第三章、 材料與方法
第三節、 試劑
1. 1. 以下藥品構自 Sigma, MO, USA:
Bovine serum albumin ( BSA ) Chlorogenic acid ( CA )
Cupric sulfate ( CuSO4 )
Diethyl pyrocarbonate ( DEPC ) Dimethyl Sulfoxide ( DMSO )
1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl ( DPPH ) Endothelial cell growth supplement ( ECG ) Gelatin ( 2% solution Type B )
Glucose
Hank’s balanced salts modified ( HBSS ) Heparin
3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-terazoliumbromide ( MTT ) Medium 199
Sodium chloride ( NaCl )
Sodium Bicarbonate ( NaHCO3 ) Probucol
2-thiobarbituric acid ( TBA ) Trichloroacetic acid ( TCA ) Trypan blue
Trypsin-EDTA (1X) Iso-Propanol
2.以下藥品購自 Bio-Rad, CA, USA:
Bradford reagent
iScript TM cDNA Synthesis Kit Sodium dodecyl sulfate ( SDS ) SYBR Green supermix
3.以下藥品購自 GERBU, Gaiberg, Germany:
1,4-Dithio-D,L-threitol ( DTT )
Ethyienediamine Tetraacetate Disodium Salt ( EDTA-Disodium )
4.以下藥品購自 Gibco, NY, USA:
Fetal Bovine serum ( FBS ) Hepes buffer solution (1M) L-Glutamine (200 mM) Penicillin-Streptomycin RPMI-1640
5.以下藥品購自 BDH, Poole, England:
Chloroform ( CHCl3 )
6.以下藥品購自 Molecular Probe, Oregon, USA:
2’, 7’-dichlorofluorescin diacetate ( DCFH-DA )
7.以下藥品購自 Wako, Osaka, Japan:
Hydrochloric acid ( HCl ) Hydrogen Peroxide ( H2O2 )
8.以下藥品購自 SHOWA, Tokyo, Japan:
potassium bromide ( KBr ) potassium chloride ( KCl )
Disodium hydrogenphosphate ( KH2PO4 )
9.以下藥品購自 Alderich, WI, USA:
malonaldehyde bis-(dimethylm acetal) ( MDA )
6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid ( Trolox )
10.以下藥品購自 TEDIA, OH, USA Methanol
11.以下藥品購自 TransAM, Active Motif, CA, USA:
NF-κB kit
Nuclear Extract kit
12.以下藥品購自 Invitrogen, CA, USA:
Trizol reagent
13.以下藥品購自 ProSpec-Tany, Rehovot, Isreal:
Recombinant human interleukin-1 beta
14.以下藥品購自景明化工, 台中, Taiwan 95 % Ethanol
第四節、試藥的配置 (一). 細胞培養用 1. Cord Buffer
秤取 NaCl 8 g, KCl 0.3 g, Hepes 2.38 g, Glucose 2 g 溶於 1 L 滅菌的 二次水中，配成最終濃度 NaCl 136 mM, KCl 4 mM, Hepes 1 mM, Glucose 11 mM 之 Cord Buffer，搖勻後調整 pH 值至 7.2，過 0.22 μM filter 後置 於4 ℃冰箱保存。
2. Collagenase
將每瓶含 1 g 的 Collagenase TypeⅡ溶於 1 L cord buffer 後，過 0.22 μM filter，分裝後置於-20 ℃冰箱保存。
3. Gelatin
取 Gelatin ( 2 % ) 原液 5 ml，加入 95 ml 滅菌的二次水中，配成體 積百分比0.1 % 之 Gelatin，置於 4 ℃冰箱保存。
4. M-199
將每瓶含 10.6 g 之 M-199 及 0.35 g NaHCO3，溶於 1 L 滅菌的二次 水中，搖勻後調整pH 值至 7.2，過 0.22 μM filter 後置於 4 ℃冰箱保存。
5. ECG ( Endothelial cell growth supplement )
將每瓶含 15 mg 之 ECG 溶於 6 ml 滅菌的二次水中，搖勻後置於-20
10. HUVEC Medium
取 10 ml FBS, 1 ml 二合一抗生素, 1 ml 200 mM 之 L-Glutamine, 1 ml 1 M 之 Hepes, 1 ml 1000 U/ml 之 Haparin 及 0.5 ml 2.5 mg/ml 之 ECG，
加入85.5 ml M-199 中，配成體積百分比 10 %之 FBS 和 1%之二合一抗 生素，以及最終濃度2 mM 之 L-Glutamine, 10 mM 之 Hepes, 10 U/ml 之 Haparin 及 12.5 μg/ml 之 ECG，此為臍帶內皮細胞的培養液，置於 4 ℃ 保存。
(二). MTT assay 1. MTT
取 250 mg 之 MTT 溶於 50 ml PBS 中，配成最終濃度 5 mg/ml 之 MTT 溶液，置於 4 ℃避光保存。
2. SDS-HCL
秤取 10 g SDS 溶於二次水中，再加入 1 M HCl 1 ml，再加入二次水 定量至100 ml，置於室溫保存即可。
(三). 蛋白質定量
1. BSA ( Bovine serum albumin )
秤取 10 mg 之 BSA 加入二次水中定量至 100 ml，配成最終濃度 0.1 mg/ml 之 BSA 溶液，置於 4 ℃保存。
(四). LDL 的分離與促氧化 1. 0.9 % NaCl
秤取 0.9 g NaCl 加入二次水中定量至 100 ml，配成最終質量百分 濃度0.9 %之 NaCl 溶液，置於 4 ℃保存。
2. CuSO4‧5H2O
秤取 2.5 mg CuSO4‧5H2O 加入二次水中定量至 100 ml，配成最終 濃度100 μM 之 CuSO4 溶液，置於室溫保存即可。
3. PBS-EDTA ( 透析液 )
秤取 NaCl 8 g, KCl 0.2 g, Na2HPO4 1.15 g, KH2PO4 0.2 g,及 EDTA 111.7 mg，加入二次水中定量至 1 L，配成最終濃度 NaCl 136 mM, KCl 2.6 mM, Na2HPO4 7.9 mM, KH2PO4 1.5 mM,及 EDTA 0.3 mM 之透析液，置於 4 ℃保存。
(五). TBAR
1. 0.67 % TBA ( 2-thiobarbituric acid )
秤取 TBA 0.67 g 及 NaOH 0.2 g，加入二次水中定量至 100 ml，配成 最終質量百分比0.67 % 之 TBA，於 4℃避光保存。
2. 20 % TCA ( Trichloroacetic acid )
取 TCA 原液 20 ml 加入 80 ml 之二次水，配成體積百分比 20 %之
TCA 溶液，於 4℃避光保存。
(六). 萃取 RNA 1. DEPC-treated H2O
取 100 μl DEPC 加入二次水定量至 1 L，配成最終濃度 0.01 %（體 積比）之DEPC 水，再經高溫高壓滅菌。
(七). 配製 CA 及 Probucol
在捕捉 DPPH 自由基實驗中，秤取 CA 及 Probucol 粉末，溶於甲醇 溶液中；在抑制LDL 氧化實驗中，秤取 CA 及 Probucol 粉末，溶於乙 醇溶液中；在抑制Conjugate diene 實驗中，秤取 CA 及 Probucol 粉末，
溶於PBS 中；在細胞實驗中，秤取 CA 及 Probucol 粉末，加入細胞培養 等級之DMSO 幫助溶解，配製成 10 mM, 1 mM 之 stock soluction。
第五節、實驗方法
實驗一、評估Chlorogenic acid 的抗氧化能力及清除自由基能力
（一） 清除 DDPH 自由基能力試驗 (A) 原理:
油脂在自氧化過程中，會產生自由基，接著發生連鎖反 應產生氫過氧化物或氫過氧化自由基，當兩個自由基相互結合 時，連鎖反應即終止(Thamas, 1995)，常見的抗氧化物是藉由 提供一個氫原子，來清除脂質過氧化自由基，進而抑制氧化連 鎖反應的進行。在抗氧化的研究上，通常使用DPPH（1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl）來評估抗氧化劑的供氫能力，DPPH 因其結構上可以產生穩定的共振結構，且其於517nm 波長下 有特定之吸光值。當DPPH與氧化劑作用時其吸光值也會隨 之降低(Willians et al, 1995)。利用此原理可測定出特定物質 清除自由基之效力。
DPPH˙ + A H (抗氧化劑) DPPH-H + A˙
(violet) (decolorized) (B) 步驟:
DPPH的甲醇溶液會隨著pH的不同及時間的長短而有所 變化，其在pH=5.0-6.5比較穩定，此外會隨著時間的增常而
劣化，故實驗時需新鮮配製(Blosi, 1958)。將CA溶於甲醇 中，與 DPPH (0.2 mM)等體積混合，反應 30分鐘後，以 Spectrophotometer在波長517測吸光值。整個實驗均需避光 進行，吸光值越低表示清除DPPH自由基的能力越強，以未 添加CA的吸光值定為捕捉DPPH百分率0 %來與其它濃度做 比較。( Blois, 1958 )
(C) 計算公式如下：
% 清除率 ＝ ( A0－ A ) / A0 × 100 ％ A0：不添加CA之吸光值（DPPH only）
A：加入不同濃度CA後之吸光值（CA＋DPPH）
（二） 抑制 LDL 氧化能力 ( IC50 ) 1. 分離 LDL
健康及飲食正常之成年人經隔夜禁食後，由真空採血管抽取血液 (約 30 mL )，將取出的血液於 37 ℃水浴中靜置 1.5 小時，再於 4 ℃冰 箱中靜置 1 小時；而後在 4 ℃的環境下進行低速離心（3000 rpm
“1200× g”，15 分鐘），以取得上層血清之部份。取 12 mL ( 2 ml ×6 ) 血清置入超高速離心管中( 3 PC 管)，於每管中加入 0.7 ml 0.9 % NaCl
境下進行超高速離心（100,000 rpm、10 ℃、3.5hr、Acc.5、Dec.7）。
3. 抑制 LDL 氧化能力
各加入 10.15.20.25.30 μl 的 2×10-5 M CA，用鋁箔紙包住，於 37℃
120 rpm 水平震盪 1 小時（使 probucol 及 CA 插入 LDL 中），
再加入 PBS 及 CuSO4，37℃ 120 rpm 水平震盪 2 小時（使 Cu2+作用），各加入150 μl 2 mM EDTA（終止反應），Mix 後各 取 100 μl 於 eppendorf ( 標示 Blank, 1, 2, 3…. )，各加入 900 μl isopropanol 混合均勻（沈澱蛋白質），於 12000 rpm 離心 10 min，取上清液於 cavette 中，波長 232-234nm 測吸光值。
(C). 計算公式:
△ACu2+＝〔Cu2+〕-control △Acap＝〔Acap〕-control
抑制氧化％＝(△ACu2+－△Acap)/ △ACu2+ × 100%
（三）. Conjugate diene (CD)
脂質過氧化之重要特徵為其氧化產物共軛雙烯（Conjugate Diene）
之生成量會隨氧化時間增長而增加。利用共軛雙烯可在230~235nm 吸 光值下被偵測之原理，將不同濃度的CA溶於PBS中再以銅離子( 5mM ) 於37 ℃誘導LDL 960min，反應開始起每15 min 測量一次吸光值，以 Conjugate Diene 生成量（吸光值）為縱座標，氧化時間為橫座標做圖。
實驗二、CA 的細胞毒性
（一） 萃取臍帶內皮細胞（HUVEC）
將2 ml Gelatin 黏附在 flask 上，置於培養箱中約 1 小時，倒 500 ml cord buffer 於 1000 ml 燒杯中，再加入 5 ml 抗生素，臍帶放入含 cord buffer 的燒杯中泡一下，再取出臍帶以紗布擦拭，並找到靜脈腔，將 三向活塞一端插入靜脈端，並以束縛繩固定住，針筒抽cord buffer，
排出空氣再套在三向活塞的另一端，推動針筒洗臍靜脈 1-2 次，將臍
帶靜脈內的 cord buffer 排乾淨後，以束縛繩夾住另一端封住臍帶兩 端，以針筒取約20 ml collagenase 套在三向活塞上，打入其靜脈至 8-9
分滿左右，轉動活塞避免流出，即可抽出針筒，反應約 8 分鐘（要一
邊按摩臍帶），取 30 ml HBSS 於 50 ml 離心管中，針筒接到三向活塞 上，轉動活塞，將臍帶內的 collagenase 反推回針筒中，將針筒內收集 的置入 50 ml 離心管中，將 HBSS 打入臍帶內(wash)，鎖住活塞按摩 一下後推回針筒內，置入含collagenase 的離心瓶中，再離心 1200 rpm 10 min 倒掉上清液剩下約 3-5 ml，加入於培養箱中的 flask 中，HUVEC 10 ml 搖晃均勻，隔天再換新鮮 Medium，培養至固定代數進行( Marin et al., 2001)。
（二） 培養臍帶內皮細胞（HUVEC）
HUVEC 以 37 ℃, 5 % CO2 培養於 M-199 培養基中，培養基包括 10 % FBS, 1 % Penicillin/ Streptomycin（P/S）, heparin, endothelial cell growth supplement（ECG）, L-Glutamine。每兩天換一次 Medium，長 滿後將之分盤繼代培養在新的 T-75 flask 中，取 2-5 代的 HUVEC 進行 各項實驗 ( Marin et al., 2001; Bachetti and Morbidelli,2000 )。
（三） MTT test (A). 原理:
MTT 全名（3-〔4, 5-Dimethylthialzol-2-yl〕-2, 5- diphenyl tetrazolium bromide），為一黃色的 chemical reagent, 可被活細 胞細胞吸收，其 tetrazolium 在粒腺體（mitochondria）內被 酵素 succinate dehydrogenase 還原成藍紫色 formazan，此物在 590 nm 下具最大吸收波峰，可藉由 OD 570 的大小，得知活細 胞數目，常常用於檢測樣品對細胞毒性及存活測試上 ( Denizot And Lang, 1986 )。
(B). 步驟:
將 HUVEC 分盤於 96 well plate 中( 2×104 /well ) 10 % FBS- medium 100 μl 培養約 24 小時後，以 HBSS wash 後以含 1 % FBS
之 medium 進行同步化 24 小時，wash 後再加入不同濃度含 CA 之 medium 培養 24 小時，加入 10 μl /well MTT 反應 4 小時，再 加入 100 μl/ well SDS-HCl over night 將細胞打破使色素溶出，隔 天以 OD 590 測吸光值。
實驗三、Ox-LDL 誘發 HUVEC 表現 IL-1β
（一）、Ox-LDL 的製備 1.Ox-LDL 促氧化
先定量LDL protein（0.9 mg/ ml）加 0.1 ml CuSO4 100 μM (最終 濃度為10 μM)，37℃下避光水平震盪 24 hr。
2.透析
將LDL 放入透析膜內，以透析夾固定後，放入血清瓶中，將瓶 子裝滿透析液，透析液的成分即含0.3 mM EDTA的PBS，於4 ℃環境 下避光攪動，先透析2小時後更換新的緩衝液，再於5及8小時後更換 一次，再進行透析over night，而後取出的LDL過濾（0.22 μM）再充 氮氣後於4 ℃下避光保存備用。
3.測 TBAR
Malondialdehyde ( MDA ) ，一分子的MDA與二分子thiobarbituric acid ( TBA )會生紅色聚合物TBARS ( thiobarbituric acid reactive substance )，此物質於OD 532 nm具最大吸收波長，而加入TCA可使蛋 白質沉澱，以不同濃度的MDA為標準液與TBA反應做檢量線而可定量 LDL氧化程度，單位為n mol/ ml，值越高表示脂質氧化程度越高。
4.氧化低密度脂蛋白蛋白質濃度之定量
取10 μL 之Ox-LDL，加入790 μL DDW及200μL Bio-Rad Dye Reagent (稀釋100倍)，在室溫下放5分鐘後，於OD 595 nm下測吸值，
所得吸光值越高則表示Ox-LDL 中所含的蛋白質量越高。所測出的吸 光值與小牛血清白蛋白（Bovine serum albumin, BSA）之標準曲線做 對照，便可求出Ox-LDL 中所含蛋白質含量。
（二）、Ox-LDL影響IL-1β m-RNA的表現 1. 細胞加藥處理
將細胞培養在10 cm2-dish中，細胞數約1×106，以含10 % FBS之 medium培養24小時後，再以1 % FBS之medium同步化24小時後，控制 組不加OX-LDL，而另一組則加入100 μg/ ml OX-LDL於medium中，反 應24小時後以Trypsin-EDTA收細胞。離心後到掉上清液，其沈澱物即 為細胞。
2.Totol RNA的萃取
取沉澱後之細胞加入1 ml Trizol reagent，混勻後至於冰上5分鐘，
各管再加入200 μl CHCl3，震盪混合15秒後靜至於冰上15分鐘，接著 離心（12000xg, 15min, 4℃），吸取上清液600μl至新的1.5ml微量離心 管中，加入500 μl isopropanol上下混合均勻，在靜置於冰上10分鐘，
接著離心（12000xg, 10min, 4℃）。去除上清液，留下底下白色沈澱 物，加入1 ml 70% alcohol使RNA更純淨，接著離心（7500 xg, 5 min, 4℃）。去除酒精再加入適量( 20-50μl ) DEPC-treated H2O，將RNA 沈澱物溶解並保存於-80℃。
3.RNA定量
先將分光光度計暖機至少10分鐘以穩定光源，利用OD 260/OD 280nm波長之紫外光測量RNA的純度，利用OD 230及OD 270測有機 溶劑的殘留。先取石英管注入1000μl DEPC-treated H2O作為blank，接 著取1 μl Total RNA與999 μl DEPC-treated H2O混合均勻後，
Spectrophoto- meter測量。
計算Total RNA=OD 260 ×40 ×1000 ( μg/ml ) 4.反轉錄反應（Reverse transcription）
取固定量的RNA（4μg）來進行單管的RT反應。在200 μl PCR微
量離心管中加入下列試劑：
Volume per reaction 5x iScript Reaction Mix 4 μl
iScript Reverse Transcriptase 1 μl
Nuclease-free water 15-X μl
RNA template X μl
Total Volume 20μl
混合完全後置入PCR machine，進行反轉錄反應。
混合完全後置入PCR machine，進行反轉錄反應。