實驗設計與流程

本研究將一雌一雄蓋斑鬥魚進行配對，以三種生殖成功率指標（產卵與否、

產卵潛伏期：雌、雄個體開始互動至缸中有卵出現時的間隔天數、產卵量）來探 討這些指標與雌、雄個體之形態、行為特徵以及賀爾蒙之相關性。

我首先於相同來源（實驗室/動物園）捕捉標準體長大於 4 公分且已表現出 第二性徵的雌、雄成魚進行配對（Davis & Kassel 1975；Miklósi et al. 1997b）。在 實驗室配對的部分，我於第一組實驗開始前的一個禮拜把各養殖缸的環境分隔成 兩半以將雌、雄個體隔離開來。分隔的方式為將養殖缸中的蓋斑鬥魚及其它生物 撈出之後，於缸內放置兩張大型深綠色網袋（長186 公分、寬 120 公分，一長邊 開口呈袋狀；圖一 b），每一網袋可撐開成半個養殖缸的體積（圖一 a）；隨後再 把蓋斑鬥魚以外的生物分成兩部分放入網袋，並把原來缸中之雌、雄魚放至不同 的網袋內以隔離飼養，此種隔離狀態一直維持到研究結束，因此越晚進行實驗的 個體在養殖缸中被隔離的時間越長。之後每次進行實驗室配對的實驗前，我會將 欲捕捉個體之網袋從水裡撈起至網袋底部離水面還有3 公分的距離，徒手在網中 的魚群內抓取個體，配對之雌、雄魚會取自不同養殖缸。在動物園配對方面，我 則是採用放置蝦籠的方式來進行捕捉，每次使用一或兩個蝦籠，一個月捕捉一 次，每次最多捉回8 對蓋斑鬥魚。而無論是來自實驗室養殖缸或動物園池塘之實 驗個體皆會帶回實驗室並單獨放置於裝有已曝氣過之 500 毫升自來水的白色透 光聚丙烯（polypropylene，P.P.）盒（12 × 12 × 8.5 立方公分，一個盒子放置一個 個體）：盒與盒間放置黑色不透明隔板以避免不同個體間的視覺接觸，待個體適 應至不再表現出壓迫行為（縮在盒子角落、不游動、不吃食飼料）後，即於日後 進行實驗（大部分配對約適應1－4 天，動物園配對則最長適應 14 天）。同時在

此階段，我將捕捉自動物園的雌、雄個體進行配對以於日後進行實驗，配對方式 無任何選擇偏好。實驗室室溫維持在25.0 ± 2.0℃，光：暗周期為 14：10 小時，

並於每天上午9 點餵食市面販售之小粒浮水性飼料。

實驗處理開始的前 1 天，我先將實驗個體放入經過碳酸氫鈉（sodium bicarbonate，NaHCO3）調整pH 值至中性（pH = 7）的 MS-222 溶液（500 毫克/

公升，Sigma-Aldrich®）中進行麻醉（平均麻醉時間：雄魚 57.07 ± 2.13 秒；雌 魚53.81 ± 2.11 秒），再使用準確度達 0.01 公厘之數位游標尺測量實驗個體的標 準體長（單位：公厘）。而過去研究指出，延伸成絲狀的尾鰭為雄性蓋斑鬥魚的 第二性徵之一（Hall 1968），因此我還測量了雄魚的尾鰭長度（caudal fin length，

尾鰭基部至尾鰭最末端的長度；單位：公厘）作為其第二性徵的指標。

實驗第1 天，我將選定配對之雌、雄個體放置於交配缸（45 × 21 × 25 立方 公分，水深為20 公分；圖二）之左、右區（每區無選擇偏好的放入雄魚或雌魚）。

交配缸三面圍以深綠色不透明塑膠瓦楞板，並於離缸底5 公厘的距離放置一層黑 色塑膠網（網格：4 × 4 平方公厘）以讓排泄廢物落到網下。缸子中央以深綠色 不透明隔板將缸子分成左、右兩區，兩區的配置呈鏡像對稱。在此兩區的側面缸 壁各自裝設有外掛式過濾器（出水量 120－190 公升/小時），而在距離缸壁 5 公 分處置有一深綠色的孔洞隔板，其下半部開有9 條縱向長條孔洞（每條為 1 × 11 平方公分），上半部有54 個平均分佈的小孔洞（直徑 3 公厘）。放置此隔板的目 的是為了將過濾器與魚的活動範圍隔開，以減少過濾時對實驗個體的干擾。由於 Huang & Cheng（2006）的研究顯示，在水面上放置浮水性植物或人工製品之保 麗龍可促使蓋斑鬥魚築泡巢，因此我在雌、雄個體活動範圍的水面中央各放置一 片直徑為25 公厘之塑膠綠菊草（仿 Cabomba caroliniana）。而由前置實驗得知，

蓋斑鬥魚會利用陶磚的孔洞作為遮蔽處，因此我於缸中雌、雄個體的區域內各放 置一具有兩橢圓形孔洞（長徑4.3 公分，短徑 2.4 公分，深 8 公分）之陶磚（8 × 4 × 13 平方公分）作為實驗個體之遮蔽物。實驗進行時之光：暗周期為 14：10 小時，水溫則依環境溫度變動。

由於無法確知實驗個體在原棲息環境（實驗室戶外缸/動物園池塘）是否剛 生 殖 完 成 ， 而 雌 魚 每 次 產 卵 的 平 均 間 隔 天 數 據 報 導 為 6 － 7 天

（http://www.sec.ntnu.edu.tw/Monthly/95(286-295)/294-pdf/03.pdf），因此我讓雌、

雄個體在交配缸中（持續以深綠色不透明隔板隔開）適應10 天（第 1 天到第 10 天），以允許實驗個體的生理狀態有足夠時間進入下一次的生殖週期。過去在迷 鰓魚類的研究中，許多都指出雄性為主要表現交配前築巢行為的性別，因此我於 實驗的第2 天至第 10 天，連續 9 天以數位相機拍下雄魚的泡巢以便日後計算其 面積（方法詳見下一節「實驗方法」），每日拍照完畢後即以魚網將泡巢移除；而 在這9 天，我也同時對雌魚進行與雄魚相同之拍攝與移除泡巢的步驟。先前有研 究（Miklósi et al. 1997b）顯示，蓋斑鬥魚在前次打鬥中獲勝/落敗的經驗效應

（winner/loser effect）會在 6 天內消退，因此我選擇在第 7 天收集實驗個體的賀 爾蒙樣本（方法詳見下一節「實驗方法」；Earley & Hsu 2008），以降低實驗魚於 原棲地環境的打鬥經驗可能對體內賀爾蒙所造成的影響。而為了讓實驗個體適應 賀爾蒙取樣的操作步驟，減低此操作步驟對賀爾蒙分泌量的影響，我在第2 天至 第6 天，連續 5 天對實驗個體進行與收集賀爾蒙樣本當天（第 7 天）同樣的操作 步驟（Scott et al. 2008；Wong et al. 2008），但是只有於第 7 天所收集到的水體樣 本才被用來進行賀爾蒙分析。第8 天則分別對雌、雄個體進行鏡像測試（mirror test），錄影記錄其對鏡像的攻擊行為（方法詳見下一節「實驗方法」; Earley et al.

2000）。由於在魚類，雌性的繁殖力（fecundity）通常與體型大小有關（Clotfelter et al. 2006），因此我在第 8 天，於鏡像測試後以電子秤（EK-200i，A&D Ltd.，

Taiwan）測量實驗個體的體重（單位：克）。第 9 天除了以數位相機拍下雌、雄 魚的泡巢以及用魚網將泡巢移除之外，未對實驗個體進行任何其它操作。第 10 天時則在拍攝完泡巢後（未再移除泡巢）將雌、雄個體間的隔板移除，並關閉外 掛式過濾器以避免過濾器日後吸附魚卵。每天的實驗操作皆於上午9 點開始，記 錄完交配缸內的水溫（平均27.4 ± 1.0℃，範圍為 24－29℃）後進行當天的實驗 操作，並且於實驗步驟操作完畢後餵食實驗個體，餵食時間依操作步驟的不同介

於上午9 點至 10 點半。

前置實驗觀察發現，蓋斑鬥魚皆於下午時間（約下午2 點之後）開始交配產 卵，每次交配時間為2－4 小時；因此我自第 10 天開始（移除雌、雄個體間隔板 後），每天於上午9 點至晚上 7 點的時間內隔 2 小時檢查一次交配缸中是否有魚 卵出現，直到實驗結束。每組配對最後會被記錄為（1）有產卵，或是（2）未產 卵兩種結果。從隔板被移除（第10 天）至觀察到有魚卵那天的間隔天數為「產 卵潛伏期」；例如，若於第15 天觀察到交配缸中有魚卵，產卵潛伏期即為 5 天。

此外，我並於次天上午9 點確認雌魚是否結束產卵，若所有卵皆已被集中至泡巢 內且雄魚一直驅趕雌魚使雌魚完全無法接近泡巢，則確認為產卵結束。隨之將 雌、雄個體移出交配缸放回白色透光聚丙烯盒，於當天計數魚卵數量並結束實 驗。實驗完成之蓋斑鬥魚會送給他人飼養而不會放回原環境，故不會有重覆取樣 的 可 能 。 過 去 有 報 導 指 出 ， 蓋 斑 鬥 魚 會 在 配 對 後 的 2 － 9 天 內 交 配 產 卵

（http://www.sec.ntnu.edu.tw/Monthly/95(286-295)/294-pdf/03.pdf），因此本研究的 蓋斑鬥魚配對若至實驗第24 天（雌、雄魚間隔板被移除 14 天後）仍未交配，我 則會在第24 天將實驗結束並解剖雌、雄個體，觀察其性腺以確認性別的判定是 否正確。