一、血清肌酸酐（creatinine）濃度之測定
本實驗使用商業檢驗套組分析（Creatinine Colorimetric / Fluorometric Assay Kit, Biovision USA.），其原理為在測定中生物體液中肌酸酐經肌酸酐酶轉化為肌氨酸，因 肌氨酸特異性氧化與探針反應形成深紅色之複合物，於波長570mm下測定吸光值，即可 推測血液肌酸酐濃度。
(1) 將血清準備放入96孔盤中，肌酸酐標準品（Creatinine Standard）用100 µl dH2O配 置100mM並儲存於- 20oC冷凍。
(2) standard curve preparation，將10 µl肌酸酐（10倍稀釋）標準品與990 µl的Assay Buffer 混勻1 nmol/µl，並在96孔盤內分別加入0、2、4、6、8和10µl之溶液，最後再加入 Assay Buffer調整至50µl，如果需要更敏感的測定，可利用fluorescence 將溶液稀釋 10倍。
(3) Reaction Mix：加入Assay Buffer 42 µl、Creatinase 2 µl、Creatininase 2 µl、Enzyme Mix2
µl、Creatinine Probe 2 µl ，混合成50 µl的反應混合物。
(4) 將上清液和Assay Buffer混合成50 µl再加入反應混合物（步驟三）共100 µl配置於 96孔盤內，在37oC 培養一小時，於波長570nm下測定吸光值，並帶入公式換算血 清creatinine濃度。
二、尿素（Urea）測定
本實驗使用商業檢驗套組分析（Urea Colorimetric Assay Kit, Biovision USA.），尿 素在酶存在下與化合物反應形成與OxiRed探針反應產生顏色（570mn）。
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（1）Probe：使用前須放置室溫下，儲存於-20oC，避光和潮濕環境。Enzyme Mix, Developer and Converting Enzyme： 分別溶於220µl分析緩衝液中。 分等容易以防止重複解 凍。平時放入-20oC儲存。
（2）Standard Curve Preparation： 將尿素標準加入5µl的100µm尿素標準稀釋到995µl的 DＤH2O，使尿素標準稀釋至0.5 mm，混合均勻，分別加入0，2，4、6，8，10µL 最後調整體積至50µL。
（3）Sample Preparations：血清直接加入96孔盤中，測定體積為50µL。
（4）Reaction Mix：測驗之Sample分別加入42µl Assay Buffer、2µl OxiRed Probe、2µl Enzyme Mix、2 µl Developer、2µl cCoverter Enzyme，Sample control加入入44 µl Assay Buffer、 2 µl OxiRed Probe、2 µl Enzyme Mix、2 µl Developer。
（5）Measurement： 以570mn吸光值進行測定。
三、組織切片染色
（1） H＆E stain
小鼠犧牲後，取腎臟組織，浸泡在10%中性福馬林固定，進行低濃度到高濃度
（50%~100%）脫水，在使用二甲苯（xylene）置換組織中的酒精，浸置兩小時、隔一 小時再換一次，以二甲苯隔夜處理隔夜處理後，在更換石蠟浸潤並滲透組織中進行包埋，
包埋完成之蠟塊使用迴轉式切片機（Micro）進行切片，組織薄片（5µm）黏貼於玻片上，
玻片製作完成後進行二甲苯脫蠟，酒精復水，浸泡Hematoxylin3分鐘，清洗浸泡Eosin約 30s，清洗後再進行低濃度到高濃度酒精脫水動作，完成後封片待乾即可拍照留存。
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之後統計出每組平均值(Wolf et al., 2005)，使用半定量評分系統評估每顆腎小球係膜擴 張範圍，評分範圍0-4分：0級為;無損傷、1級為;<25%、2級為;25-50%、三級為;50-75%、
4級為>75%<，使用光學顯微鏡400x倍率下隨機挑選15顆腎小球（4隻/每組），使用image J生物影像進行分析(Moon et al., 2016)。
五、蛋白質萃取
將腎臟與lysis buffer作用，以均質機研磨組織。lysis buffer 含有 50 mM HEPES （pH 7.4），EGTA（pH 8.0），0.2 % NP-40，10 mM EDTA （pH 8.0），15 mM Sodium pyrophosphate，100 mM β-glycerophosphate，50 mM NaF，150 mM NaCl，2 mM Sodium
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orthvanadate，1 mMPMSF 及蛋白酶抑制劑（protease inhibitor：含有ABESF、aprotinin、
leupeptin、EDTA、E-64 protease inhibitor），置於震盪器在 4˚C環境下震盪30分鐘，在 使用離心機13000 rpm 15分鐘，離心後將上清液取出保存進行後續實驗。
接著將SDS-PAGE上的蛋白轉漬到Nitrocellulose membranes上，先將具有海綿網的 轉印夾內置入2張濾紙，浸在transfer buffer中，並取膠體除去，上半stacking gel的部分，
轉印夾內依序為海綿→濾紙→Nitrocellulose membranes→濾紙→海綿。疊好後壓平並確 定膠體、濾紙和membrane沒有氣泡純在，並將轉印夾置入槽內，以100伏特進行90分鐘 進行轉印。將membranes放入含有 5% BSA與 0.1 % Tween 20 之TBS 混合溶液培養 60 分鐘後，依受測蛋白的特性，調整一級抗體的比例（primary antibody） phosphor-AMPKα
（Thr171）-antibody、anti-AMPKα、anti-SIRT1、Actin、anti-PGC1-α、phosphor- NF-κB、
anti-NF-κB、anti-IκB-α，放置4°C環境進行震盪作用（不得少於八小時），作用完畢後，
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清洗一級抗體，再加入二級抗體，放置室溫震盪作用約1小時。最後完成清洗程序後，
加入 ECL kit 進行呈色，利用LAS-3000冷光照相系統進行顯影分析。