實驗方法與材料

第 3 章 實驗方法與材料

為探討前列腺癌骨轉移之相關機轉，本研究將以多種細胞株 (表 1)，利用轉 染技術模擬大量表現cadherin-11 的前列腺癌細胞，或利用已表現有 cadherin-11 的 細胞株進行cadherin-11 表現量的負調控，以建立試驗及對照組研究，並以多種細

UMR106、MC3T3-E1、ROS17/2.8、Saos-2、L-cell (CCL1.3)、293FT 和 C2C12 細胞是由American Type Culture Collection (Manassas, VA) 採購而來，而由 LNCaP 細胞產出之亞系C4-2B4[32]是由達拉威大學(University of Delaware ) Robert Sikes 博士提供。表現有cadherin-11 的前列腺癌 PC3 及 PC3-mm2 細胞株則是由 M. D.

Anderson 癌症中心的 I. J. Fidler 博士提供。載有 cadherin-11 突變體 cad11-JMD 與 cad11-CBS 的 pCEP4 載體則是由哈佛大學 Brigham and Woman Hospital, Harvard University 的 Michael Brenner 博士提供。

3.2 細胞培養

L-cell 、 293FT 、 UMR106 、 ROS17/2.8 、 Saos-2 、 C2C12 培 養 於 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) medium，C4-2B4、PC3、PC3-mm2 細胞培養

7

於RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute-1640) medium，MC3T3-E1 細胞培養 於-MEM (-Minimum Essential Media) medium，培養液均加入 10% fetal bovine serum (v/v) 、 100 unit/mL penicillin 、 0.1 mg/mL streptomycin 、 0.25 g/mL amphotericin B，培養箱控制溫度 37℃，二氧化碳濃度 5%。

3.3 Cadherin-11-Fc 製備

利用 bicistronic pBMN-I-GFP反轉錄病毒載體 (Dr. Gary Nolan提供, Stanford University)，將human cadherin-11 (OB-cadherin) 的細胞外區域與人類IgG1之Fc片 段接合。首先以BamHI- Fc-F 及 NotI-Fc-R引子 ( primers) 進行PCR放大， 利用 GoTaq polymerase (Promega, Madison, WI) 並以 94 °C 5 min (1 個循環)、94 °C 30 s、 53 °C 30 s、72 °C 30 s (30個循環)，及 72 °C 10 min (1個循環)進行反應，再 以BamHI and NotI 限制酶完成pBMN-Fc-I-GFP製備。另利用BgIII and BamHI 限制 酶將cadherin-11細胞外區域之DNA嵌入pBMN-Fc-I-GFP，完成

pBMN-(OB-CAD-Fc)-I-GFP置備[33]。

再利用Fugene 6 (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) 將

pBMN-(OB-CAD-Fc)-I-GFP轉染至Phoenix 細胞，細胞培養48小時後，取得含病毒 之上清液再與Polybrene (hexadimethrine bromide H9268; Sigma– Aldrich, St. Louis, MO) 混合後加入293FT 細胞培養液中，並於32 °C下培養72小時，最後利用轉染成 功之細胞同時表現的GFP綠色螢光，以FACS進行細胞挑選 (附圖1)。

表現OB-CAD-Fc (Cad-11-Fc) 之293FT細胞培養於DMEM medium中，至細胞 長滿約80-90%時，改以不含protein的CD293 medium (Invitrogen)培養，收集上清液 濃縮後，以Protein A-agarose beads (Pierce) 進行管柱層析 (chromatography) 純化 [33]。

3.4 西方墨點法 (Western blot)分析

細胞以含有蛋白酶抑制劑的裂解緩衝液 (0.3% NP-40, 25 mM Tris, 0.15 M NaCl, 2 mM EDTA, pH7.4) 進行細胞溶解，離心後取其上清液，並加入sample buffer (0.075 M Tris–HCl [pH 6.8], 1.5% SDS, 15% glycerol) 隔水煮沸5分鐘後，取適量樣 本以4–12% gradient NuPage gels (Novex/Invetrogen, San Diego, CA)進行分析，分析

8

液為 GelCode Blue Stain Reagent (Pierce, Rockford, IL) ，並以Tris-glycine-methanol transfer 緩衝液 (25 mM Tris base, 192 mM glycine, 20% methanol v/v)將蛋白轉印 至 nitrocellulose membrane (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) 上。轉印膜先以1%

Ponceau S (Sigma, St. Louis, MO) 確認蛋白量後，以泡製於TBS-T溶液 (50 mM Tris–HCl [pH 8.0], 138 mM NaCl, 27 mM KCl, 0.1% Triton X-100) 的4% 脫脂牛奶 (Bio-Rad) 浸泡後 ，與一級抗體於4℃下進行隔夜反應後，再以TBS-T溶液於室溫 下清洗5次，加入1:5000稀釋的 peroxidase labeled donkey anti-goat IgG (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)二級抗體於室溫下反應1小時，並以SuperSignal West Pico (Pierce) 試劑進行偵測。

3.5 製備表現有 cadherin-11 的 L-cell 及 C4-2B4 前列腺癌細胞株

同2.3 載體置備方式，並以 NotI/ XhoIC4-2B4 將完整 cadherin-11 序列轉載於 pBMN-I-GFP 載體上，再以 retrovirus 轉染至 L-cell 或 C4-2B4 細胞，製備 L-cell/cad-11 及C4-2B4/cad-11 細胞。C4-2B4/ΔJMD 及 C4-2B4/ΔCBS 細胞則是利用由哈佛大 學Brigham and Woman Hospital, Harvard University 的 Michael Brenner 博士提供載 有cad11-ΔJMD 與 cad11-ΔCBS 之 pCEP4 載體，以 HindIII 與 BamHI 限制酶剪 取，其插入序列則複製至 pBluescriptII 中，再以 XhoI 與 NotI 限制酶將其複製至 pBMN-I-GFP 中。pBMN-I-GFP 載體含有完整與截短型態的 cadherin-11，並以 2.3 所 述 方 式 來 產 出 反 轉 錄 病 毒 並 轉 染 產 出 C4-2B4/cad11 、 C4-2B4/ΔJMD 及 C4-2B4/ΔCBS 細 胞 株 。 對 照 組 L-cell/vector 及 C4-2B4/vector 細 胞 則 是 以 pBMN-I-GFP 載體產出的轉錄病毒來備製。

3.6 製備抑制 (knockdown) cadherin-11 表現的 PC3-mm2 細胞

PC3-mm2 是從 PC3 發展出的細胞株，其本身即已表現有 cadherin-11，本實驗 利 用 Fugene 6 (Roche) 轉 染 試 劑 ， 將 載 有 cadherin-11 shRNA (pLKO34, Sigma-Aldrich) 及 non-target shRNA (Sigma-Aldrich) 的 lentivirus 與 ViraPower DNA (Invitrogen)，在 293FT 細胞內共轉染病毒載體。293FT 細胞經培養 48 小時後，取 其上清培養液， PC3-mm2 細胞在 32°C 環境中，加入此上清液並於 8 µg/mL 聚凝

9

3.9 免疫細胞化學 (immunocytochemistry) 染色分析

在蓋玻片上生長的細胞以-20℃ 100%的甲醇固定 10 分鐘，在 C4-2B4 與 MC3T3-E1 共培養實驗中，細胞以 PBS 清洗後再以 3.5%的多聚甲醛固定，然後以 0.1% Triton X-100 (in PBS) 進行穿透，並以 5%的驢血清液進行阻斷 (block)。以老 鼠抗人體cadherin-11 單株抗體 4B6 (附圖 6）以 1:25 比例稀釋於含有 0.5%驢血清 及0.01% BSA 的 PBS 溶液中作為ㄧ級抗體，老鼠 IgG (Santa Cruz Biotechologies) 則 作為對照。細胞與主要抗體於 4℃環境中進行隔夜靜置，接著以 Cy3-conjugated donkey anti-mouse 抗體 (Jackson Immuno Research) 作為二級抗體。載玻片固定於 Vectashield mounting medium ， 並 以 Olympus 顯 微 鏡 或 共 軛 顯 微 鏡 (Leica Microsystems Inc., Exton, PA) 進行觀察。

10

3.10 細胞移行 (migration) 分析

以Falcon HTS FluoroBlok Inserts (Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ) 在 24 孔細胞培養皿進行實驗，migration inserts 先以 10 g/ mL cadherin11-Fc 或 Fc 在 4℃靜置隔夜。將多餘的 cadherin11-Fc 或 Fc 溶液移除後，每ㄧ insert 植 入3×10⁴個前列腺癌細胞於不含 serum 的 RPMI 培養液，下層培養皿中則置入 0.5 mL 含有 10% FBS 的 RPMI 培養液，以作為趨化劑 (chemoattractant)。在 37℃環境 中培養24 小時後，將 insert 轉置於含 1M calcein AM 之 HBSS 溶液 1 小時進行標 記後，於顯微鏡下進行觀察，於 100 倍視野下取 3 個區域計數移行之細胞數，並 取其平均值。

3.11 細胞侵襲 (invasion) 分析

以BioCoat Matrigel coated invasion chamber (8 m pore size, BD Bioscience, Bedford, MA)在 24 孔細胞培養皿進行實驗，每ㄧ chamber 先以 serum free RPMI 培 養液靜置隔夜。實驗用之前列腺癌細胞培養液改以含250 g/mL BSA 之 RPMI 培 養液後於培養箱放置隔夜，每ㄧchamber 植入 10⁵個前列腺癌細胞於不含serum 的 RPMI 培養液，下層培養皿中則置入 0.5 mL 含有 10% FBS 的 RPMI 培養液，以作 為趨化劑 (chemoattractant)。在 37℃環境中培養 24 小時後，將 chamber 上方的細 胞移除，並將穿過 Matrigel 於 chamber 下方的細胞以-20℃甲醇固定，再以 DAPI 染色後於顯微鏡下觀察計算數量。於 100 倍視野下取 3 個區域計數細胞數，並取 其平均值。

3.12 免疫沉澱法 (immunoprecipitation) 分析

C4-2B4 細胞以含有蛋白酶抑制劑的裂解緩衝液 (0.3% NP-40, 25 mM Tris, 0.15 M NaCl, 2 mM EDTA pH7.4) 進行細胞溶解。細胞裂解上清液與山羊抗人體 cadherin-11 多株抗體 (R&D Systems, Minneapolis, MN) 進行免疫沉澱，並以西方 墨點法檢驗，再以老鼠抗人體cadherin-11 多株抗體 (Zymed)、老鼠抗 p-120 catenin (BD Bioscience) 或兔子抗 β-catenin (受贈於 M D Anderson 癌症中心的 Pierre

11

McCrea 博士)。信號則以 SuperSignal West Pico (Pierce)套組進行偵測。

3.13 微陣列 (microarray) 基因分析

由各種待分析細胞萃取取得 500 ng RNA 進行 cDNA 合成，並進行 aRNA (antisense-RNA) 放大反應 (amplification)及 biotin 標記 (Illumina Inc.)，biotynlated aRNA (1.5 g) 再與 Illumina HumanHT-12 Beadchip v.3 微陣列晶片進行雜交反應 (hybridization)，之後再加入染劑 cyanine 3- streptavidine (GE Healthcare) 與雜交於 探針上aRNA 的 biotin 官能基作用，清洗後以 Illumina BeadArray Reader confocal scanner (Beadstation 500GXDW) 進行掃瞄。掃描後的資料以 Bead Studio 3.6 (Illumina) 擷取，並利用 Linear Models for Microarray Data (LIMMA) 進行 quantile normalization。每一基因的表現量則轉換為以 2 為底取 log 值 (log2 base) 作分析。

各群組間以 t-test 進行統計分析。

3.14 FACS (fluorescence-activated cell sorting)分析

以2 mM EDTA 將細胞從培養皿釋放，並懸浮於 PBS 溶液，取 10⁶個細胞，

並以 1% BSA 於 4℃下 30 分鐘進行非特定性阻斷，之後再與一級抗體 (如 4B6 mouse anti-human-cadherin 單株抗體) 於 4℃下作用 1 小時，細胞經清洗後，重新 懸浮於0.5 mL 0.01% BSA，並與 Alexa-647-conjugated anti-mouse IgG (Invitrogen) 作用，螢光強度則以FACScan analyzer (Becton-Dickison, Mountain View, CA)進行 偵測。

3.15 細胞增殖、存活與 docetaxel 敏感性分析

以luciferase 標記的 5×10⁴個C4-2B4 細胞培養於長滿 MC3T3-E1 細胞或空的 培養皿中，經隔夜讓細胞貼附於培養皿起計算，分別於第 1、2、 3、 4 天以 Passive Lysis buffer (Promega)溶解細胞，並量測 luciferase 活性，作為細胞數量的對應值。

同時以5×10⁴個C4-2B4 細胞隔夜培養後的數值作對照，以二者 luciferase 活性倍數 作為細胞增值數值。

12

細胞存活分析則於隔夜培養後將培養以液換成serum free，並於第 4 天以前述 方式量測luciferase 活性值。

Docetaxel 敏感性分析則將細胞於隔夜培養後將培養液換成含 0、1、2、4 nM docetaxel，2 天後以前述方式量測 luciferase 活性值，並以 5×10⁴個C4-2B4 細胞隔 夜培養後的數值作對照。

3.16 非附著依賴性生長 (anchorage-independent growth) 分析

於6 孔細胞培養皿，以 1.5 mL 0.5 % agar 加入等體積 RPMI 細胞培養液及 10%

FBS，作為培養基層，另以 2 mL 0.35% agarose 加入 RPMI 細胞培養液及 10%

FBS，並與 3000 個 C4-2B4 於 40℃下混合，再均勻分布於培養基層上，培養 9-12 天，最後以0.5 mL 0.005% Crystal Violet 染色後，計算細胞群落 (colony) 數量。

3.17 細胞聚合 (aggregation) 分析

將對照細胞L-cell/vector 及轉染 cadherin-11 載體之 L-cell/cad11 以 Cellstripper

（Cellgro, Mediatech, Inc Manassas, VA）將其由培養皿在 37°C 下 10-12 分鐘以釋 出細胞。釋出的細胞重新懸浮於含10% FBS 的 DMEM 細胞培養液。本實驗利用 搖臂混合，並使用血球技術儀計算數目。包含 3 個或更多細胞的細胞團即被認定 為聚合。在 PC3-mm3/MC3T3E-E1 混合聚合實驗中， PC3-mm2 細胞與 MC3T3-E1 分別以DiO 與 DiI 螢光染劑標記。標記後的細胞在含 10 mM CaCl2條件下以trypsin 使細胞從培養皿釋出，並重新懸浮於含有1% BSA、100 units/mL DNase 及含或不 含1 mM CaCl2，並加入20 g/mL 的 IgG 或 mAb 2C7 觀察其對細胞聚合作用之影 響。

3.18 Cadherin-11-his

如同2.3 用於製作 Cadherin-11-Fc (OB-CAD-Fc)的

pBMN-(OB-CAD-Fc)-I-GFP 載體，以 BamHI 與 NotI 限制酶來移除 Fc 的 DNA 片 段。接著再與含有互補序列的7 個 histidine 胺基酸、1 個中止密碼及分別在在 5＇

13

與 3＇末端的 BamHI 和 NotI 限制位置的寡核苷酸（表 2）進行連接，置備之 pBMN-(Cad11-his7)-I-GFP 如 2.3 所述以反轉錄病毒轉載於 293FT 細胞株，收集其 培養液並以 Amicon Ultra-15 離心式過濾器（Millipore, Billerica, MA）進行 10 倍 濃縮後，以Ni-NTA agarose 純化[34]。

抗cadherin-11 單株抗體的製備則提供 cadherin-11-Fc 蛋白委由台灣 Abnova 公 司製備，並以Cad11-his7-coated 96 孔板進行酶聯免疫吸附實驗（ELISA）之單株抗 體篩選。 菌大量產生基因工程蛋白，如GST-EC1, GST-EC1-2, GST-EC1-3, GST-EC1-4，以 lysis buffer (50 mM Tris pH 7.5 , 150 mM NaCl, 0.05% NP-40)及超音波震盪將大腸 桿菌打破，經離心後取其上清液，與glutathione-agarose beads結合，經Elution Buffer (50 mM Tris pH 8.0) 清洗後，離心取得beads，再將beads與含10 mM glutathione的 elution buffer隔夜作用，離心後取得純化後GST結合蛋白。

類似的步驟也用於製備C 末端移除特定數目胺基酸之 EC1-3，以應用於檢測 抗體抗原決定位的突變對其作用之影響。

3.20 製備表達突變 cadherin-11 序列的 L-cell 細胞株

利用overlap extension polymerase chain reaction (OE-PCR) 技術，將 mAb 2C7 抗原決定位位置343-348 胺基酸序列 YSLKVE 以丙氨酸 (analine)取代，製備 6 個 胺基酸的突變體cadherin-11 cDNA (Cad11-6A)，或在 cadherin-11 第 2 及第 4 位置 的色氨酸 (tryptophan)以丙氨酸取代，置備 Cad11-W2A 突變體，前述 OE-PCR 使 用之oligonucleotides 序列詳如表 2。Cad11-6A 及 Cad11-W2A 突變體 cDNA 選殖入 pBMN-I-neo 載體。轉載有 Cad11-6A 及 Cad11-W2A 之 pBMN-I-neo 載體以 2.3 所

14

述方法轉染至293 細胞內，並於 48 小時後收取其細胞培養上清液，此上清液與 L-cell 共同培養後置備穩定轉染細胞株，並加入 G418 (geneticin, aminoglycoside 類 抗生素)於細胞培養液，進行轉染成功細胞篩選。

3.21 老鼠心臟內注射法及其生物光學 (bioluminescence) 測量分析

經左心室心臟注射癌細胞，經由血液循環至轉移部位，以模擬癌症惡化轉移 的過程。取5-6 週大的免疫缺陷小鼠 (SCID mice)，以 isoflurane gas 麻醉並預先將 每隻老鼠依分組先注射30 g IgG 或 mAb 2C7，每隻白鼠再由左心室打入分別已與 30 g IgG 及 mAb 2C7 預先混合 30 分鐘後之 10⁶ 個 PC3-mm2-Luc 細胞[19]，之後 以 bioluminescence imaging 方式確認癌細胞是否如預期隨血液循環至全身，並每 週追蹤後續轉移部位及腫瘤成長情形，持續追蹤三週。影像以 IVIS 系統（Xenogen, Alameda, CA）處理分析。在研究結束時採集股骨與脛骨，並使用 Tissue and Blood DNA kit（Invitrogen, CA）製備 DNA，以人類 Alu 序列專一性寡核苷酸（表 2）進 行PCR 定量。

3.22 統計分析

數據的統計分析利用student’s t test (two-tailed, paired)進行。p 值低於 0.05 則 視為有意義之差異, 數據則以平均值± SD (標準差)呈現。

15