實驗方法

一、泡巢面積記錄與分析

泡巢面積記錄方式是於第2 天至第 10 天時，將可浮在水面之塑膠尺放置於 雄魚的泡巢旁後，以數位相機（Sony Cyber-shot DSC-W5，300 萬畫素，Sony，

Japan）從水面正上方拍照（Huang & Chen 2006；Huang & Chang 2011），鏡頭前 端與水面距離約20 公分。每個個體會有 9 份泡巢照片（第 2 天至第 10 天），我 使用ImageJ（v. 1.45b，NIH，USA）逐一估算每份照片中之泡巢面積（估算步驟

見附錄一），並使用此9 個泡巢面積之平均值（單位：平方公分）進行後續的統 計分析。

二、賀爾蒙收集、萃取與分析

本研究固定於實驗第 7 天的上午 9 點至 9 點半對實驗個體進行水體樣本的收 集。魚類在水中會經由鰓、皮膚、排泄物、特化器官等等構造釋放固醇類賀爾蒙

（Scott & Sorensen 1994），而個體釋放到水中的賀爾蒙量往往與血液中的賀爾蒙 量呈現高度正相關（Scott et al. 2001），因此本實驗分析實驗個體釋放至水體中的 賀爾蒙量，以避免抽血可能造成之傷害。收集方式為將實驗個體靜置於裝有400 毫升，已曝氣過之自來水的600 毫升燒杯中 30 分鐘。由於交配缸有 3 面被圍以 深綠色瓦楞板，僅有1 面可讓實驗個體看到外面環境，因此為使個體處於與交配 缸同樣顏色的空間並避免外界干擾，燒杯有3/4 面以深綠色防水膠帶纏繞。我以 魚網將實驗個體從交配缸撈出放入燒杯中（平均處理時間：雄魚20.23 ± 0.58 秒；

雌魚21.23 ± 0.79 秒），30 分鐘後再使用魚網將魚由燒杯中撈出放回交配缸。在 收集賀爾蒙水樣的步驟中，每隻個體從交配缸中被撈起至被置入燒杯所花費的時 間並未對賀爾蒙分泌量造成顯著之影響（雄魚：睪固酮r = -0.016，P = 0.907；

睪丸硬甾酮r = -0.209，P = 0.123；雌二醇 r = -0.237，P = 0.079；皮質醇 r = 0.130，

P = 0.338；雌魚：睪固酮 r = -0.141，P = 0.302；睪丸硬甾酮 r = -0.218，P = 0.106；

雌二醇r = -0.156，P = 0.250；皮質醇 r = -0.182，P = 0.180）。

隨後將燒杯內的水以濾紙（Quanlitative filter paper No.1，Advantec MFS，

USA）過濾。接著用真空幫浦（Rocker 300 Vaccum pump，Taiwan）將過濾後的 水通過RP-18 固相萃取管柱（LiChrolut® RP-18 solid phase extraction column，

Merck）。管柱使用前先使用 2 毫升甲醇（methanol）潤洗兩次，再用 2 毫升二次 水（ddH2O）潤洗一次，接著關上管柱閥門，加入 2 毫升二次水保持管柱濕潤後 開始萃取水樣。所有水樣通過管柱後，再加入2 毫升二次水潤洗兩次以確保無水

樣殘留在管柱內，隨後以石蠟膜（Parafilm® M）封口並存放入-80℃冰箱。

洗提賀爾蒙時，我先以 2 毫升二次水清洗 RP-18 固相萃取管柱兩次，再連續 加入2 毫升乙酸乙酯（ethyl acetate）兩次將管柱中的賀爾蒙洗提至 12 × 75 公厘

（6 毫升）的玻璃試管中。最後以二氧化氮氣體（純度 99.99%）在 37℃的水浴 下將洗提出的賀爾蒙液加速揮發成賀爾蒙粉末。乾燥後的賀爾蒙粉末加入由酵素 免疫分析套組（Cayman Chemical’s ACE^TM EIA Kits，Cayman）提供的 600 微升 酵 素 免 疫 緩 衝 液 （enzyme-immunoassay buffer ， EIA buffer ）， 使 其 再 懸 浮

（resuspend）以得到要用來進行分析的賀爾蒙樣本，於定量分析前先以石蠟膜封 口存放於-20℃冰箱。

酵素免疫分析套組是利用酵素免疫分析法（enzyme immunoassay，EIA）來 進行賀爾蒙之定量分析。在各種賀爾蒙分析套組所提供的 96 孔分析孔盤中，每 個孔洞皆塗有可結合辨識特定賀爾蒙分子辨識抗體血清（specific antiserum to hormone）之小鼠單株免疫抗體（mouse anti-rabbit IgG）。參照操作手冊步驟，首 先將每隻實驗個體的賀爾蒙樣本取 50 微升注入孔洞，並進行二重複試驗，隨後 在每個孔洞中加入50 微升乙醯膽鹼酯酶顯跡物（acetylcholinesterase tracer，AChE tracer）以及 50 微升抗體血清（antiserum）；接著以塑膠膜將 96 孔盤封盤，並將 孔盤放置於震盪器上經過一段時間的培養：睪固酮與雌二醇需在室溫下培養2 小 時、睪丸硬甾酮需在4℃的環境下培養 18 小時、皮質醇則需在 4℃的環境下經過 隔夜培養（overnight）。培養過後，將96 孔盤經由分析套組提供的清洗緩衝液（wash buffer）清洗 5 次並以紙巾吸去多餘液體，隨之在每個孔洞中加入 200 微升的 Ellman’s 試劑，封盤後以鋁箔紙避光，依操作手冊將其放置於震盪器上 45－90 分鐘。最後使用酵素免疫分析儀（Bio-Tek ELx808^TM Series Ultra Microplate Reader）以 405 奈米的光波長讀取樣本吸光值。此種計算賀爾蒙濃度的原理是利 用樣本中賀爾蒙與乙醯膽鹼酯酶顯跡物中的標準賀爾蒙（由分析套組提供）進行 競爭，若樣本中的賀爾蒙濃度越高，標準賀爾蒙結合於固著抗體的量會越少，所 激發出的顏色（黃色）就會比較淺，反之黃色會較深；因此藉由顏色深淺變化與

標準賀爾蒙濃度曲線（每盤有一標準曲線）顏色做對照，即可由吸光值計算出樣 本中的賀爾蒙濃度。

除了欲分析的實驗個體樣本外，每個 96 孔盤上還使用集合樣本（pooled sample）進行二重複試驗以做為此盤的控制。集合樣本的來源為本實驗室 2007 年萃取自14 隻雄蓋斑鬥魚以及 14 隻雌蓋斑鬥魚的賀爾蒙樣本，將其各取出 600 微升混合而成。最後每種賀爾蒙各分析 5 盤，每盤的分析內（intra-assay）變異 係數分別為：睪固酮（2.3%、2.0%、1.9%、6.2%、4.0%）；睪丸硬甾酮（2.5%、

2.4%、3.8%、3.0%、3.8%）；雌二醇（2.1%、6.4%、6.2%、2.4%、2.6%）；皮質 醇（1.5%、4.1%、3.2%、3.9%、5.7%）。分析間（inter-assay）變異係數為：睪 固酮（11.3%）；睪丸硬甾酮（3.7%）；雌二醇（20.0%）；皮質醇（5.0%）。而靈 敏度（sensitivity）的範圍則為：睪固酮（6.0－32.0 pg/ml）；睪丸硬甾酮（1.3－

5.0 pg/ml）；雌二醇（19.0－129.0 pg/ml）；皮質醇（35.0－180.0 pg/ml）。本研究 中賀爾蒙的定量單位為每毫升多少皮克（pg/ml）。

為了確認本研究使用的酵素免疫分析套組可確實測量蓋斑鬥魚的賀爾蒙，我 在進行賀爾蒙定量分析的同時還對蓋斑鬥魚賀爾蒙進行了兩種驗證（validation）

（Earley & Hsu 2008）：（1）將集合樣本經過序列稀釋（serial dilution）後，比對 其濃度曲線與標準賀爾蒙濃度曲線的平行度（parallelism）、（2）測定集合樣本的 定量恢復度（quantitative recovery）。

在比對平行度方面，首先取出 400 微升集合樣本（1：1）進行序列稀釋，稀 釋方式為將200 微升的集合樣本（1：1）與 200 微升的酵素免疫緩衝液混合配製 成1：2 的稀釋倍率，再取 200 微升 1：2 稀釋倍率溶液與 200 微升酵素免疫緩衝 液混合成1：4 的稀釋倍率，依此方式配製至 1：128 稀釋倍率；隨後將此 8 種不 同稀釋倍率的集合樣本（1：1－1：128）依循上述定量分析的步驟進行二重複試 驗。結果顯示，所有賀爾蒙的序列稀釋濃度曲線斜率皆與標準賀爾蒙濃度曲線斜 率沒有顯著差異（Zar 1998，p. 360；睪固酮：t11 = 0.102，P = 0.920；睪丸硬甾 酮：t12 = 0.052，P = 0.960；雌二醇：t9 = -0.001，P = 0.999；皮質醇：t10 = 0.107，

P = 0.917）。在定量恢復度方面，則是將 120 微升集合樣本與 120 微升標準賀爾 蒙溶液混合。由於標準賀爾蒙有8 種稀釋倍率，因此最終有 8 種混合濃度的定量 恢復樣本與未經稀釋的集合樣本依循上述定量分析的步驟進行二重複試驗。在此 種配製方法下，預期的恢復濃度（expected recovery concentration）可由已知濃度 的集合樣本（1：1）以及標準賀爾蒙溶液推得。結果顯示，各賀爾蒙觀察到的最 低恢復度分別為103.3%（睪固酮）、99.2%（睪丸硬甾酮）、78.9%（雌二醇）、99.0%

（皮質醇）。所有賀爾蒙的預期恢復濃度與實際恢復濃度皆呈現線性關係，其在 線性關係上的斜率分別為1.028（睪固酮）、1.150（睪丸硬甾酮）、0.813（雌二醇）、 1.008（皮質醇）。綜合以上兩種驗證結果，此酵素免疫分析套組可有效地測量蓋 斑鬥魚釋放至水中的睪固酮、睪丸硬甾酮、雌二醇以及皮質醇濃度。

三、鏡像測試

鏡像測試進行方式是首先在雌、雄個體的區域中央處各置入一深綠色不透明 隔板，並於兩區域的外側面（即交配缸的兩個側面）各置入一面鏡子（魚被隔在 內側區域；圖三）。5 分鐘之後移除隔板，並以錄影機（JVC Everio Hard Drive Camcorder，JVC，Japan）錄影記錄雌、雄個體對自己鏡像之反應 30 分鐘，30 分鐘後測試結束，鏡子會在隔板未插回去的情況下被緩慢的抽離。蓋斑鬥魚在看 到鏡像後會快速的朝鏡像游去，我記錄實驗個體在第一次朝鏡像游去後的10 分 鐘內張嘴啄咬鏡像的次數，以此攻擊頻率（attack frequency）作為攻擊性指標。