實驗方法 - 酸鹼開關複合型奈米藥物傳輸系統之研發及其在癌症治療上之應用

3-1、實驗藥品

1. D,L-lactide, LA (Lancaster): 以 THF 再結晶純化兩次，抽氣過濾乾燥後放入 descator 中備用。

2. 2-hydroxyethyl methacrylate, HEMA (TCI): 以分子塞除水，減壓蒸餾後於 4^oC 下冷藏備用。

3. Stannous octoate, Sn(Oct)₂ (Sigma): 直接使用。

4. Azobisisobutyronitrile, AIBN (Aldrich): 以 methanol 再結晶純化得 AIBN 固體結晶，乾燥後放入 desiccator 備用。 5. N-Vinylimidazole, NVI (TCI):減壓蒸餾後於 4^oC 下冷藏備

用。

6. N-Vinyl-2-pyrrolidone, NVP(Fluka):減壓蒸餾後於 4^oC 下冷藏備用。

7. Methoxy poly(ethylene glycol), mPEG(Aldrich):直接使用。 8. Acetone (HPLC degree, TEDIA): 直接使用。

9. Methanol, MeOH (TEDIA): 直接使用。 10. Ethanol, EtOH (TEDIA): 直接使

11. Toluene (TEDIA): 以 Sodium Tablet 除水，常壓下蒸餾後使用。

12. Dimethyl sulfide, DMSO (HPLC degree, TEDIA): 直接使用。

13. N,N-Dimethylformamide, DMF (HPLC degree, TEDIA): 直

接使用。

14. Dichloromethane, DCM(TEDIA): 直接使用。

15. Tetrahydrofuran, THF(HPLC degree, TEDIA): 直接使用。 16. N-methylpyrrolidone, NMP(HPLC degree, TEDIA) : 直接使

用。

17. pyrene (Sigma):直接使用。

18. Uranyl acetate dehydrate(Fluka):直接使用。 19. Doxorubicin, Dox(東洋 ):直接使用。

20. Fetal bovine serum, FBS(GIBCO):直接使用。 21. Bovine Serum Albumin, BSA(Sigma):直接使用。 22. L-glutamine(GIBCO):直接使用。

23. Non-essential amino acid(GIBCO):直接使用。 24. Penicillin/streptomycin(GIBCO):直接使用。 25. Trypsin 0.25% in EDTA(GIBCO):直接使用。 26. Trypan Blue Stain 0.4% (GIBCO): 直接使用 27. Paraformaldehyde (Showa):直接使用。

28. Lyso Tracker Green DND-26 (Molecular Probe): 直接使用。 29. Triton X-100 (TEDIA): 直接使用。

30. 3-(4,5-dimethylthyazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide, MTT (ICN): 直接使用。

31. Dulbecco’s modified Eagle’s medium, DMEM(GIBCO):直接使用。

32. Minimum essential medium, MEM(GIBCO):直接使用。

33. Dimethyl sulfide-d6 + 1% ^v/v TMS (CIL): 直接使用。 34. Deuterium oxide, D2O (CIL): 直接使用。

35. Chloroform-d + Silver foil (CIL): 直接使用。

3-2、實驗裝置

1. 核磁共振光譜儀 (Nuclear magnetic resonance spectro- photometer, NMR: Bruker AM-500 NMR)。

2. 傅立葉紅外線光譜儀 (Fourier transfer infrared spectro- photometer, FT-IR: FTS-155, Bio-Rad)。

3. 凝膠滲透層析儀 (Gel permeation chromatography, GPC:

Machery- Nagel NUCLEOGEL)。

4. 粒徑分析儀與介面電位儀 (Zetasizer 3000HSA:Malvern)。

5. 離心機 (Centrifugator: KA-1000, KUBOTA)。

6. 螢光光譜儀 (Fluorescence spectrometer: F-2500) (HITACHI)。

7. 冷凍乾燥機 (Freeze dryer, Heto CT 60E)。

8. 超過濾裝置 (Stirred Ultrafiltration Cell: Millipore MWCO 10,000)。

9. 穿透式電子顯微鏡 (Transmission electron microscopy, JEOL JEM-2010)。

10. 原子力電子顯微鏡 (Atomic force microscopy, Bioscope AFM)

11. 無菌操作台 (Laminar flow,海天 )。

12. CO2 培養箱 (CO2 incubator:NAPAC Model 6100 CO2)。

13. 96 孔盤酵素判讀儀 (Elisa Reader:Awareness StateFax2100)。

14. 倒立式像位差顯微鏡 (Phase contrast microscopy:Wild MPS 51S)。

15. 高溫滅菌箱 (Autoclave:Tomin, Tomin Medical Equipment LTD)。

16. 血球計數盤。

17. 共軛焦顯微鏡 (Laser Confocal Microscopy, LeicaTCS-SP2)。

18. 透析膜 (Spectrapor dialysis membrane;MWCO:6000~8000)

3-3、名詞對照

1. PLA

poly(

D,L

-lactide) 2. PLA-HEMA:

poly(

D,L

-lactide) with end-capped of HEMA

3. PLA-g-P(NVI-co-NVP): (G0

、 G1 、 G2 、 G3 、 G4 、 G5)

poly(D , L-lactide)-g-

poly(N-Vinylimidazole-co-N-Vinylpyrrolidone) 4. mPEG-PLA (B1

、 B2 、 B3)

methoxypoly(ethyleneglycol)-b-poly(

D,L

-lactide)

3-4、酸鹼應答型接枝共聚物 PLA-g-P(NVI-co-NVP)之合成

2-hydroxyethyl methacrylate D,L-lactide PLA-HEMA

Toluene

反應物完全溶解，導入無水無氧之氮氣，進行 degas 3 次，將

如下圖所示。

CH₃O O H_x + 1/2 n O O O

Sn(OCt)₂

130 ⁰C

CH₃O O

x-1 O

O Hn

mPEG D,l-lactide mPEG-PLA

圖3-3、mPEG-PLA 之合成示意圖

3-6、共聚合物之結構鑑定與分析

3-6-1、 1H-NMR 結構鑑定與數目平均分子量鑑定

將定量樣品溶於含 1%(^v/_v) TMS 或 mPEG (分子量 2000) 之 DMSO-d6 中，經核磁共振光譜儀 (NMR spectrophotometer) 分析，可確定樣品結構及組成比例。

3-6-2、 FT-IR 鑑定

將樣品以 THF 或 Methanol 溶解後，塗佈於 NaCl 或 KBr 鹽片上，經傅立葉紅外線光譜儀(FT-IR spectrophotometer)分析，可獲得樣品之官能基定性結構。

3-6-3、 GPC 分子量分佈鑑定

將 5mg 的待測樣品容於 1000mg 之 NMP 中，利用凝膠滲

molecular weight, Mw) 、數目平均分子量 (number-average molecular weight, Mn) 及分子量分佈 (polydispersity index, PDI)。 GPC 流動相為 NMP，流量為 1 ml / min，測量溫度為 40℃。

3-6-4 、臨界微胞濃度 (critical micelle concentration, CMC) 之鑑定

將共聚合物溶解於 methanol 中，緩慢滴入以磁石攪拌之二次水，利用旋轉濃縮機在室溫下濃縮 2 小時，將 methanol 完全除去。將共聚合物水溶液配製成 8 mg/mL，再以二次水等量稀釋至 1×10^-4 mg/mL。

將 pyrene 配製為濃度 6×10^{- 5}M 之 acetone 溶液。再以二次水稀釋至濃度 1.2×10^{- 6}M，以旋轉濃縮機在室溫下濃縮 2 小時，將 acetone 完全除去。而後將上述之共聚合物水溶液與 prene 溶液等體積混合，使共聚合物溶液濃度變為 4 mg/mL 至 5×10^{- 5} mg/mL； pyrene 濃度則為 6×10^{- 7}M。混合溶液靜置 24 小時，使 pyrene 分子將均勻分散。以螢光光譜儀於激發光譜 390 nm 下。觀察最高濃度之樣品與對低濃度之樣品其在 300-350 nm 之最高螢光強度，並以此強度之比值 (I_{3 3 7. 5}/I_{3 3 5 . 5}) 對濃度對數座標作圖，曲線底部與反曲點兩直線外插交叉點相對之濃度定義為臨界微胞濃度。

3-7、接枝型奈米微胞之製備

取適量(5mg、 10mg、 15mg、 20mg)之接枝高分子共聚物 PLA-g-P(NVI-co-NVP)分別溶解於 5mL DMSO 中，並以磁石攪拌 2 小時使其均勻分散於溶劑中。而後將高分子溶液置於透析膜（dialysis bag, MWCO: 6000-8000）中，以去離子水透析 48 小時，前 12 小時，每 2 小時更換一次去離子水，之後每 6 小時更換一次去離子水。將透析完之水溶液冷凍乾燥後，可得到棉絮狀高分子微胞。

取 10mg 之接枝高分子共聚物 PLA-g-P(NVI-co-NVP)溶解於 5mL DMSO 中，並以磁石攪拌 2 小時使其均勻分散於溶劑中。而後分別加入不同比例之去離子水(0%、5%、7.5%、10%、

12.5%、 15%、 17.5%、 20%、 22.5、 25%、 30%)於接枝高分子共聚物溶液中，並持續攪拌 30 分鍾後置於透析膜（ dialysis bag, MWCO: 6000-8000）中。以去離子水透析 48 小時，前 12 小時，

每 2 小時更換一次去離子水，之後每 6 小時更換一次去離子水。測其初期水含量對奈米微胞形成的粒徑大小、分散度與穩定度的影響。將透析完之水溶液冷凍乾燥後，可得到棉絮狀高分子微胞。

3-8、複合型奈米微胞之製備

取定量之接枝高分子共聚物 PLA-g-P(NVI-co-NVP)以及不同比例(0%、 25%、 50%、 75%、 100%)之二團連高分子共聚物 mPEG-b-PLA 共同溶解於 5mL DMSO 中並以磁石攪拌 2 小

MWCO: 6000-8000）中，以去離子水透析 48 小時，前 12 小時，

每 2 小時更換一次去離子水，之後每 6 小時更換一次去離子水。將透析完之水溶液冷凍乾燥後，可得到棉絮狀高分子微胞。

3-9、接枝 /複合型奈米微胞之粒徑分析

取透析完之接枝/複合型奈米微胞 3mL 於比色管中，以動態光散射粒徑分析儀(DLS, Zetasizer 3000HSA:Malvern)分析接枝/複合型奈米粒子懸浮液之平均粒徑及分佈情形 (PI)。藉以觀察接枝型奈米微胞之粒徑分佈與複合型奈米微胞粒徑分佈之差異。操作溫度 25℃， scattering angle 90°，波長 488 nm。

微胞於生理食鹽水(phosphate buffer saline, PBS) 濃度為 0.1 mg/mL。

3-10、接枝 /複合型奈米微胞之界面電位分析

取透析完之接枝/複合型奈米微胞 3mL 於比色管中，以動態光散射粒徑分析儀(DLS, Zetasizer 3000HSA:Malvern)分析接枝/複合型奈米粒子懸浮液於 25℃下之界面電位，可推測出 微胞的表面結構。

3-11、接枝型奈米微胞之高分子聚集行為分析

將接枝型共聚合物 PLA-g-P(NVI-co-NVP)溶解於 DMSO 中，加入不同體積比例(85%、 80%、 75%、 70%、 65%、 60%) 之二次水使其配置成 H2O/DMSO 共溶劑，以動態光散射儀

(DLS, Zetasizer 3000HSA:Malvern) 觀察奈米微胞在 H2O/DMSO 共溶劑環境下之水合直徑及 PI 變化，藉以評估及模擬奈米微胞在透析初期聚集時，接枝型共聚合高分子之聚集行為。

3-12、接枝 /複合型奈米微胞之酸鹼應答行為分析

取 5mL 透析完之接枝 /複合型奈米微胞，先調控高分子微 胞溶液之酸鹼值至 pH 7.4，測其在該 pH 值下之粒徑大小與粒徑分佈；再依序降低溶液之 pH 值 (pH7.0、 pH6.5、 pH6.0、

pH5.5、 pH5.0、 pH4.5)，測其在不同酸鹼值下，奈米微胞粒徑與分佈之變化情形，藉此觀察奈米微胞之酸鹼應答行為。

3-13、接枝 /複合型奈米微胞之 On-Off 應答行為分析

取 5mL 透析完之接枝 /複合型奈米微胞，先將高分子微胞 溶液之酸鹼值調控在 pH7.4 之人體正常中性條件下，並每隔一段時間(15~30 分鐘，共 105 分鐘 )測其奈米微胞之粒徑大小與分佈之變化；而後再將高分子微胞溶液之酸鹼值調控在 pH5.0 之酸性條件下，同樣地，每隔一段時間(15~30 分鐘，共 105 分鐘)測其奈米微胞之粒徑大小與分佈之變化。上述 210 分鐘為一個循環，共 3 個循環，可藉此分析高分子奈米微胞在體內 循環之酸鹼應答動力學。

3-14、接枝 /複合型奈米微胞之表面型態與殼核結構分析 (TEM and AFM)

鍍碳銅網上靜置 1 分鐘，待接枝 /複合型奈米微胞貼附於銅網後，使用 tissue 從銅網的側面小心地將 sovlvet 吸乾。而後將 TEM 染劑 uranyl acetate(2 wt.%)滴於銅網上靜置 1 分鐘，待 uranyl acetate 與奈米微胞作用完成後，使用 tissue 從銅網的側面小心地將 sovlvet 吸乾。上述步驟皆完成後，將 TEM 鍍碳銅網置於 40℃ 真空烘箱中乾燥保存 24 小時備用。而後再以不同倍率之 Transmission electron microscopy(TEM)觀察接枝 /複合型奈米微胞之殼核結構。AFM 試片之製備是將上述透析溶液滴於矽晶片上，置於烘箱乾燥後即可進行操作。

3-15、接枝 /複合型奈米微胞之安定性分析

首先配製 8 wt.%之 BSA /2X PBS(Bovine Serum Albumin/

2X Phosphate Buffer Saline， PBS 濃度為正常濃度的 2 倍 )，而後取 2mL 透析後之接枝 /複合型奈米微胞與上述配製之 8 wt.%

BSA /2X PBS 緩衝溶液等體積混合，於 37℃下靜置保存，每隔一段時間以動態光散射(Dynamic light scanning, DLS)觀察其粒徑與穩定性的變化，以評估其安定性。

3-16、接枝 /複合型奈米微胞之藥物包覆測試及性質分析 先取 10mg 之接枝型高分子溶解於 DMSO；再另外取適量 (5mg、10mg、15mg、20mg、25mg、30mg)之抗癌藥物 doxorubicin

（DOX）溶解於 DMSO 中，而後在 DOX 溶液中分別加入 1.5 倍莫爾比(TEA:DOX=1.5:1)之 triethylamine（ TEA），使 DOX 變成疏水性以利高分子攜帶。將高分子溶液與 DOX 溶液混合

(DMSO 總體積為 5mL)後，攪拌 1 小時，加入 10%之二次水攪拌 30 分鐘後，快速將溶液裝入透析膜 (MWCO 6000~8000)內透析。透析前 12 小時，每 2 小時換 1 次二次水；而後每 6 小時換 1 次二次水，透析時間共約 48~72 個小時，可由透析液由橘紅色轉為無色判斷終止時間，透析完畢後，將高分子藥物微胞冷凍乾燥後可得暗紅色棉狀高分子藥物微胞固體，將其收集置於 desiccator 保存。複合型奈米微胞之藥物包覆製備方法亦同，高分子的使用量分別為 10mg 之接枝型高分子與 10mg 之二團聯型高分子。

高分子藥物微胞之藥物包覆量測試系將高分子藥物微胞以 5mL 之 DMSO 溶解，利用 UV/VIS 測量波長 485nm 之吸收峰。

比對藥物在 DMSO 之檢量線可計算出包覆的藥物重量。利用下式計算藥物包覆率（drug loading efficiency）：

藥物包覆率 (%)=包覆藥物總重 /高分子藥物微胞總重 ×100%

3-17、接枝 /複合型奈米微胞之體外藥物釋放模擬分析

取 5mg 冷凍乾燥後之接枝 /複合型高分子藥物微胞分別溶解於 pH 7.4 的 phosphoric acid buffer solution 與 pH 5.0 的 succinic acid buffer solution ， doxorubicin 之濃度必須小於 100µg/mL。將溶解之高分子藥物微胞緩衝溶液置於超過濾裝置內(超過濾膜 MWCO 10,000)，控制溫度在 37℃(模擬人體正常體溫) ，並定時取樣，以 UV/Vis 測量波長 485nm 之 doxorubicin 吸收，並對照藥物在不同酸鹼值水溶液下之檢量

3-18、接枝 /複合型奈米微胞之藥物 On-Off 應答行為分析 取 5mg 冷凍乾燥後之接枝 /複合型高分子藥物微胞溶解於去離子水中，再將溶液之酸鹼值調控在 pH7.4 之人體正常中性條件下，並置於超過濾裝置內(超過濾膜 MWCO 10,000)，控制溫度在 37℃(模擬人體正常體溫 )。每隔一段時間 (15~30 分鐘，共 105 分鐘 ) 以 UV/Vis 測量波長 485nm 之 doxorubicin 吸收；而後再將高分子微胞溶液之酸鹼值調控在 pH5.0 之酸性條件下，同樣地，每隔一段時間(15~30 分鐘，共 105 分鐘 ) 以 UV/Vis 測量波長 485nm 之 doxorubicin 吸收並對照藥物在不同酸鹼值水溶液下之檢量線計算在不同的酸鹼值環境下，藥物釋

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