有氧運動訓練調控能量代謝路徑對糖尿病db/db小鼠腎功能之影響

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(1)國立臺灣師範大學運動與休閒學院體育學系碩士學位論文. 有氧運動訓練調控能量代謝路徑對糖尿病 db/db 小鼠腎功能之影響. 研究生：高浩瀚指導教授：劉宏文. 中華民國 108 年 8 月中華民國臺北市.

(2) 有氧運動訓練調控能量代謝路徑對糖尿病 db/db 小鼠腎功能之影響 2019 年 8 月研究生：高浩瀚指導教授：劉宏文. 摘要 Sirtuin 1 （ SIRT1 ）、 AMP-activated protein kinase （ AMPK ）及 peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-α （PGC1-α）為細胞內調節能量代謝的關鍵樞紐，AMPKα/SIRT1/PGC1α 路經的受損伴隨粒線體失能是導致糖尿病腎臟病的機轉之一。長期規律有氧運動可以改善早期糖尿病腎臟病變，避免病症繼續惡化。然而，運動訓練經由 AMPKα/SIRT1/PGC1α 路徑改善糖尿病腎病變的機制，目前仍尚未釐清。本研究假設為有氧運動訓練能上調腎臟中代謝路徑以及同時抑制發炎路徑的活化，達到改善早期糖尿病腎病變的效果。方法：本研究使用糖尿病動物模式，5 週齡 BKS.CgDock7m +/+ Leprdb/J（db/db）小鼠購至國家實驗動物中心，實驗動物在適應一周後，隨機分配控制組（n=8）及運動組（n=8）。運動處方：跑步速度為 5.2m/min，每天運動 1 小時，每週訓練 5 天，共進行 8 週。運動訓練結束後將小鼠犧牲，以 PAS 染色法觀察腎臟組織型態，西方墨點法（ Western blot analyses ）分析能量代謝（AMPKα/SIRT1/PGC1-α）及發炎路徑（IκB-α/NF-κB）。結果：八週有氧運動訓練後可以改善 db/db 小鼠腎絲球基質膜擴張，並增加 SIRT1 蛋白表現及 AMPKα 活性，同時抑制 NF-κB 磷酸化。IκB-α、PGC1-α 在運動組及控制組間無顯差異。結論：本研究證實有氧運動訓練是透過活化能量代謝路徑和抑制發炎路徑來延緩糖尿病腎病變惡化。. 關鍵字：腎病變、SIRT1、AMPKα、PGC1-α、發炎路徑 i.

(3) Effects of aerobic exercise training on regulation of renal energy metabolism by activating AMPK-SIRT1 pathway in diabetic db/db mice August, 2019 Author: Kao, Hao-Han Advisor: Liu, Hung-Wen. Abstract The AMPK-SIRT1-PGC-1α axis has a crucial role in regulating the energy metabolism and mitochondrial function. Downregulation of AMPK/SIRT1/PGC1α pathway is the mechanism leading to diabetic nephropathy. The purpose of this study was to determine whether exercise training upregulates the energy metabolism pathway and inhibits inflammatory pathway, thereby preventing the early stages of diabetic nephropathy. Male diabetic（db/db）mice were used in the present study. At the age of 5 weeks, db/db mice were divided into two groups: db/db mice (n =8) with exercise training for 8 weeks (db/db + Ex) and db/db (n = 8) remained sedentary throughout the study. Aerobic exercise training (5.2 m/min, 1 h/day, and 5 days/week for a total of 8 weeks) was started from 5-week-old. The results showed that decreased the glomerular matrix expansion score, increased SIRT1 protein expression and AMPKα activity, and decreased NF-κB phosphorylation were observed in db/db + Ex compared with db/db mice. There were no significant changes in IκB-α and PGC1-α. Therefore, the present study confirms that aerobic exercise training alleviates the progression of diabetic nephropathy by activating AMPK-SIRT1 pathway and inhibiting NF-κB activity.. Keywords：Diabetic Nephropathy、SIRT1、AMPKα、PGC1-α、Inflammatory pathway. ii.

(4) 謝誌在研究所這段日子裡，跟著宏文老師兩年多的學習下，我不敢說自己學到很多，但比起大學時候的自己，能從“如何做研究”的過程中思考並解決問題，且有條列、邏輯性地思考問題本身，對我是相當大的轉變，老師曾說訊息傳遞路徑之間的調控是他覺得迷人的地方，這一席話想必也是老師在美國唸書時所扎下深厚的科學基礎，才能參透這些分子的奧秘，而我一路從體育教學瞬間跳進科學領域，背景知識上真的有一大片空白需要填補，光是閱讀原文，理解圖表上之間的影響，最後轉化成自己想法撰寫到論文上，對我來說真的不容易，喔還有！超級枯燥乏味的實驗無限循環，沒有做出結果真的就像是卡在遊戲某關裡無法出來一樣不斷重覆下去，內心不知已經歷多少波折，結束時，霎那間自己好像也滄老許多，這段歷程許多負面情緒無形間也影響到自己和周遭的人，也因為如此，也正把自己推向人生分水嶺，當然！實驗室裡還是有趣的地方，老師常分享他在國外求學的過程，讓我對國外有更多想像，我就像搭著這些科學家們的肩膀，觀看他們闡述及產出知識真的耐人尋味，雖然只略懂皮毛，但有幸能站在知識的浪尖上學習真的很棒，最後我想感謝很多人，謝謝宏文老師的指導，也謝謝恆儒、景峰、一民老師，真希望能多再跟你們學一點哈哈！！還有謝謝實驗室夥伴，啟行辛苦啦！謝謝玨生、柏穎、士峰同學間彼此相互加油打氣，還有政廷在課業與課外幫助我好多，就像大哥一樣，照亮我人生燭火，最後我想感謝芳瑜，在師大遇見妳，絕對是我生命中一段美好回憶，我會永遠記得這些日子，沒有這些日子的陪伴、百忙之餘還一直幫忙我，細數相處時光，心中滿滿的感謝，如果沒有妳，我早已半途而廢，但願時間能走慢點。如果有讓我重新選擇一次，我想一切會不同。也許未來我會很平庸、也或許有幸地能找到人生志業，但不管怎樣，仍須全力以赴、永不言敗。 iii.

(5) 目次. 摘要............................................................................................................................ i. Abstract .................................................................................................................... ii. 謝誌..........................................................................................................................iii. 目次.......................................................................................................................... iv. 圖次.......................................................................................................................... vi. 第壹章緒論............................................................................................................. 1 第一節前言........................................................................................................................... 1 第二節研究目的................................................................................................................... 5 第三節研究假設................................................................................................................... 5 第四節名詞操作性定義....................................................................................................... 5 第五節研究限制................................................................................................................... 6 第六節研究的價值............................................................................................................... 7 iv.

(6) 第貳章文獻探討..................................................................................................... 8 第一節糖尿病腎病變形成及致病機轉............................................................................... 8 第二節能量代謝失衡......................................................................................................... 12 第三節運動訓練預防糖尿病腎病變之分子機致制......................................................... 13. 第參章研究方法................................................................................................... 19 第一節實驗動物................................................................................................................. 19 第二節實驗時間與地點..................................................................................................... 19 第三節實驗設計................................................................................................................. 19 第四節實驗方法與步驟..................................................................................................... 20 第五節資料分析................................................................................................................. 24. 第肆章實驗結果................................................................................................... 26. 第伍章討論與結論............................................................................................... 33. 第陸章結論........................................................................................................... 36. 引用文獻................................................................................................................. 37. v.

(7) 圖次圖 1 運動訓練對於糖尿病小鼠血清生化值影響。 ............................................. 26 圖 2 運動訓練對於糖尿病小鼠腎絲球體組織形態之影響（a-g） .................... 27 圖 3（A）以 PAS 染色圖計算腎絲球截面積（B）以 PAS 染色圖分析腎絲球基質膜擴張分數.................................................................................................. 28 圖 4 運動訓練對於 SIRT1-AMPKα-PGC1α路徑之影響 ................................... 30 圖 5 運動訓練對於 NF-κB 和 IκB-α路徑之影響 ................................................ 31. vi.

(8) 第壹章緒論. 第一節前言糖尿病（Diabetes mellitus）為全球常見的慢性代謝疾病之一，由於現代人飲食過剩，及不良飲食習慣同時缺乏身體活動，罹患糖尿病的風險也大幅提高，而糖尿病所引起多種慢性併發症好發於有多年病史的糖尿病患者。在正常情況，一般人飲食後身體會將食物中的醣類消化分解成葡萄糖，此時胰島素會大量分泌可幫助血液中葡萄糖進入週邊組織做為能量來源，亦可降低血糖，但糖尿病患者會有胰臟β細胞分泌不足或無法正常分泌，胰島素敏感性降低會使血液中葡萄糖無法正常被身體利用或儲存，一部分的糖會經由尿液排出，一部分的糖滯留在血液中，當身體組織長期處於高血糖的環境中也會引起諸多器官病變，如高血壓、高血糖、腎臟疾病及心臟血管併發症等。. 根據美國糖尿病學會（American Diabetes Association）的診斷上，如果符合以下一項條件，且前三項重覆檢驗至少兩次以上，即可診斷為糖尿病：1.糖化血色素（A1C）≥6.5%， 2.禁食至少8小時未有任何熱量攝取，血漿血糖≥126mg/dL 3.口服葡萄糖耐受度試驗（oral glucose tolerance test, OGTT）2小時後血漿血糖≥200mg/dl 4.典型高血糖症狀或高血糖現象（hyperglycemic crisis）且隨機血糖≥200mg/dl（American Diabetes Association. 2013; 黃蘭菁、李貫廷、李育霖、楊偉勛、黃國晉，2013）。. 二型糖尿病（ Diabetes mellitus type 2 ）也稱非胰島素依賴型糖尿病（Non-Insulin-dependent diabetes mellitus）約有90％糖尿病病患皆屬於此類型糖尿病，好發於40歲以上的病人，尤其以飲食過量、活動量不足、肥胖者居多，二型糖尿病患者 1.

(9) 通常伴隨著高血脂、血壓及血糖等危險因子，其成因爲人體細胞組織出現胰島素阻抗（Insulin resistance），無法有效使血液中葡萄糖合成肝醣與脂肪，為了讓葡萄糖能被有效轉變為能量使用，此時胰臟中β細胞仍感應到血液中高血糖的情形，所以持續分泌更多胰島素，但仍無法降低血液中葡萄糖濃度，長期下來便導致細胞組織的胰島素阻抗性增加，其下游相關訊息傳遞路徑之分子也出現問題，無法有效傳遞訊息，然而無論是第一型或是第二型糖尿病，沒有適當控制血糖，就會引發其他病症如神經病變、視網膜病變、腎臟病變引起尿毒症，血管疾病及微血管病變。目前二型糖尿病治療主要以藥物、運動及飲食來控制病情，常見的口服降血糖藥物有Metformin二甲雙胍、Thiazolidinedione （TZD）、磺胺尿素類（sulfonylurea）等，各類型藥物作用機制也不同（Turner RC et al, 1999），TZD能夠活化細胞核轉錄因子PPARγ刺激脂肪細胞受體，促使脂肪形成，同時部分釋放脂聯素（Adiponectin）的表達能並活化AMP-actived protein kinase（AMPK），加強胰島素敏感使細胞內葡萄糖運輸蛋白GLUT-4增加，但是在藥物治療有其副作用之風險，像是造成患者肥胖或心臟衰竭、水腫、肝毒性等(LeBrasseur et al., 2006)。二甲雙胍metformin使用廣泛、藥費成本較低、不會增加患者體重，更常推薦為治療二型糖料病的第一線用藥，metformin在臨床應用上能減少肝臟醣質新生作用及降低血液中葡萄糖，增加胰島素敏感性，在骨骼肌上metformin能活化AMPKα，再活化下游aPKC使GLUT4 轉位至細胞膜上，可增加細胞對促進葡糖糖吸收，能促進脂肪酸氧化，且防止葡萄糖糖毒性、脂毒性、發炎反應情況發生(Zhou et al., 2001)，綜合上述結果可以延緩糖尿病病理惡化。. 第一型糖尿病（Diabetes mellitus type 1）又稱胰島素依賴型糖尿病（Insulin-dependent diabetes mellitus），此類型患者大約佔所有糖尿病患的5%，是一種自體免疫疾病因β細 2.

(10) 胞破壞造成患者體內胰島素嚴重缺乏，當人體缺乏胰島素時，血液中葡萄糖濃度過高，無法被細胞組織有效轉化為能量使用，故須每天注射胰島素來維持血糖。. 糖尿病腎病變(Diabetic nephropathy)，也是造成末期腎臟病（end-stage renal disease, ESRD）的主要原因。根據美國腎臟資料系統（USRDS）2015年報告中，在2013年台灣末期腎病患者（ESRD）盛行率為3138(人/百萬人)及發病率456（人/百萬人/年），不論發病率及盛行率均列世界第一(Collins, Foley, Gilbertson, & Chen, 2015)，糖尿病腎病成因包括高血糖（Hyperglycemia）、活性氧化物（reactive oxygen species, ROS） -蛋白激C （protein kinase C pathway）路徑活化，當腎臟長期處於高血糖濃度時會使腎小球產生結構性變化，增加發炎反應和粒線體功能失調(Inoguchi et al., 2003; Rosca et al., 2005)，使基底膜增厚、腎絲球細胞係膜細胞擴張、動脈阻塞，並增加高度糖化終產物（advanced glycation end-product, AGE），然而最終糖化蛋白會誘導氧化壓力及抗氧化系統的改變，抗氧化系統無法因應過多的氧化壓力，將造成細胞凋亡路徑（apoptosis）的活化，使足細胞凋亡降低腎臟功能，最後導致腎臟病變(Goldin, Beckman, Schmidt, & Creager, 2006)。相較於先前研究多強調氧化壓力及細胞凋亡對腎功能影響，然而，近來粒線體失能在形成糖尿病腎病變所扮演的角色更凸顯糖尿病腎病變形成的複雜性(Hallan & Sharma, 2016)，研究指出，調節粒線體生合成作用的蛋白例如, sirtuin 1（SIRT1）、AMP-activated protein kinase （AMPKα）、peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-α （PGC1-α），在糖尿病動物實驗中發現，此路經會受到抑制間使得粒線體功能受損，細胞中氧化物質增加也導致腎病變的發生(Yacoub, Lee, & He, 2014)。針對代謝路徑動物實驗的研究發現，藥物和營養補充劑治療能夠刺激腎臟、骨骼肌AMPKα/SIRT1活性，隨後活化下游PGC1-α表現，改善粒線體生合成作用，使粒線體內Mn-SOD功能正常清除 3.

(11) 活性氧化物的產生，改善腎臟功能(Kitada, Kume, Imaizumi, & Koya, 2011) (Kim et al., 2013)。. 在美國運動醫學會（ACSM）運動處方中身體活動（physical activity）一直都是預防二型糖尿病的基石，身體活動能夠降低二型糖尿病的危險因子，增加胰島素敏感度、降低高血壓、高血糖。長期規律運動也是改善糖尿病腎病變的建議處方，以長期規律運動低強度、每週三次累積至少150分鐘的模式為建議標準，能夠改善初期（2、3 期）慢性腎臟病變患者腎臟的功能，而運動訓練能活化能量代謝路徑（AMPKα /SIRT1/PGC1-α）調控粒線體生合成作用，刺激骨骼肌粒線體密度、同時刺激粒線體呼吸鏈效率進而增進糖類、脂質氧化能力。過去許多糖尿病腎病變相關文獻較針對，氧化壓力及抗氧化系統、骨骼肌能量系統等，運動訓練對於糖尿病腎病變的保護機制至今仍未相關研究，適度有氧訓練是否可以活化代謝路徑（AMPKα /SIRT1/PGC1-α）防止粒線體失能並改善糖尿腎病變是本研究所欲進行探討的。對於糖尿病患者有氧訓練的介入有相當的研究限制，因此，本研究使用糖尿病動物模式，4週齡BKS.Cg-Dock7m +/+ Leprdb/J（db/db）小鼠作為實驗材料，以8週有氧運動訓練介入可活化能量代謝路徑同時抑制發炎路徑活化，改善腎臟組織病理之影響及功能避免進一步惡化。. 4.

(12) 第二節研究目的一、本研究探討8週有氧運動訓練對於糖尿病db/db小鼠腎臟AMPKα/SIRT1/PGC1-α路徑影響。二、探討8週有氧運動訓練對於糖尿病db/db小鼠血液生化值之影響。. 三、探討8週有氧運動訓練對於糖尿病db/db小鼠組織學病理學切片之影響。. 第三節研究假設根據上述的研究目的，本研究的研究假設如下：. 一、有氧運動訓練能夠活化糖尿病db/db小鼠腎臟AMPKα/SIRT1/PGC1-α的表達。. 二、有氧運動訓練能夠降低糖尿病db/db小鼠之血液生化指標。. 三、有氧運動訓練能改善糖尿病db/db小鼠腎臟肥大、腎絲球基質膜擴張。. 第四節名詞操作性定義一、有氧運動訓練本研究所稱之有氧運動訓練為動物於跑步機上，以每分鐘5.2公尺速度（5.2m/min）訓練1小時，每週訓練5天，共進行8週(Ghosh et al., 2009)。. 二、能量代謝路徑本研究所稱之代謝路徑指訊息傳遞路徑為（signal transduction pathway），silence information regulator 1; SIRT1 、 AMP-activated protein kinase; AMPKa 、 peroxisome 5.

(13) proliferator-activated receptor gamma coactivator 1; PGC1-a。當SIRT1、AMPKa可經由去乙醯化和磷酸化作用刺激PGC1-a活化，PGC1-a可作為調控粒線體生合成作用的轉錄因子。. 三、發炎路徑本研究稱發炎訊息傳遞路徑為：NF-κB（nuclear factor kappa B, NF-κB）作為調控細胞發炎與細胞凋亡的轉錄因子，通常在細胞質中 NF-κB 受到抑制蛋白IκB-α （inhibitor of kappa B, IκB-α）的抑制，當細胞內氧化壓力增加時能刺激 IκB-α 蛋白降解，使NF-κB 活化易位至細胞核啟動基因轉錄作用誘發 TNF-α 和 IL-6 表達增加，觸動細胞的發炎反應導致細胞凋亡。. 四、糖尿病db/db小鼠. 本研究所稱糖尿病db/db小鼠，以國家實驗研究院-國家實驗動物中心之定義作為參考，將「BKS.Cg-Dock7m +/+ Leprdb/J（db/db）糖尿病小鼠」定義為：血漿中胰島素濃度於 10-14 日齡便開始上升，於 3-4 週齡開始肥胖，血糖於 4-8 週齡開始上升。具糖尿病表現型：高胰島素血症、高血糖、糖耐受度異常、胰島形態異常周圍神經病變（國家實驗研究院, 2017）。. 第五節研究限制本實驗主要以db/db小鼠的動物模式為實驗對象，訓練處方以有小鼠跑步機作為運動訓練之模式，研究結果要推估至人可能有些許差異，但仍具有相當程度參考及應用價值。 6.

(14) 第六節研究的價值糖尿病患如未能妥善控制血糖，易增加糖尿病腎病變的發生率及洗腎風險，洗腎人口的增加也對於國家醫療支出也是大筆開銷，臨床上也以證實運動訓練能有效緩解糖尿病腎病變進入洗腎階段，但運動延緩糖尿病腎病機制仍完全暸解。一、有氧運動訓練對於延緩糖尿病腎病變之間的關聯已經確立，但是有氧運動訓練能延緩糖尿病腎病變之分子機制尚未有相關研究。二、針對糖尿病腎病變動物模型以低強度有氧運動訓練處方來評估或有效改善之糖尿病腎病變之預防/治療標的，同時作為運動改善糖尿病腎病變的科學根據。. 7.

(15) 第貳章文獻探討. 第一節糖尿病腎病變形成及致病機轉一、糖尿病腎病變分期罹患糖尿病（diabetes mellitus）的人口比例也節節上升，目前全球估計約有4億2,200 萬人罹患糖尿病，國內18歲以上糖尿病盛行率為11.8%，約有227萬名糖尿病患，糖尿病也高居我國十大死因第五名，換算每小時就有1人死於糖尿病，國內糖尿病患者洗腎花費（每年美金兩萬七千元）較非糖尿病患者花費高12%之多主要原因也是糖尿病患者住院花費較高。（衛生福利部統計處，2016），糖尿病腎病變是糖尿病併發症其中之一，不論是第一型或第二型糖尿病患者都有罹患糖尿病腎病變發生的可能，糖尿病腎病變患者會依照腎臟功能受損的程度分為五期(Mogensen, Christensen, & Vittinghus, 1983)，檢測方式會以測量血液中肌酸酐含量推估腎絲球過濾率（glomerular filtration rate, eGFR）作為依據（蔡東華等人，2017；李文欽等人，2013）。（一）. 第一期. 糖尿病腎病患者初期特徵為腎絲球過濾升（Hypertrophic-hyperfiltration）、以及腎臟血流量上升也導致腎小球壓力增加，出現微量蛋白尿等症狀，腎絲球過濾率為eGFR 過濾值≧90ml/min/1.73m2，但在光學顯微鏡檢查中腎絲球僅見輕微並不見特異性病理變化，腎功能仍正常。. （二）. 第二期. 8.

(16) 此階段開始，eGFR過濾值為60~89 ml/min/1.73m2，此階段也稱”瀰漫性腎小球硬化” （diffuse diabetic glomerulosclerosis）病徵會出現輕微基底膜增厚（basement membrane thickening ）、腎臟內係膜細胞增生，微量尿白蛋白排泄率（urinary albumin excretion rate, UAER） <30 mg/day，通常定義間質細胞擴張（Mesangial expansion）為係膜中細胞外間質增加，使得腎小球小葉（glomerulus lobules）間隙寬度至少超過兩個腎小球細胞核，推斷輕度、嚴重係膜擴張（Mesangial expansion）之間差異在組織切片中，會依據擴張區域小於或大於毛細血管面積來定義輕微或重度，通常在第一、二期患者為可逆性之初期糖尿病腎病變，患者須定期篩檢腎臟功能，積極控制血壓、血糖並降低微蛋白尿，仍然可以改善腎功能和降低心血管疾病。（三）. 第三期. 此階段腎功能持續惡化（basement membrane thickening, mesangial expansion），腎絲球過濾率下降，eGFR：30~59 ml/min/1.73m2，並依 eGFR45 上與下分成 3a （GFR： 45~59）與 3b （GFR：30~44）並給予不同處置，尿白蛋白排泄速率（urinary albumin excretion , UAER）為 30∼300 mg/day，血壓上升伴隨著心血管疾病的發生。（四）. 第四期. 重度腎功能衰竭，腎臟已明顯受損，腎絲球過濾率為eGFR：15-29 ml/min/1.73m2，尿白蛋白排泄速率（urinary albumin excretion , UAER）超過300 mg/day，患有高血壓、高血脂，容易疲勞等症狀，需主動配合治療延緩進入末期衰竭。（五）. 第五期. 當患者進入第五期時，已進入腎衰竭期（end-stage renal disease），腎絲球過濾率eGFR 降至15 ml/min以下，血清肌酸酐5mg/dl以上，腎功能以無法排除體內代謝廢物及水份，. 9.

(17) 病患併有水腫、食慾不振、疲倦、高血壓、貧血等症狀，酸血症等病症，需要腎臟替代療法進行治療，如果病情嚴重患者達到無法進行日常生活所需，進行腎臟移植洗腎是唯一治療方式（蔡東華等人，2017）。在糖尿病腎病變患者通常在2、3期的比例為多數，佔此類型病患約七成左右，在早期病變階段（2、3期）(Breyer et al., 2005)，透過藥物及輔助治療有效延緩糖尿病腎病變，除人體臨床試驗對於糖尿病腎病變致病機轉及治療標的以累積相當的證據，動物模式以二型糖尿病db/db小鼠作為模式，因為瘦體素的基因突變（leptin receptor gene）誘導高血糖、肥胖、胰島素阻抗、腎絲球肥大、白蛋白尿的出現，與人類腎病變病理相似，使得 db/db小鼠成為研究致病機轉及在研發新穎治療方式時是常用的模型，下一章節主要探討腎病變之形成機制及藥物治療改善糖尿病腎病變。二、致病機轉高血糖（Hyperglycemia）目前認為是糖尿病併發正產生的重要因素，當病患長期處在高血糖狀態下（High glucose condition），會使細胞內訊息傳導路徑活化、及諸多病理上的改變，糖類羧基與蛋白質的氨基結合經由梅納反應（Maillard reaction）最後形成高度糖化終產物（advanced glycation end-products ; AGEs），當高血糖症（Hyperglycemia）病發會加速高度糖化終產物AGEs生成以及多元醇路徑被活化（polyol pathway，多元醇路徑中醛糖還原酶AR（aldose reductase）借助NADPH將細胞內葡萄糖還原成山梨醇（sorbitol），再經由山梨醇脫氫酶、及輔酶NAD+氧化成果糖（fructose），多元醇路徑被活化的結果會使NADPH及NAD+為體內兩個氧化還原作用的輔酶（co-factor）減少，使榖胱甘肽（glutathione）合成受阻也弱化了抗氧化功能）(Chung, 2003)。這一連串的反應也大量累積自由基生成，造成腎臟內細胞氧化壓力、發炎反應轉錄因子活化、例如. 10.

(18) NF-κB 及 tumor necrosis factor-α (TNF-α) 。高糖環境下也改變腎臟細胞外間質（extracellular matrix; ECM）生理功能及特異性病理變化，腎絲球間質細胞（mesangial cells）會分泌乙型轉型生長因子（transforming growth factorβ; TGF-β），當第一型轉型生長因子（TGF-β1）活化促使腎絲球間質增生，腎小管近端細胞ERK及p38/MAPK活化並增進TGF-β表達，在動物模式中也可以發現過度表現的TGF-β1，會引發尿蛋白、白蛋白尿、細胞凋亡（apoptosis）腎絲球硬化、腎間質纖維化（fibrosis and sclerosis）的發生(Isono, Chen, Hong, Iglesias-de la Cruz, & Ziyadeh, 2002)。Mishra等人研究結果發現在高糖環境（High glucose）下誘導內源性細胞凋亡（apoptosis）路徑，粒線體釋放 cytochrome-c 與 apaf-1 protein ，活化 caspas-9 最終造成腎臟中細胞死亡 (Mishra, Emancipator, Kern, & Simonson, 2005)。在正常情況高度糖化中產物主要由腎臟所排出，但對於末期腎病變患者而言，隨著腎絲球過濾率的降低，仍無法排除高度糖化終產物，必須經由血液透析及治療，來清除使濃度恢復至正常值。治療糖尿病腎病變有效降低糖化終產物產生才是最根本的辦法，糖尿病患在服用藥物或是抑制劑可有效的控制血糖及降低AGEs濃度，達成特異性病變病理之療效，除了臨床處方藥物外，天然植物化合物也對於改善糖尿病腎病變的替代療法的輔助選項，例如白藜蘆醇（resveratrol）(Kitada et al., 2011)、兒茶素EGCG (Lee & Lee, 2007)、薑黃（curcumin）(Stefanska, 2012)皆已被證實有抑制AGEs形成的療效。. 11.

(19) 第二節能量代謝失衡上一節著重在高度糖化終產物（advanced glycation end-products ; AGEs）誘導氧化壓力造成腎臟功能損傷，近年來研究指出粒線體失能所製造出過量的活性氧分子（mitochondrial reactive oxygen species; mtROS）也在糖尿病腎病變形成過程中扮演的重要角色(Catherwood et al., 2002)，過多的活性氧化物（ROS）無法被抗氧化物酶所中和就會導致粒線體受到氧化刺激損傷，然而造成粒線體失能的原因也與上游訊息遞路徑的有關。參與細胞內的能量代謝的關鍵蛋白 SIRT1 及 AMPKa及轉錄共同活化因子 PGC1α 與粒線體功能有密切關連許多糖尿病動物研究中也發現，抑制代謝的路徑（AMPKα/SIRT1/PGC1-α）間接導致粒線體功能受損、細胞內氧化壓力的增加、還有粒線體 DNA copy number 減少、粒線體生合成關鍵基因（Nuclear Respiratory Factor, Nrf & Nuclear Respiratory Factor, Tfam）及粒線體呼吸鏈（complex I & IV）基因表現量降低等均可在糖尿病組別觀察到(H.-W. Liu & Chang, 2018)，過去許多動物模式研究也針對此傳遞路徑進行探討，發現利用藥物及替代療法都能引起代謝路徑的活化，例如：降血脂藥物 bezafibrate (Zhong et al., 2011)、fenofibrate、降血糖藥物 metformin (Zhou et al., 2001)、 AMPK 活化劑 AICAR(Decleves et al., 2014)，及使用過度表現特定基因皆能活化單一或多個蛋白的表現，來改善粒線體功能降低氧化壓力的生成。除了藥物之外，天然植物化合物例如 SIRT1 活化劑槲皮素（Quercetin）、白藜蘆醇 resveratrol 皆對糖尿病腎病變皆具有保護作用， Kitada 等人以 db/db 小鼠餵食白藜蘆醇 8 週後，能活化 AMPKα/SITT1/PGC1-α，增進脂質、醣類代謝，同時增加粒線體超氧化物歧化酶（Mn-SOD）表現(Kitada et al., 2011)，另外 Dong 等人研究以 5 週齡 C57BL/6 小鼠分別以高脂飼料（high-fat diet）、高脂飼料加入槲皮素 0.l%（quercetin）、低脂飼料（low-fat diet）共 12.

(20) 分為三組進行 12 週，結果發現，在高脂飼料有添加入槲皮素，能有效預防體重的增加及改善胰島素敏感度，同時刺激 AMPKα/SIRT1 路徑活化，降低血液中發炎因子 TNF-α 和 IL-6(Dong et al., 2014)。除了藥物或是植物化合物外，在膳食中加入抗氧化劑例如 MitoQ (Balu K Chacko et al., 2010)、及針對粒線體標靶抗氧化劑（mitochondria- targeted antioxidants）、硫辛酸（lipoic acid）(Stevens, Obrosova, Cao, Van Huysen, & Greene, 2000)、維他命 C (B. K. Chacko et al., 2010; Ozkaya et al., 2011)，改善粒線體生合成及粒線體轉錄因子、粒線體氧化磷酸化等關鍵基因表現增加。另外 Q10 輔酶主要參與粒線體電子傳遞鏈，其還原型具有抗氧化功能，防止脂質過氧化、粒線體凋亡 DNA 斷裂，亦可保護身體器官之功用。研究證實糖尿病 db/db ⼩⿏餵⾷輔酶 Q10（coenzyme; Q10）七週後，餵食 Q10 的 db/db 小鼠比起控制組顯著降低粒線體耗氧量、粒線體破碎化（mitochondrial fragmentation），同時改善腎絲球過濾率、白蛋白尿的產生，有效改善糖尿病 db/db 小鼠腎臟功能(Persson et al., 2012)。. 第三節運動訓練預防糖尿病腎病變之分子機致制過去一篇臨床研究中，美國糖尿病防治計畫（Diabetes Prevention Program, DPP）探討生活型態改變（Lifestyle intervention）和藥物治療（metformin）能否延緩二型糖尿病之發病率，招募 3324 位受試者，篩選條件：BMI 超過 24、空腹血糖值為 95-125 mg/dl，口服 75mg 葡萄糖耐受試驗 2 小時後血糖濃度為 140-199mg/dl，具有二型糖尿病高風險族群。符合條件受試者分為安慰劑組、藥物組（Metfomin, 850 mg 一天兩次）、生活型態改變組共三組，生活型態改變組需減少熱量攝取（1200-1800 大卡 per day）加上每. 13.

(21) 週運動訓練至少 150 分鐘以上，此研究平均追蹤 2.8 年，結果顯示糖尿病發病率分別為安慰劑組（11.0 cases/person-year）、藥物組（7.8 cases/person-year）、生活型態改變組（4.8 cases/person-year），安慰組相比生活型態改變組罹患糖尿病發生率下降 58%、藥物組為 31%，此研究也證實生活型態的改變，比起單一藥物控制來得更有效(Knowler et al., 2002)。同時根據美國運動醫學會（The American College of Sports Medicine）運動處方指引，長期規律運動能夠有效控制及改善糖尿病腎病變，以低強度、每週 3 次累積至少 150 分鐘的模式為建議標準，能夠改善初期（2、3 期）慢性腎臟病變患者腎臟的功能(Colberg et al., 2010)，期望藉由早期治療預防糖尿病腎病患者走向末期腎臟病（ESRD）及洗腎治療（血液透析）的階段，雖然運動對於改善糖尿病腎病變的臨床成效顯著，但目前對於保護機制仍不瞭解，根據前述藥物或輔助治療對糖尿病腎病變的影響及相關保護機制，來延伸探討運動改善糖尿病腎病變的分子機制。. (1) 運動訓練預防糖尿病腎病變之分子機制運動訓練已證實對糖尿病腎病變具有預防及保護效果，但其機制如何目前尚不清楚， Ito 等人使用糖尿病動物模型來探討長期運動訓練對於早期（early stage）糖尿病腎病變的保護機制，從過去研究(Coimbra et al., 2000)等人透過 PAS 染色來評估 Zuker 肥胖大鼠從 6 週至 60 週齡腎臟形態學的改變，結果指出 14 週齡之 Zuker 大鼠開始出現輕度腎臟損傷，在 18 週齡後出現局部節段性腎小球硬化，而在 40 週齡後腎小管出現間質損傷、蛋白尿等症狀。此外(Siwy et al., 2012)觀察早期 8 週齡之 ZDF 小鼠沒有出現明顯腎臟損傷情況，直到 8 個月大 ZDF 小鼠腎臟才開始明顯出現損傷，因此 Ito 等人以 6-14 週齡 Zuker 肥胖大鼠作為早期糖尿病腎病變之動物模型，運動訓練處方以初始速度為 10m/min. 14.

(22) 並在第一週內逐漸增加強度至 20m/min，訓練時間 60 分鐘，訓練結束後觀察到 Zucker 大鼠在中等強度的運動訓練下能有效降低血糖、尿蛋白、胰島素敏感度增加、肌酸酐清除率及腎臟內 α-oxoaldehydes（AGEs 之前驅物）正常化，同時亦可改善腎小球足細胞損傷，然而運動組 Zucker 肥胖大鼠體重卻比起控制組還來得高，同樣結果也在 Pold 等人也使用糖尿病動物模型發現，運動訓練 ZDF 小鼠共 8 週後，能有效降低高血糖、高血脂等症狀，但是運動組的體重卻比起控制組還來得高，Ito 等人解釋運動訓練可能改變二型糖尿病患者了總肌肉與脂肪的比例。(Ito et al., 2015)。 Ghosh 等人(2009)以中等強度耐力運動訓探討糖尿病 db/db 小鼠腎臟的保護機制，訓練處方每週訓練速度 5.2m/min 每次 60 分鐘一週訓練 5 天共 7 週後，結果發現運動改善腎小球系膜擴張、降低促發炎因子 TNF-α 表現量，且提升超氧化歧化酶（superoxide dismutase, SOD1-3），降低細胞內氧化物質產生，除提升抗氧化酶之外耐力運動訓練可抑制細胞凋亡路徑關鍵蛋白的活化（casepase3、casepase8），caspase9 是粒線體內凋亡途徑之蛋白，此實驗結果發現沒有活化(Ghosh et al., 2009)，Gosh 等人在另外一篇研究中指出 db/db 小鼠在 16 週齡後 casepase9、及促凋亡蛋白 bax 表現量有增加，所以推估 casepase9 沒有活化的原因可能因為糖尿病 db/db 小鼠只有 12 週齡所以推論糖尿病前期細胞凋亡路徑未完全活化。適度運動訓練能延緩腎絲球肥大、蛋白尿、並降低凋亡路徑亦可增加抗氧化物（SOD-1-3）表達，改善糖尿病小鼠腎臟氧化壓力的損傷(Ghosh, Golbidi, Werner, Verchere, & Laher, 2010)。. 15.

(23) (2) 運動與能量代謝途徑（SIRT1/AMPKα/PGC1α）及粒線體功能耐力訓練對於骨骼肌生理適應已經被廣泛研究，運動訓練的效應能夠增加 AMPKa/SIRT1/PGC1-a蛋白表現以及粒線體氧化磷酸化作用，有效改善粒線體功能 (Suwa, Nakano, Radak, & Kumagai, 2008)，同時提升葡萄糖吸收能力、增加游離脂肪酸氧化。 AMPK 為一種異三聚體蛋白（heterotrimeric protein）由由 α、β、γ 三種次單位（subunit）所組成，也被視為調節能量恆定的感應分子，當運動、缺氧或是肌肉收縮時，會導致細胞內 ATP/AMP 比率改變或 Thr172 磷酸化，進而活化 AMPKa。AMPKa 的活化可以啟動代謝路徑，例如：葡萄糖的轉運、脂肪酸的氧化，同時可抑制 acetyl-COA carboxylase 酵素活性，進而抑制三酸甘油脂、膽固醇合成作用，降低肌肉中三酸甘油脂含量。而給予小鼠注射 AMPK 激活劑 AICAR 後發現，能增加小鼠中肌肉細胞 GLUT-4 轉位與蛋白表現量，提高葡萄糖的攝取與氧化作用，因此增加葡萄糖的利用進而降低血液中的血糖(Holmes, Kurth-Kraczek, & Winder, 1999)。SIRT1（silence information regulator 1，SIRT1）是 NAD＋依賴型組蛋白去乙醯化酶，在哺乳類同源發現 sir2 蛋白，被歸類為 sirtuin 家族其中之一，酵素活性會受到 NAD＋和 NADH 比值影響，SIRT1 可直接在組蛋白或非組蛋白上去乙醯化（Deacetylation）而改變其功能或活性，例如：p53、PPARγ、 FOXO 與 NF-κB 等轉錄因子，當這些蛋白去醯化會降低其轉錄活性，但某些蛋白去乙醯化反而會增加活性例如：PGC1-α，SIRT1 主要作為代謝調節劑，如基因調控、DNA 修復、細胞凋亡、粒線體生合成、發炎功能等。許多證據也指出 SIRT1 調控 PGC1-α 再不同組織也會有不同的代謝反應，在肝臟中已知透過 SIRT1/PGC1-α 和 CREB 轉錄調控共激活因子 2（CREB Regulated Transcription Coactivator 2, CRTC2）調節糖質新生(Y. Liu et. 16.

(24) al., 2008)，SIRT1 與 AMPKα 其功能皆為細胞能量調控的酵素，運動時骨骼肌收縮同時造成 SIRT1 去乙醯化、AMPKα 磷酸化作用進使 PGC-1α 活化，當 PGC-1α 大量表現會刺激核細胞核呼吸因子（NRF1），亦可激活粒線體轉錄因子（Tfam）增加粒線體 DNA copy number(Canto et al., 2010)。然而許多研究證實造成糖尿病形成的機轉之一，也與能量代謝途徑（SIRT1/AMPKα/PGC1-α）的失能有關，在動物模式中二型糖尿病 db/db 小鼠、Zucker 糖尿病大鼠（Zucker diabetic fatty rat, ZDF）和多基因背景 KK/ay 小鼠其與人類糖尿病病徵相似，Sriwijitkamol 等人發現 Zucker 糖尿病大鼠（sedentary）肌肉中 pAMPKα、PGC1α 蛋白比起 wild type 小鼠（sedentary）活性少 45%和 35%，然而給予運動組進行中等強度有氧訓練，運動處方為每週 5 次，共進行 7 週，第一週每次訓練為 10 分鐘、跑步機速度為（15 meter/min），在接下來的六週逐漸增加訓練強度，增加到每次訓練 90 分鐘、跑步速度為（22meter/min），結果發現運動組比起久坐組（Zucker） pAMPKα、PGC1-α 活性增加 1.5 倍、2.5 倍(Sriwijitkamol et al., 2006)。除此之外其患有代謝症候群症狀可藉由運動、限制能量以及糖尿病藥物 metformin(Piwkowska et al., 2010)、 Fenofibrate(Hong et al., 2014)、Thiazolidinediones （TZDs）(LeBrasseur et al., 2006) 進行治療，亦可透過活化此代謝路徑路徑 SIRT1/AMPKα/PGC1-α 改善代謝症候群症狀 (Kume et al., 2010)，目前運動訓練經由 SIRT1/AMPKα/PGC1-α 路徑調控粒線體功能，改善糖尿病腎病變的仍缺乏相關文獻的支持。但參考上述文獻推測適當的運動訓練能活化能量路徑、提升粒線體功能避險糖尿病引起腎病變的惡化。. 三、適合 db/db 小鼠運動訓練強度過去相關文獻對有氧訓練強度的界定上並不一致，研究結果的不一可能來自運動處方的差異（運動強度），Gutkowska 等人讓 db/db 小鼠進行中等強度跑步訓練（15m/min）， 17.

(25) 運動處方為每週 5 次、每次 30 分鐘，持續 8 週，訓練後體重、血糖及胰島素皆未能改變，運動訓練無法上調 db/db 小鼠心臟中利納肽系統（OT–NPs–NO system），對於保護心臟的影響似乎有限(Gutkowska et al., 2009)。長時間的激烈運動會造成壓力賀爾蒙可體松（cortisol）的上升，因此推估中等強度的運動（15m/min）對於此 db/db 小鼠運動強度仍太高(Ghosh et al., 2010)。另外 Ishikawa 等人以不同有氧運動強度對早期糖尿病 KK-Ay 小鼠之腎功能影響，分別以中等強度 10m/min，每次訓練 60 分鐘每週五天、及低強度 5m/min，每次訓練 30 分鐘一週 3 天訓練時間共 8 週，結果指出運動組能降低腎臟中 MCP-1 與巨噬細胞浸潤以及尿蛋白，並增加血清中 SOD 含量，但是中等強度組在 HIF-1α（缺氧誘導因子 α）的表達上卻比起久坐組還高(Ishikawa et al., 2012)，過去文獻也證實在高血糖環境下活化腎小管上皮細胞 HIF-1α 表達助使腎臟纖維化的發生(Basu et al., 2011)，因此 Ishikawa 等人認為低強度運動訓練能延緩早期糖尿病腎病變的並且避免腎臟缺血之情況。對於糖尿病 db/db 小鼠以受損的腎臟功能（如：尿蛋白的增加），運動強度過高非但不能產生保護效果，反而額外增加腎臟過濾的負擔。相較於中強度，低強度跑步訓練（5.2m/min），每週 5 次、每次 60 分鐘持續 7 週，對於糖尿病 db/db 小鼠心血管及腎功能能皆有保護的效果(Ghosh et al., 2009; Moien-Afshari, Ghosh, Elmi, Khazaei, et al., 2008; Moien-Afshari, Ghosh, Elmi, Rahman, et al., 2008)。Ghosh 等人特別提到低強度運動所造成的保護效益並非來自於血糖、體重或胰島素的下降(Ghosh et al., 2010)，運動在目標組織所產生的保護效果仍值得深入研究。. 18.

(26) 第參章研究方法. 第一節實驗動物本實驗選擇使用雄性 db/db 品系小鼠作為實驗動物。4 週齡 BKS.Cg-Dock7m +/+ Leprdb/J（db/db）小鼠購至國家實驗動物中心。實驗組別分為 db/db 與 db/db + EX 兩組。每組共 8 隻。飼養於動物房之鼠籠中，12 小時光暗循環，早上 7 點至下午為 7 點白晝，室內恆溫維持在 25±1°C，任意給水及飼料之環境下，並由專人照料。. 第二節實驗時間與地點一、實驗時間：2016 年 11 月至 2 月 (1) 實驗地點：國立臺灣師範大學公館校區理學院生命系動物生理實驗室。. 第三節實驗設計本實驗選用雄性 db/db、及隱性合子 m/m 小鼠作為實驗動物，實驗組分別為 m/m、 db/db、db/db+EX，共三組，控制組（m/m、db/db）在八周期間不進行任何運動訓練， db/db 運動組則以運動訓練處方（5.2m/min）每次訓練 60 分鐘一週 5 天，在最後一次運動完成後進行動物犧牲。本研究使用 urethane （1500 mg/1kg BW）進行麻醉，麻醉深度須經腳趾反射檢測，動物已達深度麻醉後斷頭犧牲。犧牲後取出腎臟進行分析檢測，檢測項目包括代謝路徑、血清尿素氮、肌酸肝生化指標。. 19.

(27) 第四節實驗方法與步驟一、血清肌酸酐（creatinine）濃度之測定本實驗使用商業檢驗套組分析（Creatinine Colorimetric / Fluorometric Assay Kit, Biovision USA.），其原理為在測定中生物體液中肌酸酐經肌酸酐酶轉化為肌氨酸，因肌氨酸特異性氧化與探針反應形成深紅色之複合物，於波長570mm下測定吸光值，即可推測血液肌酸酐濃度。 (1). 將血清準備放入96孔盤中，肌酸酐標準品（Creatinine Standard）用100 µl dH2O配置100mM並儲存於- 20oC冷凍。. (2). standard curve preparation，將10 µl肌酸酐（10倍稀釋）標準品與990 µl的Assay Buffer 混勻1 nmol/µl，並在96孔盤內分別加入0、2、4、6、8和10µl之溶液，最後再加入 Assay Buffer調整至50µl，如果需要更敏感的測定，可利用fluorescence 將溶液稀釋 10倍。. (3). Reaction Mix：加入Assay Buffer 42 µl、Creatinase 2 µl、Creatininase 2 µl、Enzyme Mix2 µl、Creatinine Probe 2 µl ，混合成50 µl的反應混合物。. (4). 將上清液和Assay Buffer混合成50 µl再加入反應混合物（步驟三）共100 µl配置於 96孔盤內，在37oC 培養一小時，於波長570nm下測定吸光值，並帶入公式換算血清creatinine濃度。. 二、尿素（Urea）測定本實驗使用商業檢驗套組分析（Urea Colorimetric Assay Kit, Biovision USA.），尿素在酶存在下與化合物反應形成與OxiRed探針反應產生顏色（570mn）。. 20.

(28) （1）Probe：使用前須放置室溫下，儲存於-20oC，避光和潮濕環境。Enzyme Mix, Developer and Converting Enzyme：分別溶於220µl分析緩衝液中。分等容易以防止重複解凍。平時放入-20oC儲存。. （2）Standard Curve Preparation：將尿素標準加入5µl的100µm尿素標準稀釋到995µl的 DＤH2O，使尿素標準稀釋至0.5 mm，混合均勻，分別加入0，2，4、6，8，10µL 最後調整體積至50µL。（3）Sample Preparations：血清直接加入96孔盤中，測定體積為50µL。（4）Reaction Mix：測驗之Sample分別加入42µl Assay Buffer、2µl OxiRed Probe、2µl Enzyme Mix、2 µl Developer、2µl cCoverter Enzyme，Sample control加入入44 µl Assay Buffer、 2 µl OxiRed Probe、2 µl Enzyme Mix、2 µl Developer。（5）Measurement：以570mn吸光值進行測定。三、組織切片染色（1） H＆E stain 小鼠犧牲後，取腎臟組織，浸泡在10%中性福馬林固定，進行低濃度到高濃度（50%~100%）脫水，在使用二甲苯（xylene）置換組織中的酒精，浸置兩小時、隔一小時再換一次，以二甲苯隔夜處理隔夜處理後，在更換石蠟浸潤並滲透組織中進行包埋，包埋完成之蠟塊使用迴轉式切片機（Micro）進行切片，組織薄片（5µm）黏貼於玻片上，玻片製作完成後進行二甲苯脫蠟，酒精復水，浸泡Hematoxylin3分鐘，清洗浸泡Eosin約 30s，清洗後再進行低濃度到高濃度酒精脫水動作，完成後封片待乾即可拍照留存。. 21.

(29) （2）PAS染色小鼠犧牲後，採其腎臟，浸泡在10%中性福馬林固定組織，取腎臟組織，浸泡在10% 中性福馬林固定，進行低濃度到高濃度（50%~100%）脫水，在使用二甲苯（xylene）置換組織中的酒精，浸置兩小時、隔一小時再換一次，以二甲苯隔夜處理後，在更換石蠟浸潤並滲透組織中進行包埋，將製成好的腎臟組織蠟包埋切片，水洗20秒後，再浸置 Periodic Acid約5分鐘後，進行水中沖洗，接下來使用Schiff’s Reagent試液染色15分鐘，並移至Soduim bisulfite進行transfer三次後再以水沖洗。組織脫水依序以30%、50、70、 90、100%酒精和xylene等逐一脫水每次進行5秒。最後再將xylene專用膠進行封片，供鏡檢觀察。. 四、組織學與形態學量化使用光學顯微鏡200x倍率下隨機挑選15顆腎小球（4隻/每組），並使用image J生物影像分析軟體沿著腎小球微血管的輪廓圈選面積，經由組織量化的方式評估腎小球面積，之後統計出每組平均值(Wolf et al., 2005)，使用半定量評分系統評估每顆腎小球係膜擴張範圍，評分範圍0-4分：0級為;無損傷、1級為;<25%、2級為;25-50%、三級為;50-75%、 4級為>75%<，使用光學顯微鏡400x倍率下隨機挑選15顆腎小球（4隻/每組），使用image J生物影像進行分析(Moon et al., 2016)。. 五、蛋白質萃取將腎臟與lysis buffer作用，以均質機研磨組織。lysis buffer 含有 50 mM HEPES （pH 7.4），EGTA（pH 8.0），0.2 % NP-40，10 mM EDTA （pH 8.0），15 mM Sodium pyrophosphate，100 mM β-glycerophosphate，50 mM NaF，150 mM NaCl，2 mM Sodium. 22.

(30) orthvanadate，1 mMPMSF 及蛋白酶抑制劑（protease inhibitor：含有ABESF、aprotinin、 leupeptin、EDTA、E-64 protease inhibitor），置於震盪器在 4˚C環境下震盪30分鐘，在使用離心機13000 rpm 15分鐘，離心後將上清液取出保存進行後續實驗。. 六、西方點墨法（Western blot）製膠流程: 將電泳玻璃片裝上架膠夾後夾緊，以二次水測試受鑄膠模組避免漏膠，配置下膠（30%Acrylamide、 1.5M Tris pH8.8、10% SDS 、10 % APS 及 TEMED）濃度後，在加入甲醇，避免膠體與空氣接觸並將下膠壓平，同時檢查有無漏膠，等膠凝固後，倒掉倒掉酒精，再以ddH2O沖洗一次，並配上層膠溶液（（30% Acrylamide、1.5M Tris pH6.8、10% SDS 、10 % APS 及 TEMED）），插入齒梳。當上膠層凝固後。將架膠夾拔除，將SDS-PAGE置入電泳槽內，取出齒梳，並倒入電泳緩衝液（running buffer）。並加含有20-60 µ腎臟蛋白進行加熱95oC加熱5分鐘後放置於冰上，再將蛋白樣本注入膠體凹槽內，並以固定電壓50伏特，直到蛋白樣本接近下膠體底部即可停止電泳。. 接著將SDS-PAGE上的蛋白轉漬到Nitrocellulose membranes上，先將具有海綿網的轉印夾內置入2張濾紙，浸在transfer buffer中，並取膠體除去，上半stacking gel的部分，轉印夾內依序為海綿→濾紙→Nitrocellulose membranes→濾紙→海綿。疊好後壓平並確定膠體、濾紙和membrane沒有氣泡純在，並將轉印夾置入槽內，以100伏特進行90分鐘進行轉印。將membranes放入含有 5% BSA與 0.1 % Tween 20 之TBS 混合溶液培養 60 分鐘後，依受測蛋白的特性，調整一級抗體的比例（primary antibody） phosphor-AMPKα （Thr171）-antibody、anti-AMPKα、anti-SIRT1、Actin、anti-PGC1-α、phosphor- NF-κB、 anti-NF-κB、anti-IκB-α，放置4°C環境進行震盪作用（不得少於八小時），作用完畢後， 23.

(31) 清洗一級抗體，再加入二級抗體，放置室溫震盪作用約1小時。最後完成清洗程序後，加入 ECL kit 進行呈色，利用LAS-3000冷光照相系統進行顯影分析。. 第五節資料分析一、實驗一本研究為了解運動對於能量代謝路徑及發炎路經相關蛋白的影響，以西方點墨法測得實驗數據，所有實驗資料在以 SPSS1 8.0 軟體分析，以獨立樣本Ｔ檢定分析來檢定組別之間的差異，以平均值 ± 平均值誤差（Standard error of the mean，SEM）顯示水準定為 p<0.05。二、實驗二本研究論文為了解運動對於病理組織切片及血液生化值之影響，以平均值 ± 標準平均值誤差（Standard error of the mean，SEM）顯示水準定為 p<0.05 表示，實驗結果以單因子變異數分析（ one-way ANOVA ）分析組間差異，而事後分析採用 student-Newman-Keuls test 判斷個別差異。. 24.

(32) 25.

(33) 第肆章實驗結果本研究實驗結果，分別以四部分進行說明，依序為運動訓練對糖尿病小鼠血清生化值影響、運動訓練對糖尿病小鼠腎臟組織之影響、運動訓練對 SIRT1-AMPKα-PGC1α 路徑之影響，以及運動訓練對於 NF-κB 和 IκB-α 路徑之影響。一、運動訓練對血清生化值之影響血清肌酸酐（Creatinine）和尿素為評估腎功能之指標，本結果指出糖尿病 db/db 對照組肌酸酐、尿素濃度皆顯著高於 m/m 組（p<0.05），而經運動訓練後，db/db 運動組與 db/db 對照組相比，皆可顯著降低肌酸酐及尿素氮濃度（p<0.05）（圖一）。. 圖 1 運動訓練對於糖尿病小鼠血清生化值影響。A 為血清肌酸酐，B 為血清尿素。 26.

(34) 二、運動訓練對於腎絲球組織型態之影響本實驗結果圖二為 hematoxylin & eosin（HE）和 Periodic Acid-Schiff stain（PAS）染色後進行鏡檢（放大倍數：400X），觀察運動訓練後對於糖尿病 db/db 小鼠腎絲球體組織型態之影響，圖 A-B 結果顯示久坐 db/db 組腎絲球截面積和腎絲球係膜擴張分數比起久坐 m/m 及 m/m 運動組來的高出約為兩倍，而經運動訓練後之 db/db 小鼠與久坐 db/db 小鼠比較後發現，運動訓練能降低腎絲球截面積和基質膜擴張之現象。. 圖 2 運動訓練對於糖尿病小鼠腎絲球體組織形態之影響（a-g）. PAS、H&E 染色觀察經由低強度有氧運動訓練對糖尿病小鼠腎絲球體組織型態影響，放大倍數：400X。. 27.

(35) 圖 3（A）以 PAS 染色圖計算腎絲球截面積（B）以 PAS 染色圖分析腎絲球基質膜擴張分數（n=4 mice/group）. 實驗數據以 Means ±SEM. P < 0.05 各組間差異以字母表示。. 28.

(36) A 三、運動訓練對於 SIRT1-AMPKα-PGC1α 路徑之影響 SIRT1-AMPKα-PGC1α 為能量代謝中重要的樞紐，圖三 A 西方點墨法分析之腎臟蛋白，未經運動訓練 db/db 小鼠中發現 SIRT1 及 AMPKα 蛋白活性都低於運動組，運動組 SIRT1 以及 AMPKα 表達比起沒運動 db/db 小鼠含量高出 2 倍（圖三 B-C），然而經運動訓練後 PGC1-α 表達上兩組則未達顯著差異（圖三 D）。. 29.

(37) 圖 4 運動訓練對於 SIRT1-AMPKα-PGC1α路徑之影響. （A）表示西方點墨法分析 SIRT1、phosphor-AMPKα、AMPKα、PGC1α 腎臟之蛋白表現（B）SIRT1（C）phosphor-AMPKα, AMPKα （D）PGC1-α。腎臟蛋白定量結果以 mean±SEM 表示（n=6-8/per group）＊=p<0.05 與 db/db 組比較。. 30.

(38) 四、運動訓練對於 NF-κB 和 IκB-α 路徑之影響腎臟氧化壓力的提昇會活化 NF-κB 促使發炎反應的增加也是造成腎臟病變的關鍵因子，結果顯示 IκB-α 兩組間未達顯著差異（圖四 B），然而運動組 NF-κB 磷酸化表達上比起未經訓練 db/db 小鼠還來得低（圖四 C）。由此得知，糖尿病 db/db 小鼠經運動訓練後能夠有效抑制 NF-κB 活化。. 圖 5 運動訓練對於 NF-κB 和 IκB-α路徑之影響. 31.

(39) （A）西方點墨法分析腎臟 NF-κB、phospho-NF-κB、IκB-α 蛋白之表現（B）IκB-α（C） NF-κB、phospho-NF-κB 。腎臟蛋白定量結果以 mean±SEM 表示。（n=6-8/per group）＊=p<0.05 與 db/db 組比較。. 32.

(40) 第伍章討論與結論本章節分為二個部分進行探討：一、運動訓練對於血清生化值及腎臟組織病理學之影響; 二、運動訓練對於腎臟能量代謝路徑及發炎路徑之影響。. 一、運動訓練對於血清生化值及腎臟組織病理學之影響規律有氧運動一直是管理及改善二型糖尿病及肥胖的基石，但是運動對於糖尿病腎病變的影響及相關機制仍未完全釐清，本實驗得知 db/db 糖尿病小鼠在肌酸酐、尿素清除率比起運動組還低，在臨床常以肌酸酐、及尿素、24 小時肌酸酐清除率（Crr）來檢測早期腎功能排除代謝廢物的能力是否正常(Le Bricon et al., 2000)，當血液中尿素及肌酸酐濃度升高，也暗示著腎臟逐漸喪失功能。雖然過去文獻指出糖尿病 Zucker 大鼠在初期 8-18 週齡血液中肌酸酐及尿素氮與控制組沒有差異，約 40 週齡後血中肌酸酐及尿素氮才開始增加，但在 14 週齡時開始出現腎臟損傷的跡象，因此 Ito 等人仍以 6-14 週齡小鼠作為糖尿病初期動物模型(Coimbra et al., 2000; Ito et al., 2015)，而本研究以運動訓練介入早期糖尿病 db/db 小鼠對於血液生化值影響發現，運動訓練介入顯著降低糖尿病小鼠血液中肌酸酐、尿素氮濃度，趨近於常態，表示運動訓練能改善前期糖尿病腎絲球損傷。過去文獻表示 db/db 糖尿病小鼠在約一週齡時開始出現高胰島素血症，在 8 週齡時血糖水平的增加演變為高血糖，在腎臟組織學切片可以發現約 8-16 週齡時腎小球面積和基質膜逐漸擴張約 20%~30%，在 16 週齡後腎小球係膜開始擴張增加三倍，腎絲球肥大也是糖尿病腎病變之典型特徵，腎小球系膜基質擴張將減少腎小球中毛細血管過濾面積，其成因可能是因腎小球血液動力學改變所致 (Breyer et al., 2005; Ghosh et al., 2009)。 33.

(41) 除了使用藥物或植物化合物作為改善前期糖尿病腎病變治療外，我們研究證實低強度有氧訓練做為介入能有效延緩 db/db 小鼠腎絲球肥大以及基質膜擴張，其結果也印證過去相關研究(Colberg et al., 2010)。. 二、運動訓練對於腎臟能量代謝路徑及發炎路徑之影響。高血糖所產生過多活性氧化物造成組織損傷已被廣泛認可，細胞中產生過多氧化壓力與糖尿病腎病變也有直接關聯，除了高血糖誘發氧化刺激外，過去研究中粒線體失能也被認為是二型糖尿病腎病變的關鍵，調控粒線體生合成作用上游蛋白 SIRT1 及 AMPKα 在 db/db 小鼠中有抑制的情形(Mizutani, Ikeda, & Yamori, 2000)，高糖可導致細胞中 SIRT1 和 AMPKα 活性下降造成下游路徑 PGC1-α 乙醯化間接導至粒線體功能障礙，其過去運動訓練有關分子機制著重在骨骼肌上，當能量限制或消耗時，會促使 AMPKα 磷酸化及 SIRT1 去乙醯化作用進而刺激 PGC1α 亦提升骨骼肌轉運葡萄糖及脂肪酸氧化能力。本研究結果運動訓練能夠刺激 SIRT1-AMPKα 表達增加，但是運動組中 PGC1-α 與 db/db 久坐組則未達顯著上的差異，本實驗設計未檢測粒線體相關轉錄因子，即使上游代謝路徑活化（SIRT1-AMPKα）只能推估運動訓練能促進粒線體生合成的作用，過去許多以運動訓練介入實驗動物模型都確切表明 PGC1-α 在能量代謝上扮演著重要角色 (Terada et al., 2002)，但 Leick 等人研究發現運動訓練調控粒線體功能也並不全然依賴於 PGC1-α，此研究以 PGC-1α knock out 小鼠作為動物模型此品系小鼠與 Wild Type 小鼠相比有較低的粒線體蛋白含量，運動處方以 5 週規律運動訓練每次進行 60 分鐘，訓練強度為 14 公尺/分鐘 10%坡度結果發現 PGC-1α knock out 運動組經訓練後股四頭、比目魚肌中所參與粒線體子傳遞鏈的細胞色素 c 比起控制組約增加 40%蛋白表現，調控電子傳. 34.

(42) 遞鏈之速率限制酶 COXI protein，細胞色素氧化酶 COXI 比起控制組增加 15%蛋白水平，另外一組以單次有氧運動對 PGC-1α KO 小鼠與 WT 小鼠發現兩組運動後 AMPKα 蛋白都有活化，並說明 PGC-1α 在小鼠骨骼肌中未參與訓練所引起反應(Leick et al., 2008)， AMPKα 路徑不會因為缺少 PGC-1α 而受到影響，即使缺少 PGC-1α 仍有其補償機制調控粒線體生合成及呼吸鏈轉錄，然而補償機制可能是與 PGC-1α 相似的單ㄧ因子，過去相關研究也發現，棕色脂肪中 PRDM16 共活轉錄因子與 PGC-1α 有像似的反應(Seale et al., 2007)，PRDM16 蛋白表達可能涉及調控骨骼肌訓練所引起的適應，由此推論本研究運動組 PGC-1α 與久坐 db/db 小鼠未達統計上差異，過去研究表明 SIRT1、AMPKα 活化抑制 NF-κB 發炎路徑即可改善腎臟細胞中氧化壓力以及腎小球系膜擴張有效延緩腎病變的發生(Massy et al., 1999)。. 35.

(43) 第陸章結論本論文主要探討低強度有氧運動訓練調控 db/db 小鼠腎臟相關機制，雖然本研究 db/db 小鼠腎臟中 PGC-1α 運動與控制組仍未達顯著差異，但是經由運動訓練 db/db 小鼠能夠增加 AMPK-α、SIRT1 蛋白表達，並且抑制 NF-κB 蛋白活化降低腎臟發炎反應，延緩腎絲球面積增加及係膜擴張，降低血液肌酸酐、及尿素，許多研究也證實在糖尿病小鼠上能量代謝路徑活化同時抑制發炎路徑，使得粒線體功能正常化減少氧化壓力同時增強抗氧化功能，因此本研究推測低強度的有氧運動訓練對於前期糖尿病小鼠腎臟具有保護效果達到延緩腎臟功能惡化之療效。. 36.

(44) 引用文獻黃蘭菁、李貫廷、李育霖、楊偉勛、黃國晉（2013）。2013 年美國糖尿病學會臨床治療. 指引學會臨床治療指引摘要。台北市醫師公會會刊，57（3），23-31 蔡東華（2017）。糖尿病腎病變。中華民國糖尿病衛教學會 13（1）。21-24 衛福部衛福部（2016）。https：//www.hpa.gov.tw/Pages/List.aspx?nodeid=359 李文欽、黃忠餘、張舜智、許君碩、蕭匡智、巫文平、李智威、田志宏（2013）。腎. 絲球腎炎的致病機轉與治療原則。腎臟與透析 25（1），1-6。莊武龍（2015）。美國糖尿病學會（ADA）2015 年的治療指引更新國家實驗研究院. （2017）「BKS.Cg-Dock7m . +/+ Leprdb/（J db/db）糖尿病小鼠」. Retrieved from http：//webserver.nlac.org.tw/n2/n2-2-1-20.asp. American Diabetes Association. (2013). Standards of medical care in diabetes—2013. Diabetes care, 36(Supplement 1), S11-S66.. Basu, R. K., Hubchak, S., Hayashida, T., Runyan, C. E., Schumacker, P. T., & Schnaper, H. W. (2011). Interdependence of HIF-1alpha and TGF-beta/Smad3 signaling in normoxic and hypoxic renal epithelial cell collagen expression. Am J Physiol Renal Physiol, 300(4), F898-905. doi:10.1152/ajprenal.00335.2010 Breyer, M. D., Bottinger, E., Brosius, F. C., 3rd, Coffman, T. M., Harris, R. C., Heilig, C. W., . . . Amdcc. (2005). Mouse models of diabetic nephropathy. J Am Soc Nephrol, 16(1), 27-45. doi:10.1681/ASN.2004080648. 37.

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