而利用Ct值來計算其相對表現量。
而圖5-3, 6-3, 7-3中，利用測定所合成PCR產物之melting temperature來確 定其專一性，由結果可看出產物之melting temperature均落在同一溫度 上，即可確定其合成的產物具有專一性。
實驗六、以酵素連結免疫吸附法（ELISA）評估CA與probucal對IL-1β 誘導核轉錄因子NF-κB活化產生的影響
首先將細胞培養在10 cm2-dish中，細胞數約1×106，以含10 % FBS 之medium培養24小時後，再以1 % FBS之medium同步化24小時後，再分 別以含25 μM或50 μM之CA或probucol的medium加入細胞作用18小後，
利用低張溶液打破細胞膜，收集細胞核，並進一步萃取核蛋白，再定量 其蛋白質濃度，各組皆取5 μg細胞核蛋白質加入ELISA plate中進行實 驗，再依序加入一抗及二抗，接著加入受質呈色後終止反應，再波 450nm下測其吸光值。
結果顯示，在IL-1β誘發下會促使NF-κB活化，此時可測到細胞核中 有大量的NF-κB P50, P65, P52, Rel-B, C-Rel 蛋白質表現，並達到統計上 的差異(p＜0.05)，如圖8, 9, 10, 11, 12所示。而以25 μM或50 μM之綠原酸 或probucol預培養之細胞中，由圖8可發現50 μM之綠原酸及25 μM或50 μM之probucol可以明顯降低細胞核中由IL-1β所誘發之NF-κB P50的表 現，達到接近正常組的範圍，亦即表示其具有抑制IL-1β所誘發之NF-κB 的活化，且綠原酸抑制效果隨劑量增加而增強。由圖9可發現，不論加 入25 μM或50 μM之綠原酸或probucol皆可以明顯降低細胞核中由IL-1β 所誘發之NF-κB P65的表現，即表示其皆具有抑制IL-1β所誘發之NF-κB 的活化，且其抑制效果具有隨著劑量增加而增強的趨勢，但尚未達到統 計上的差異。
另一方面，我們測量細胞核中NF-κB P52, Rel-B, C-Rel蛋白質的表 現，圖10的結果顯示，不論加入25 μM或50 μM之綠原酸或probucol皆可 以明顯降低細胞核中由IL-1β所誘發之NF-κB P52的表現，並且發現綠原
酸抑制的效果較probucol佳，且抑制效果隨劑量增加而增強，發現當加 入50 μM之綠原酸後其NF- κB P52的表現較正常控制組為低。而圖11的 結果顯示不論加入25 μM或50 μM之綠原酸或probucol，亦可以降低細胞 核中由IL-1β所誘發之NF-κB C-Rel的表現，而當加入25 μM或50 μM之綠 原酸後，其NF-κB C-Rel的表現較正常控制組為低，且抑制效果隨劑量 增加而增強。在圖12的結果中，在加入25 μM或50 μM之綠原酸或 probucol後，可明顯降低細胞核中由IL-1β所誘發之NF-κB Rel-B的表現，
當加入25 μM或50 μM之綠原酸後，其NF-κB Rel-B的表現較正常控制組 為低，且抑制效果隨劑量增加而增強。
實驗七、以單核球細胞株U-937探討綠原酸是否可降低由IL-1β所誘 發之細胞黏附的情形
將單核球細胞（U937）以含10 % FBS之RPMI-1640 medium培養，
並維持細胞生長密度約105-106之間，約3-4天更換一次medium，直至實 驗時使用。實驗前先將內皮細胞分別分盤於6 well plate（2×105 cell/well）
及96 well plate（2×104 cell/well）中，以1 % FBS之medium同步化24小時 後，再以分別含25 μM或50 μM之CA或probucol的medium加入細胞反應 18小後，接著以IL-1β刺激6小時後，在結束前30分鐘加入以螢光染劑標
以PBS wash一次，取6 Well plate以螢光顯微鏡直接觀察照相，並將96 Well plate置於螢光分析儀中測量其螢光強度。
由圖13(A)的定性結果中發現，在IL-1β刺激下會誘導較多的單核球 細胞黏附於內皮細胞上，而在加入了25 μM, 50 μM之CA或probucol的組 別中，皆可明顯的降低由IL-1β所誘導之單核球黏附情形。另一方面，以 螢光分析儀測量其螢光強度的結果亦發現，在IL-1β刺激下會誘導較多的 單核球細胞黏附於內皮細胞上，其螢光強度明顯增加，並達到統計上的 差異( p＜0.05)，而不論在加入了25 μM或50 μM之CA或probucol後，皆 可明顯的降低由IL-1β所誘導之單核球黏附情形，且其抑制效果隨劑量增 加而增強，結果如圖13(B)所示。