結果

4.1.1 表現有 cadherin-11 的前列腺癌細胞可促使其在 cadherin-11- Fc 塗層培養板的細胞擴展作用。

為確認cadherin-11 對前列腺癌細胞的黏附 (adhesion) 作用的影響，我們以細 胞擴展實驗確認當細胞表現有 cadherin-11 時，是否會促進其細胞擴展作用。利用 沒有表達任何 cadherin 的 L 細胞，將其轉染 cadherin-11 expression vector 成為 L-cell/cad11 細胞， 或轉染 control vector 成為 L-cell/vector 細胞，以同時提供實 驗及對照組。並利用 cadherin-11-Fc 覆蓋的玻片作為培養板，並以 Fc 覆蓋的玻片 作對照。未表現有cadherin-11 的 L-cell/vector 細胞，不論在 cadherin-11-Fc 覆蓋或 Fc 覆蓋的培養板上均呈現圓形形狀（1A 圖）。 相比之下，表現有 cadherin-11 的 L-cell/ cad11 細胞則在 cadherin-11-Fc 覆蓋的培養板上則因與 cadherin-11-Fc 的結合 而呈現細胞擴展，具類似片狀/絲狀偽足 (lamellipodia/filopodia-like) 的扁平型態，

但在Fc 覆蓋的培養板上則呈現圓形形狀（1A 圖）。且其細胞擴展的表現與覆蓋在 培養板上的cadherin-11-Fc 濃度具有劑量依賴性關係，當 cadherin-11-Fc 濃度為 20

g/mL 時觀察到的最大擴展作用，當 cadherin-11-Fc 濃度為 3 g/mL 時可達最大作 用的一半，故後續實驗cadherin-11-Fc 的濃度均設定在 10 g/mL。

為了確認cadherin-11 介導的細胞擴展是否也發生於前列腺癌細胞中，我們將 一種來自LNCaP 前列腺癌細胞亞系，且沒有 cadherin-11 表達性的 C4-2B4 細胞轉 染為具cadherin-11 的表現[32]。單獨與載體轉染的 C4-2B4 細胞被用來當做對照。

與L-cell/cad11 觀察到的結果類似，C4-2B4/cadherin-11 和 cadherin11-Fc 的結合使 得這些細胞出現片狀/絲狀偽足投射的扁平型態的變化（1B 圖），這些細胞在覆蓋 Fc 的培養板上則維持圓形形狀。C4-2B4/vector 在 Fc 或 cadherin-11-Fc 覆蓋的培養 板上則皆未出現型態的改變（1B 圖）。我們更進一步同時檢驗了本身已表現有 cadherin-11 的 PC3-mm2 細胞。在 cadherin-11-Fc 覆蓋的培養板上，PC3-mm2 細胞 展現廣泛的片狀/絲狀偽足投射的扁平型態，而在 Fc 覆蓋的培養板上則未出現此現 象。這些觀察顯示 cadherin-11 是藉由同類親合性互動 (homophilic interaction) 誘 發細胞擴展。

17

4.1.2 Cadherin-11 促使前列腺癌細胞與成骨細胞間黏附作用

為了研究具cadherin-11 表達性的前列腺癌細胞與成骨細胞間的互動，首先檢 測了多種成骨細胞株中 cadherin-11 的表達性；包括 MC3T3-E1、UMR106、

ROS17/2.8 與 Saos2 細胞株。經西方墨點法分析顯示具有高分化性的 UMR106 與 ROS17/2.8 老鼠成骨細胞株 [35, 36]具有高度的 cadherin-11 表現（2A 圖）。

MC3T3-E1 是由老鼠頭蓋骨取得的前驅成骨細胞株[37]，也表達出相對高度的 cadherin-11。 Saos2 是一種已確立、具有多種成骨細胞特性[38] 的人類骨肉瘤細 胞株，則表現中度cadherin-11。而在未誘發的 C2C12 細胞中則未出現 cadherin-11

（2A 圖）。 然而利用 BMP-2 (bone morphogenetic protein 2) 誘發分化成骨細胞[39]

後，C2C12 細胞則表達高度的 cadherin-11。免疫組織化學染色顯示 cadherin-11 位 於成骨細胞間的接合處（2B 圖）。在細胞與物質黏附分析中，以重組cadherin-11-Fc 與這些細胞株結合，其黏附程度與這些細胞株中的 cadherin-11 表達程度具有相關 性。另外，成骨細胞與cadherin-11 的結合則因加入 EDTA 而受到破壞（2C 圖），

代表cadherin-11 同類親合性互動需要鈣離子的輔助。再者， UMR106 與 MC3T3-E1 細胞無法與不同的cadherin（如 cadherin-12-Fc）結合。這些結果顯示，cadherin-11 以鈣離子依賴同類親合性黏附細胞分子呈現於成骨細胞株。

4.1.3 Cadherin-11 促使前列腺癌細胞嵌入 (intercalation) 成骨細胞

為了研究具cadherin-11 表達性的前列腺癌細胞與成骨細胞間的互動，我們以 紅 色 (Tomato) 或 綠 色 （ GFP ） 螢 光 蛋 白 為 視 覺 記 號 轉 染 C4-2B4/vector 及 C4-2B4/cadherin-11 細胞，以觀察前列腺癌細胞與 MC3T3-E1 成骨細胞間互動的型 態。

在 C4-2B4 細胞與 MC3T3-E1 細胞以 2:1 細胞數混合後共同培養，在 C4-2B4/vector 與 MC3T3-E1 細胞共同培養的實驗，可以發現因 C4-2B4/vector 未表 現cadherin-11 而缺少與成骨細胞 MC3T3-E1 的互動，二種細胞各別吸附至培養皿 上，且 C4-2B4/vector 細胞多數呈現圓形形狀 (3A 圖)。在 C4-2B4/cad-11 與 MC3T3-E1 細胞共同培養的實驗，C4-2B4/cadherin-11 則因 cadherin-11 的作用，與

18

MC3T3-E1 有良好的互動，多數吸附於 MC3T3-E1 細胞上 (3B 圖)，且細胞呈現扁 平擴展的形狀，此現象與C4-2B4/cadherin-11 吸附至 cadherin-11-Fc 塗層的培養板 上有相同的表現(1B 圖)。

另外也利用將 C4-2B4 培養於生長滿 MC3T3-E1 細胞的培養皿中，藉以觀察 表現 cadherin-11 與否對於前列腺癌細胞與成骨細胞間的互動作用之影響。分布於 MC3T3-E1 細胞上層的對照 C4-2B4/vector 細胞仍為圓形細胞（4A 圖）。相反地，

C4-2B4/cadherin-11 在與下層成骨細胞互動時則展現延伸/擴展型態（4A 圖）。此延 伸/擴展型態表示 C4-2B4 細胞可能侵入成骨細胞間。為進一步了解這個可能性，

我們製備僅會辨認人類 cadherin-11 而非老鼠 cadherin-11 的單株抗體 4B6 （附圖 6），並在 C4-2B4/cadherin-11/MC3T3-E1 共培養進行免疫染色細胞。在這個共培養 系統中，較小的前列腺癌細胞圓形細胞核可以在DAPI 染色後由較大的橢圓形成骨 細胞細胞核中區分出來（4B 圖）。C4-2B4/cadherin-11 細胞在被抗人類 cadherin-11

抗體染色，滲透至骨細胞層時被發現擴展與延伸為多種片狀/絲狀偽足，但

C4-2B4/cadherin-11 細胞核仍位在成骨細胞層之上（4B 圖）。此外在共軛顯微鏡下，

以 Z 軸方向多階層觀察（5A 圖），可清楚觀察到 C4-2B4/cadherin-11 細胞嵌入 MC3T3-E1 細胞層中，在較下層已清晰可見 MC3T3-E1 細胞核，仍可觀察到 C4-2B4/cadherin-11 細胞偽足狀的侵入 (5B 圖)，但在 C4-2B4/vector 與 MC3T3-E1 細胞共培養試驗，則未見任何抗人類 cadherin-11 抗體染色訊息。綜合這些觀察表 示cadherin-11 的表現，促使前列腺癌細胞與成骨細胞的互動。

4.1.4 Cadherin-11 在前列腺癌細胞移行 (migration) 作用之影響

在細胞擴展分析中觀察到的前列腺癌細胞與cadherin-11 結合時的改變，顯示 與cadherin-11 的結合可能誘發前列腺癌細胞的活動。為確認此是否屬實， 以 Falcon HTS FluoroBlok Inserts 進行實驗，以檢視 cadherin-11 對細胞移行作用的影響。細 胞被放置於事先覆蓋有cadherin11-Fc 或 Fc 的 insert 上方，並觀察其可移行至 insert 下方的細胞數量（6A 圖）。 C4-2B4/cadherin-11 細胞在事先覆蓋有 cadherin-11-Fc 的insert 上方，其移行作用相對在事先僅覆蓋 Fc 的 insert 者高出許多（6A 圖）。同 樣地，在另一本身即表現有cadherin-11 的 PC3-mm2 細胞，利用 cadherin-11 小髮

19

夾型核醣核酸 （shRNA）製備 PC3-mm2-shcad11 細胞，以觀察減少 cadherin-11 內生程度時的移行作用（6A 圖），然後以不規則 shRNA 序列轉染的 PC3-mm2 細 胞 (PC3-mm2-shcontrol)則作為對照（6A 圖）。於事先覆蓋有cadherin-11-Fc 的 insert 上方的PC3-mm2-shcontrol 相較在事先覆蓋 Fc 的 insert 上方的移行率高出許多（6A 圖）。相反地，抑制PC3–mm2 細胞內 cadherin-11 的表現則會大幅減少細胞移行活 動（6A 圖）。這些結果顯示 cadherin-11 介導的黏附作用會增進前列腺癌細胞的移 行作用。

4.1.5 Cadherin-11 在前列腺癌細胞侵襲 (invasion) 作用上之影響

為了檢驗cadherin-11 的表達是否導致細胞侵襲活動的增加，本實驗利用塗有 Matrigel 的 Boyden chamber 進行檢測與觀察。C4-2B4/cadherin-11 細胞能穿過 Matrigel 的細胞數高於 C4-2B4/vector 對照細胞的 10 倍（6B 圖）。相同地，抑制 PC3-mm2 細胞中 cadherin-11 的表現相較於 PC3/shcontrol 對照細胞， PC3-mm2 細 胞的侵襲作用明顯受到抑制（6B 圖）。結果顯示 cadherin-11 的表達，導致前列腺 癌細胞侵襲活動的增加。

4.1.6 Cadherin-11 對於前列腺癌細胞的增殖、存活、docetaxel 治療

我們檢驗了cadherin-11 介導前列腺癌細胞與成骨細胞間的互動，是會否影響 前列腺癌細胞的增殖、存活、或非附著依賴性生長。我們發現C4-2B4/cad11 與對 照 C4-2B4/vector 在細胞的增殖有類似的模式，無論這些細胞是在一般組織培養皿 (7A 圖左欄) 或 MC3T3-E1 成骨細胞層中生長 (7A 圖右欄) 均無顯著差異。

在無血清飢餓處理 (serum starvation) 與 docetaxel 給藥的存活測試中，

C4-2B4/ cadh11 不會因表現有 cadherin-11 而有任何存活優勢（7B, 7C 圖）。我們也 發現 cadherin-11 的表達性也不會影響非附著依賴性生長 (anchorage-independent growth) 細胞 (7D 圖)。

4.1.7 Cadherin-11 介導的前列腺癌細胞移行與侵襲作用與其細胞內

20

區域 (cytoplasmic domain) 相關

Cadherin-11 增進前列腺癌細胞的移行與侵襲作用，顯示 cadherin-11 的功能不 僅止提供前列腺癌細胞與成骨細胞間的黏附作用，應該有其他更進一步的功能。

隨著同類親合性黏附作用，cadherin-11 可能與細胞內蛋白分子互動而促進細胞移 行與侵襲作用的增加。在E-cadherin 的研究上已確認 p120-catenin 及-catenin 分別 會與細胞外靠膜區域 (juxtamembrane domain , JMD) [40, 41]及 E-cadherin 的 C 末端 [42, 43]結合。為驗證這些細胞內的區域是否為 cadherin-11 介導細胞移行與侵襲的 重 要 因 素 。 本 實 驗 利 用 細 胞 外 靠 膜 區 域 中 帶 有 缺 陷 的 cadherin-11 突 變 體 (cad11-JMD) 或 C 末端 catenin 結合位置突變 (cad11-CBS) (8A 圖) 進行 C4-2B4 細胞轉染。以西方墨點法檢視顯示這些 cadherin-11 的缺陷突變體均表現有 cadherin-11，但相較於原生型，有較小的分子量 (8B 圖左側圖)。此外，抗 cadherin-11 陽性蛋白與其對應的較小分子質量可能因蛋白質水解的關係，在原生 cadherin-11 與表現突變的cadherin-11 中皆被發現。以抗人類 cadherin-11 4B6 抗體進行二級抗 體染色的C4-2B4/cadherin-11、C4-2B/JMD 與 C4-2B4/CBS 細胞在螢光活性細 胞分析儀 (FACS) 分析中，比起僅用二級抗體染色的細胞有更顯著的螢光表現，

顯 示 C4-2B/JMD 與 C4-2B4/CBS 二種突變細胞皆於細胞表面上表現有 cadherin-11 (8C 圖)。同時利用免疫沉澱分析法與西方墨點法檢驗 p120-catenin 及

-catenin 與突變的 cadherin-11 蛋白的結合，原生型 cadherin-11 同時與 p120-catenin 及-catenin 結合，Cad11-JMD 會喪失與 p120-catenin 結合能力，而 Cad11-CBS 則喪失與-catenin 結合的能力(8B 右側圖)。這些結果顯示 p120-catenin 及-catenin 為 cadherin-11 細胞質區域的結合蛋白，並傳遞後續的分子信號，且可能成為前列

C4-2B/JMD 與 C4-2B4/CBS 細胞同時在與成骨細胞層的互動中表現出延伸擴

21

展型態，而對照C4-2B4/vector 細胞則維持圓形 (9B 圖)。與 4B6 cadherin-11 抗體 免疫組化染色的共培養細胞共軛顯微鏡多層次分析結果顯示 C4-2B/JMD 與 C4-2B4/CBS 細胞可以嵌入至 MC3T3-E1 成骨細胞層中。這些結果顯示 JMD 與 CBS 區域皆不是 cadherin-11 介導的細胞擴展或嵌入作用所需的。相反地，在檢驗 C4-2B/JMD 與 C4-2B4/CBS 細胞之移行或侵襲作用時，我們發現抑制 JMD 或CBS 區域的表現，將會遏止 cadherin-11 介導的細胞移行 (10A 圖) 及侵襲 (10B 圖)。這些結果表示 JMD 和 CBS 區域皆與導致前列腺癌細胞移行與侵襲的訊息傳 遞相關。

4.1.8 Cadherin-11 對於 C4-2B4 細胞基因表現的影響

Cadherin-11 對於細胞移行及侵襲活動的影響與其細胞內區塊所能結合的訊息 傳遞分子相關，同樣地推測，Cadherin-11 可能影響 C4-2B4 的基因表現，進而改變 其訊息傳遞分子及細胞活性。以基因陣列分析，比較C4-2B/vector、C4-2B/cad-11、

C4-2B/JMD 與 C4-2B4/CBS 的基因表現，分析結果顯示有一群獨特的基因因 為 cadherin-11 的表現而特別增加或減少，當針對與細胞侵襲作用相關基因 (invasion-related genes)作分析時，IGF-1, MMP7, Rac1, CD9, integrin beta2, MMP15 及junction plakoglobin 為最主要的基因表現 (圖 11) ，當以細胞移行作用相關基因 (migration-related genes)作分析時，myeloid differentiation primary response gene (Myd88) 及 Notch1 為最主要的基因表現 (圖 12)。以上結果顯示，前列腺癌細胞 cadherin-11 的表現導致許多細胞移行及侵襲相關基因的表現特別的增加。

22

Cadherin-11 是一種主要存於成骨細胞與滑膜細胞內的間葉型 (mesenchymal )

Cadherin-11 是一種主要存於成骨細胞與滑膜細胞內的間葉型 (mesenchymal )