酸鹼開關複合型奈米藥物傳輸系統之研發及其在癌症治療上之應用

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國立交通大學

應用化學研究所

碩士論文

酸鹼開關複合型奈米藥物傳輸系統之研發

及其在癌症治療上之應用

pH-Triggered Micellar Drug Delivery System

for Application in Cancer Therapy

研究生：陳宏豪

學號：9425529

指導教授：莊祚敏、薛敬和博士

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謝誌

本論文得以順利完成，必須先感謝指導教授莊祚敏博士，當初若沒有莊老師的人脈及安插也就沒有接下來兩年的際遇；再來我要感謝清大化工所的共同指導教授薛敬和博士，薛老師提供了一個相當優良的學習環境及優渥的研究經費，讓學生無後顧之憂地從事論文研究。除此之外，亦要感謝口試委員朱一民教授、林江珍教授、孫一明教授以及劉英麟教授等於口試當天提供許多寶貴的意見，使得本論文更臻堅實，沒有教授們的協助，也就沒有今天這本論文的誕生。碩士班二年，對於一位非本科系的學生來說，於學習的起步是相當緩慢且辛苦的，但是很幸運地，我遇到了一位不論在學業上或生活上都給了我相當多啟發及開導的人，那就是我的學長駱俊良博士。雖然說這個人脾氣有點古怪，但骨子裡真的是個好人，沒有他的提攜及灌溉，也沒有今天長的跟大樹一樣高的我。對於學長的言謝，並非筆墨可以形容，但是我還是要向學長說聲：「駱俊良學長!真的非常的感謝你!」另一位必須特別感謝的好人是蔡協志博士，首先恭喜學長今年順利地畢業了，台灣又多了一位百年難得一見的人才，真不簡單。協志在我畢業前夕給了我許多寶貴的意見，在我壓力大的時候適時地開導我，亦在我實驗遇到瓶頸時，給了我許多值得參考的思考方向，對於這位學長真的有種相見恨晚的感覺。另外我還要感謝哲平學長，每當實驗上欠東欠西時，他總會很阿殺力地讓我買東買西，還有學長的 FTP 站，更讓我紓解不少無處可洩的壓力。有幾位已經畢業的碩士班學長姐，像是克閩、俊凱、聖傑、大全、慶芳等在我碩士班一年級的時候，給了我許多幫助，也共同創造出許多歡笑及充實的生活，謝謝你們陪

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我成長，所以我才不會忘記感謝你們呢!同儕中，感謝宋岳哲同學，感謝你陪我度過了許多個一起天亮還不能說晚安的日子，祝你成為下一個郭台銘!加油!感謝王韋婷同學及曾士傑學長，沒有你們最後在實驗上及 confocal 的幫忙也就不會有如此漂亮的數據誕生；感謝陳煜仁同學，你有一附好脾氣，祝你改掉「好好喔」的口頭禪。我還要特別感謝偉翔學弟，謝謝你在我畢業前夕幫我趕出許多數據，身為學長沒能在實驗上好好地教導你，希望你能夠體諒。最後我要感謝博荀學長、建宇學弟以及唯聖學弟，謝謝你們在口試前的幫忙，沒有你們，口試便無法順利進行。此外，還要感謝海洋大學電顯中心的黃靜端技士於 TEM 實驗上的幫忙，以及岳哲的同學安恩於 AFM 實驗上的幫忙，有了你們的幫助，本論文就如同畫龍點睛般，變得更加有內容、有質感。接下來我要感謝我的家人，感謝父母親，您們開明的管教方式使孩兒一路走來風雨無阻；感謝叔叔及叔母，感謝您們從姪兒念大學時就給的所有幫助；感謝大哥、大嫂、二哥、三哥、大姐、二姐、三姐等，您們平時給的鼓勵及援助，小弟皆銘記在心，謝謝您們。最後我要感謝我的女友劉玫英小姐，這一路走來皆有你相伴，在我心情鬱悶的時候，你都會相當有耐性地聽我訴苦；在我壓力大的時候，你都會不厭其煩地開導我；在我心情好的時候，你都會與我一同分享喜悅的心情；在我脾氣暴躁的時候，你都會乖乖地不敢吵我，希望往後的日子依然能夠有妳相伴，更祝我們能夠依循共同的夢想，一路走下去。最後本人願將撰寫此論文的榮譽及喜悅獻給所有曾經幫助我的親朋好友，非常謝謝你們！

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摘要

本研究係利用一具有酸鹼應答行為、生物相容性及生物可降解性之 Poly(D , L-lactide)-g-Poly(N-vinylimidazole-co-N-vinyl-2-pyrrolidone) (PLA-g-P(NVI-co-NVP))接枝共聚物以及具有免疫隱蔽性及生物可降解 性之 methoxy poly(ethylene glycol)-b-poly(D,L-lactide)(mPEG-PLA)二團聯共聚 物，利用自我組裝設計出一同時具有環境酸鹼應答行為、可逆開關行為及免疫隱蔽性之接枝 /複合型奈米微胞。 mPEG 可隱蔽內核結構的強正電性與疏水特性進而增加於體內循環時之穩定性與細胞吞噬量；NVI 可藉由其酸鹼應答行為，待藥物載體被細胞吞噬後，可因正電排斥力造成結構的膨潤進而釋放藥物；PLA 則具有包覆輸水抗癌藥物的能力。研究中我們首先探討接枝型奈米微胞之形成機制並得到製備時的最佳化條件，而後我們依 PLA-g-P(NVI-co-NVP)與 mPEG-PLA 臨界微胞濃度之不同，分別以不同重量比製備出各種組合之複合型奈米微胞，並從中篩選出較佳的組成進一步探討 NVI 本身之酸鹼應答行為對微胞型態之影響，結果指出接枝 / 複合型奈米微胞皆有良好的 On-Off 酸鹼應答行為。除此之外，我們更利用 TEM 與 AFM 等電子顯微鏡証實奈米微胞於不同環境下之核殼結構與表面型態變化。藥物載體相關研究方面，我們將抗癌藥物 doxorubicin 包覆於 PLA 疏水內核，並利用免疫隱蔽性之外殼與具有酸鹼應答之特性進行「適時」、「適地」之藥物控制釋放。其中我們探討接枝 /複合型藥物微胞之藥物包覆最適化條件 (藥物包覆率高達約 40%)，並觀察藥物載體於不同酸鹼環境下之 On-Off 藥物釋放情形，發現於 pH5.0 可得到快速且穩定的藥物釋放曲線；而於 pH7.4 時卻可將藥物確實地包覆於疏水內核。進一步地我們將藥物載體分別與 Hs68、 HeLa、 HepG2 等正常 /癌細胞共同培養，結果指出於 IC5 0 附近，材料不具有任何毒性可言。最後，我們以共軛焦電子顯微鏡證實藥物載體於細胞酸性胞器內進行藥物制放，而後藉由擴散作用至細胞核內將細胞毒殺。關鍵字： PLA-g-P(NVI-co-NVP)、接枝 /複合型奈米微胞、 On-Off 酸鹼

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Abstract

A novel mixed micelle comprised of poly(D,L-lactide)-g-poly(N-vinylimidazole- co-N-vinyl-2-pyrrolidone) (PLA-g-P(NVI-co-NVP)) graft copolymer with methoxy poly(ethylene glycol)-b-poly(D,L-lactide) (mPEG-PLA) diblock copolymer was successfully developed for application in cancer therapy. The mixed micelle had an biocompatibility, biodegradab, pH-triggered inner core of P(NVI-co-NVP)-g-PLA to enable intracellular drug delivery and an extended hydrophilic outer shell of mPEG to hide the inner core. PNVI in backbone of graft copolymer exhibited pH-triggered property, when pH<6.0, the nanoparticle swelled (about 50%) depend on composition of NVI in backbone but not deformed its conformation. Otherwise, the conformation went back to initial state when pH>6.0, if micelle capsulated hydrophobic anticancer drug, this phenomenon would be called as “On-Off” controlled drug release.

In this study, we investigated the effect of mixed micelle with different critical micellar concentration (CMC) of diblock copolymer on comicellization. The results indicated that the CMC of diblock copolymer decreasing, the stability of mixed micelles increasing. Furthermore, the average size and polydipersity index(PI) of graft/mixed micelle can be measure by dynamic light scattering with the sample in phosphate buffer saline (PBS) at pH 7.4, it exhibited uniform size(about 70~100 nm) and narrow distribution(about 0.8~1.2).Besides, the core-shell structure of graft/mixed micelle at pH5.0 or pH7.4 can be prove by transmission electron microscopy (TEM).

The hydrophobic doxorubicin(DOX) was capsulated into the inner core of graft/mixed micelle by hydrophobic segment PLA for application in cancer therapy, and the capsulated efficiency can be as high as approximately 40 wt%. Graft/mixed micelle both exhibited high releasing rate in the initial 24 hr and the releasing behavior remained constant after 168 hr in the acidic surroundings(pH 5.0).Furthermore, there were rare initial burst releasing of graft/mixed micelle in neutral surroundings(pH 7.4). It means that the “On-Off” controlled drug release had successfully developed by altered pH value. In addition to above study, the efficiency of screening feature of mixed micelle can be distinguished from graft micelle in BSA/PBS stabe test and cytotoxicity, it means that mixed micelle exhibited better drug activity and lower material cytotoxitity. Finally, the free DOX and DOX-graft/mixed micelle distribution in cancer cell can be easily confirmed by confocal laser scanning microscopy(CLSM). Key word : PLA-g-P(NVI-co-NVP)、CMC、mixed micelle 、pH-triggered、On-Off、

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目錄

摘要... i Abstract ... ii 目錄... iii 表目錄... vii 圖目錄... viii 第一章、研究背景與動機 ...1 第二章、文獻回顧 ...5 2-1、高分子組成單體之材料性質及其應用 ...5 2-1-1、poly(ethylene glycol)之性質與應用 ...5 2-1-2、Poly(D,L-lactide)之性質與應用 ...6 2-1-3、Poly(N-Vinylpyrrolidone)之性質與應用...8 2-1-4、Poly(N-Vinylimidazole)之性質與應用...9 2-2、高分子奈米微胞之介紹 ...11 2-2-1、高分子奈米微胞之形成機制...11 2-2-2、高分子奈米微胞之包覆原理...14 2-2-3、免疫隱蔽性奈米微胞...18 2-2-4、生物可降解型奈米微胞...20 2-2-5、酸鹼應答型奈米微胞...23 2-2-6、開關型奈米微胞...26

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2-3、複合型奈米微胞之介紹 ...28 2-3-1、高分子高分子複合型奈米微胞...28 2-3-2、高分子微脂粒複合型奈米微胞...31 2-4、腫瘤組織構造及其與奈米藥物載體之傳遞行為...34 2-4-1、腫瘤組織構造與藥物傳遞之關係...34 2-4-2、奈米藥物載體之藥物傳遞機制...35 2-4-3、奈米藥物載體之細胞吞噬機制...38 第三章、實驗方法 ...42 3-1、實驗藥品 ...42 3-2、實驗裝置 ...44 3-3、名詞對照 ...45 3-4、酸鹼應答型接枝共聚物 PLA-g-P(NVI-co-NVP)之合成 ...46 3-4-1、PLA-HEMA 之合成 ...46 3-4-2、PLA-g-P(NVI-co-NVP)之合成 ...46 3-5、雙性二團聯共聚物 mPEG-PLA 之合成 ...47 3-6、共聚合物之結構鑑定與分析 ...48 3-6-1、1H-NMR 結構鑑定與數目平均分子量鑑定 ...48 3-6-2、FT-IR 鑑定 ...48 3-6-3、GPC 分子量分佈鑑定 ...48

3-6-4、臨界微胞濃度(critical micelle concentration, CMC)之鑑定...49

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3-8、複合型奈米微胞之製備 ...50 3-9、接枝/複合型奈米微胞之粒徑分析...51 3-10、接枝/複合型奈米微胞之界面電位分析...51 3-11、接枝型奈米微胞之高分子聚集行為分析 ...51 3-12、接枝/複合型奈米微胞之酸鹼應答行為分析...52 3-13、接枝/複合型奈米微胞之 On-Off 應答行為分析 ...52

3-14、接枝/複合型奈米微胞之殼核結構分析(TEM and AFM) ....52

3-15、接枝/複合型奈米微胞之安定性分析...53 3-16、接枝/複合型奈米微胞之藥物包覆測試及性質分析...53 3-17、接枝/複合型奈米微胞之體外藥物釋放模擬分析...54 3-18、接枝/複合型奈米微胞之藥物 On-Off 應答行為分析 ...55 3-19、接枝/複合型奈米微胞之細胞存活率與細胞毒殺分析...55 3-20、接枝/複合型奈米微胞之細胞內藥物分佈情形與內吞行為分析...58 第四章、實驗結果與討論 ...60 4-1、酸鹼應答型接枝共聚物 PLA-g-P(NVI-co-NVP)之製備與鑑定 ...60 4-2、二團聯共聚物 mPEG-PLA 之製備與鑑定 ...66

4-3、臨界微胞濃度(critical micelle concentration, CMC)之鑑定 ..69

4-4、接枝型奈米微胞之製備與鑑定 ...74

4-5、接枝型奈米微胞之聚集行為探討 ...77

4-6、複合型奈米微胞之鑑定與分析 ...84

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(2) CMCGraft < CMCB2...89 (2) CMCGraft ≒ CMCB3...91 4-7、接枝/複合型奈米微胞之核殼型態分析...95 4-8、接枝/複合型奈米微胞之酸鹼應答行為分析...98 4-9、接枝/複合型奈米微胞之 On-Off 酸鹼應答行為分析 ...104 4-10、接枝/複合型奈米微胞之藥物包覆...114 4-11、接枝/複合型奈米微胞之體外藥物釋放模擬...118 4-12、接枝/複合型奈米微胞之安定性分析...123 4-13、接枝/複合型奈米微胞之體外細胞毒殺測試...125 4-15、接枝/複合型奈米微胞之細胞內藥物釋放及分佈測試...132 第五章、結論...138 第六章、參考文獻 ...144

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表目錄

表 2-1、常見之生物可分解性高分子 ...22 表 4-1、接枝共聚物 PLA-g-P(NVI-NVP)之組成比 ...65 表 4-2、接枝共聚物 PLA-g-P(NVI-NVP)之性質分析 ...65 表 4-3、二團聯共聚合物 mPEG-PLA 之組成與性質分析 ...68 表 4-4、各種共聚合物之臨界微胞濃度 ...71 表 4-5、接枝型奈米微胞之平均粒徑與 PI 值 ...75 表 4-6、接枝/二團聯型奈米微胞之平均粒徑與 PI 值 ...85 表 4-7、接枝型奈米微胞之粒徑大小與藥物含量關係...116 表 4-8、複合型奈米微胞之粒徑大小與藥物含量關係...117

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圖目錄

圖 1-1、酸鹼應答開/關型奈米微胞之 On-Off 性質示意圖 ...4 圖 2-1、PEG 二團聯共聚物之奈米微胞於不同領域上之應用 ...6 圖 2-2、巨乳酸單體之不同光學異構物 ...7 圖 2-3、PNVI 之 imidazole 官能基在質子酸存在下之質子化與去質子化可逆反應示意圖...9 圖 2-4、PHis-PEG 與 PLLA-PEG-PHis-biotin 之複合型奈米微胞結構與結構破壞示意圖...10 圖 2-5、雙性高分子自組裝形成高分子微胞之示意圖...12 圖 2-6、高分子微胞之物理性包覆藥物示意圖 (a)透析法；(b)乳化法 ...16 圖 2-7、PEG-b-PAsp(ADR)之化學鍵結型奈米微胞及其藥物釋放之示意圖...17 圖 2-8、PEG-PMPA-PLL 三團連共聚物與 DNA 鍵結形成高分子錯合物微胞之示意圖...18 圖 2-9、免疫隱蔽性奈米微胞 PEG-b-PNIPA 之自組裝與聚集行為之示意圖...19 圖 2-10、不同種類的酸鹼應答巨電解質高分子...25 圖 2-11、溫度應答之開關型載體示意圖 ...27 圖 2-12、酸鹼應答之開關型載體示意圖 ...27 圖 2-13、複合型奈米微胞疏水性自我排列示意圖...29 圖 2-14、高分子-微脂粒複合型奈米微胞之形態示意圖 ...32 圖 2-15、含 poly(ethylene glycol)高分子衍生物之微脂粒 ...33

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圖 2-16、高分子藥物微胞載體自血液累積於腫瘤或癌細胞之傳輸模式示意圖...36 圖 2-17、EPR 效應示意圖...38 圖 2-18、細胞內吞作用之三種吞噬機制 ...40 圖 2-19、藥物載體於組織或細胞內之藥物釋放模式示意圖...41 圖 3-1、PLA-HEMA 之合成示意圖 ...46 圖 3-2、PLA-g-P(NVI-co-NVP)之合成示意圖 ...47 圖 3-3、mPEG-PLA 之合成示意圖 ...48 圖 4-1、D,L-lactide 以 Sn(Oct)2行陽離子開環聚合之反應機構示意圖...61 圖 4-2、PLA-HEMA 之1 H-NMR 光譜圖...61 圖 4-3、PLA-g-PNVP 之 1 H-NMR 光譜圖...63 圖 4-4、PLA-g-P(NVI-co-NVP)之 1H-NMR 光譜圖...63 圖 4-5、PLA-g-P(NVI-co-NVP)之 FT-IR 光譜圖...64 圖 4-6、 mPEG-PLA 之 1H-NMR 光譜圖 ...67 圖 4-7、mPEG-PLA 之 FT-IR 光譜圖...68 圖 4-8、不同高分子共聚物濃度下，Pyrene 分子之激發光譜 337nm 與 335nm 之強度變化情形 ...71 圖 4-9、不同主鏈組成比之 PLA-g-P(NVI-co-NVP)接枝共聚物於不同濃度下之 I337/I335比值變化圖，兩條直線之外插交點即為臨界為包濃度(CMC) ...72 圖 4-10、不同鏈段長度比之 mPEG-PLA 二團聯共聚物於不同濃度下之 I337/I335比值變化圖，兩條直線之外插交點即為臨界為包濃度(CMC) ...73

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圖 4-11、不同組成比接枝型奈米微胞之平均粒徑與 PI 值 ...76 圖 4-12、接枝型奈米微胞聚集行為之示意圖...77 圖 4-13、G0 奈米微胞在不同比例之 DMSO/(DMSO+H2O)混合溶液下之聚集行為...79 圖 4-14、G3 奈米微胞在不同比例之 DMSO/(DMSO+H2O)混合溶液下之聚集行為...79 圖 4-15、G5 奈米微胞在不同比例之 DMSO/(DMSO+H2O)混合溶液下之聚集行為...80 圖 4-16、G0 奈米微胞在不同之初期水含 H2O/(DMSO+H2O) 下之透析結果...82 圖 4-17、G3 奈米微胞在不同之初期水含 H2O/(DMSO+H2O) 下之透析結果...83 圖 4-18、G5 奈米微胞在不同之初期水含 H2O/(DMSO+H2O) 下之透析結果...83 圖 4-19、複合型奈米微胞聚集行為之示意圖...84 圖 4-20、G0B1 複合型奈米微胞在不同混合比例製備下之 (A)粒徑大小與粒徑分佈 (B)介面電位...88 圖 4-21、G3B1 複合型奈米微胞在不同混合比例製備下之 (A)粒徑大小與粒徑分佈 (B)介面電位...88 圖 4-22、G5B1 複合型奈米微胞在不同混合比例製備下之 (A)粒徑大小與粒徑分佈 (B)介面電位...88 圖 4-23、G0B2 複合型奈米微胞在不同混合比例製備下之 (A)粒徑大小與粒徑分佈 (B)介面電位...90 圖 4-24、G3B2 複合型奈米微胞在不同混合比例製備下之 (A)粒徑大小與粒徑分佈 (B)介面電位...90

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圖 4-25、G5B2 複合型奈米微胞在不同混合比例製備下之 (A)粒徑大小與粒徑分佈 (B)介面電位...90 圖 4-26、G0B3 複合型奈米微胞在不同混合比例製備下之 (A)粒徑大小與粒徑分佈 (B)介面電位...93 圖 4-27、G3B3 複合型奈米微胞在不同混合比例製備下之 (A)粒徑大小與粒徑分佈 (B)介面電位...93 圖 4-28、G5B3 複合型奈米微胞在不同混合比例製備下之 (A)粒徑大小與粒徑分佈 (B)介面電位...93 圖 4-29、以 1：1 混合比組成之複合型奈米微胞之平均粒徑與 PI 值 ...94 圖 4-30、接枝型奈米微胞之 TEM 影像 ...96 圖 4-31、複合型奈米微胞之 TEM 影像 ...96 圖 4-32、接枝型奈米微胞之影 AFM 像 ...97 圖 4-33、複合型奈米微胞之 AFM 影像 ...97 圖 4-34、接枝型奈米微胞在不同 pH 值下，以動態光散色觀察之粒徑大小變化情形...99 圖 4-35、接枝型奈米微胞在不同 pH 值下，以動態光散色觀察之粒徑分佈變化情形...100 圖 4-36、G3 複合型奈米微胞在不同 pH 值下，以動態光散色觀察之粒徑大小變化情形...101 圖 4-37、G3 複合型奈米微胞在不同 pH 值下，以動態光散色觀察之粒徑分佈變化情形...102 圖 4-38、G5 複合型奈米微胞在不同 pH 值下，以動態光散色觀察之粒徑大小變化情形...103

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圖 4-39、G5 複合型奈米微胞在不同 pH 值下，以動態光散色觀察之粒徑分佈變化情形...103 圖 4-40、G3 接枝型奈米微胞在不同 pH 值下短時間內之快速 On-Off 行為...105 圖 4-41、G3 接枝型奈米微胞在不同 pH 值下之 On-Off 行為 ...105 圖 4-42、G5 接枝型奈米微胞在不同 pH 值下短時間內之快速 On-Off 行為...107 圖 4-43、G5 接枝型奈米微胞在不同 pH 值下之 On-Off 行為 ...107 圖 4-44、G3B2 接枝型奈米微胞在不同 pH 值下短時間內之快速 On-Off 行為...109 圖 4-45、G3B2 複合型奈米微胞在不同 pH 值之 On-Off 行為...109 圖 4-46、G5B2 接枝型奈米微胞在不同 pH 值下短時間內之快速 On-Off 行為...111 圖 4-47、G5B2 複合型奈米微胞在不同 pH 值之 On-Off 行為...111 圖 4-48、高分子奈米微胞 On-Off 酸鹼應答之 TEM 影像(pH 7.4) ..112 圖 4-49、高分子奈米微胞 On-Off 酸鹼應答之 TEM 影像(pH 5.0) ..113 圖 4-50、Doxorubicin hydrochloride 之化學結構式 ...114 圖 4-51、接枝型微胞之藥物包覆行為示意圖...116 圖 4-52、複合型微胞之藥物包覆行為示意圖...117 圖 4-53、Doxorubicin hydrochloride 在 485nm 之檢量線 ...119 圖 4-54、G5 接枝型藥物微胞於 pH7.4 及 pH5.0 緩衝溶液下之體外藥物釋放模擬...120 圖 4-55、G5B2 複合型藥物微胞於 pH7.4 及 pH5.0 緩衝溶液下之體外藥物釋放模擬...120 圖 4-56、G5 接枝型奈米微胞在不同 pH 值下之體外藥 On-Off 釋放行

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為...122 圖 4-57、G5B2 複合型奈米微胞在不同 pH 值下之體外藥物 On-Off 釋放行為...123 圖 4-58、接枝/複合型奈米微胞於 4wt % BSA/PBS 緩衝溶液與 PBS 緩衝溶液內之穩定性測試...124 圖 4-59、接枝/複合型奈米微胞於不同濃度下對 Hs68 cell 作用 24 小時後之生長抑制情形(n=6)...126 圖 4-60、接枝/複合型奈米微胞於不同濃度下對 Hs68 cell 作用 72 小時後之生長抑制情形(n=6)...126 圖 4-61、DOX 與藥物微胞於不同濃度下對 HeLa cell 作用 24 小時後

之生長抑制情形(n=6)...128 圖 4-62、DOX 與藥物微胞於不同濃度下對 HeLa cell 作用 72 小時後

之生長抑制情形(n=6)...129 圖 4-63、DOX 與藥物微胞於不同濃度下對 HepG2 cell 作用 24 小時後

之生長抑制情形(n=6)...131 圖 4-64、DOX 與藥物微胞於不同濃度下對 HepG2 cell 作用 72 小時後

之生長抑制情形(n=6)...131 圖 4-65、抗癌藥物 doxorubicin 與 HeLa 細胞共同培養 1 小時及 9 小時後之共軛焦顯微鏡影像。(a) LysoTracker 染色之酸性環境(b) 藥物 doxorubicin (c) (a)與(b)重疊後之影像 ...135 圖 4-66、G5 接枝型藥物微胞分別與 HeLa 細胞共同培養 1 小時、3 小時及 24 小時後之共軛焦顯微鏡影像。 (a)LysoTracker 染色之酸性環境 (b)藥物 doxorubicin(c) (a)與(b)重疊後之影像 ...136

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圖 4-67、G5B2 接枝型藥物微胞分別與 HeLa 細胞共同培養 1 小時、3 小時及 24 小時後之共軛焦顯微鏡影像。 (a)LysoTracker 染色之酸性環境 (b)藥物 doxorubicin(c) (a)與(b)重疊後之影像 ...137

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第一章、研究背景與動機

『癌症』一般是泛指惡性腫瘤的統稱，是我國十大死因之首。因癌症身亡的死亡人數約佔總體死亡人數的 20%以上，因此，研發有效率的抗癌醫療系統是當今醫療科學領域的首務之急。癌症(腫瘤細胞)可簡要的區分為(1)血液科惡性疾病，此大類包括了急性或慢性白血病、惡性淋巴瘤、多發性骨髓瘤等，(2)實質固態瘤，大致又可細分成：(a)上皮細胞癌，如肺癌、胃癌、子宮頸癌等；(b)肉瘤，如軟體組織肉瘤、骨肉瘤等；(c)其他實質固態瘤，如生殖母細胞瘤、視網膜母細胞瘤等。而腫瘤細胞通常具有下列四項特性：(1)同源叢生性 (clonality)：腫瘤細胞大多起源於某一細胞，而後再增生分化成另一叢特別的細胞。(2)自律性(autonomy)：腫瘤細胞的生長不會因周遭環境的改變 (化學層級作用與物理層及作用)而影響自生的分化，可以無限制的生長。 (3)退變性(anaplasia)：腫瘤細胞缺乏正常而且有協調性的細胞分化，可以看到各式各樣不同種類分化的細胞。(4)轉移性(metastasis)：腫瘤細胞具有發展出不連續生長的特性以及能夠藉由血液以及淋巴系統擴散至全身不同組織器官的能力。目前一般臨床上常見的癌症治療方法有外科手術治療、放射線治療、化學治療、荷爾蒙治療以及免疫治療等。本論文之核心目標即是針對傳統化學治療上所遇到的瓶頸，加以研究與探討並克服其缺失。現今臨床上常見的化學治療主要可分為(1)全身性：採用靜脈注射或是肌肉注射，有些則是經由口服進入體內；(2)局部性：動脈給藥、腹腔內給藥、膀胱內給藥等。上述各類給藥方式都有藥物在體內半衰期過短的缺點，必須採用多次給藥造成藥物濃度呈現鋸齒分布的不良情形。而

(19)

現今常見的抗癌藥物皆缺乏對腫瘤細胞之毒殺專一性(specificiity)以及位置選擇性(selectivity)，此負作用將會造成一般正常組織的毒害，因此智慧型藥物傳輸系統(intelligent drug delivery system)的應用便由此而生。現今時下常見的傳輸載體有微脂粒(liposome)型、病毒(virus)型、前驅藥物 (prodrugs)型、奈米粒子(nanoparticles)型，以及高分子微胞(polymeric micelle)型等等，各載體間各有其優缺點，而以高分子微胞型藥物傳輸載體最具有結構設計上的變化性(variability)及靈活性(flexibility)，且其能夠針對不同的特定環境及特異系統做最直接有效率的應答效果。因此，如何將高分子微胞型藥物傳輸載體有效地應用於癌症治療，是當今學者所努力專研的。而癌症治療上最理想之高分子微胞即是同時具有「免疫隱蔽性」及「癌細胞辨識性」之功能。「免疫隱蔽性」即是其能夠避免被巨噬細胞 (macrophages) 或嗜中性白血球細胞 (neutrophils) 所辨識並吞噬，能夠在血液循環中長時間穩定存在，延長其被人體代謝的半衰期。此類高分子微胞通常具有 poly(ethylene glycol) (PEG)或 polysaccharides 等高分子鏈，其帶親水基或電中性高分子鏈可提供一動態的遮蔽作用，可有效地

排開或推開血液中的蛋白質吸附，進而避開巨噬細胞(phagocytes)

的辨識。而「癌細胞辨識性」則是高分子微胞表面鍵結標的官

能基(targeting moiety)，如葉酸 (folic acid)、醣類 (如 galactose 等 )

或賀爾蒙(hormone)，由於此類標的官能基在癌細胞表面分佈及

表現量相較於其他正常細胞為多，故可利用其與癌細胞表面過度表現之葉酸或醣類接受器相結合，來達到藥物載體之專一性。

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本研究主要是設計集「生物相容性」、「生物可降解」、「酸鹼應答」、「智慧開關型」以及「免疫隱蔽性」於一身之自我組裝複合型高分子奈米微胞，利用一具有疏水與結晶性之聚酯類高分子 Poly(D,L-Lactide)(PLA)作為複合型高分子微胞之內核，其生物相容性與生物分解性良好，已通過FDA 核准。PLA 分解後產生的乳酸可被人體吸收，不必擔心會對人體造成不良的傷害，因此廣泛應用在藥物釋放及組織工程上。與PLA 接枝之主鏈 Poly(N-vinylimidazole-co-N-vinyl- 2-pyrrolidone)(P(NVI-co-NVP))， NVI 本身具有良好的酸鹼應答特性，可以有效地應用於癌症治療上；而由文獻上可知，NVP 本身為一生物相容性良好的親水性材料，將 PLA 與 P(NVI-co-NVP)接枝便形成 PLA-g-P(NVI-co-NVP)接枝共聚物。而後我們進一步為了讓高分子奈米微胞能夠延長在體內的循環週期及提高其穩定性，將 PLA-g-P(NVI-co-NVP) 接枝共聚物與一具有免疫隱蔽性及生物可降解性之二團聯共聚物

poly(ethylene glycol)-b-Poly(D,L-lactide) 以自我組裝

(self-assembly) 的方式製備成複合型高分子奈米微胞。我們將 N-vinylimidzole 設計在接枝共聚物的外殼，使它能夠對環境酸鹼值的改變作快速的應答(開關 )效果，利用其在酸性環境下， N-vinylimidzole 會抓取環境中的質子並質子化 (protonation)的關係，造成一靜電排斥力使得微胞結構變得較為膨潤(開 )，藥物便得以釋放；而環境中的酸鹼值一旦回復至中性條件下， N-vinylimidzole 便會去質子化 (deprotonation)，此時微胞結構便會緊縮(關 )將藥物再次包覆起來，如圖 1-1 所示。我們即是利用 N-vinylimidzole 之酸鹼應答為出發點，設計一智慧型抗癌藥物

(21)

載體，並改質高分子微胞表面及利用血液與細胞內酸鹼值的差異，達到細胞內藥物傳輸治療的效果並提高於體內循環之半衰期與藥物局部釋放之效果。圖1-1、酸鹼應答開/關型奈米微胞之 On-Off 性質示意圖 Intracellular pH changes (pH ~ 5.0)

pH sensitive inner core P(NVP-co-NVI)-g-PLA

Hydrophilic outer shell

mPEG (mPEG-PLA) Hydrophobic PLA _{segments interaction}

Mixed micelle swollen & rapid drug release

Extracellular fluids (pH ~ 7.4) Intracellular pH changes (pH ~ 5.0)

pH sensitive inner core P(NVP-co-NVI)-g-PLA

Hydrophilic outer shell

mPEG (mPEG-PLA) Hydrophobic PLA _{segments interaction}

Mixed micelle swollen & rapid drug release

Extracellular fluids (pH ~ 7.4)

On

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第二章、文獻回顧

2-1、高分子組成單體之材料性質及其應用性 2-1-1、 poly(ethylene glycol)之性質與應用

Poly(ethylene glycol)(PEG)可說是在生醫領域應用地最廣且

研究地最透徹的高分子之一，一般可由 ethylene glycol 經由酸催

化或是鹼催化行開環聚合反應(acid or base-catalyst ring-opening

polymerization)而得之，但現今市面上已經有各式各樣已商品化且具有不同分子量的產品可供選擇，甚至是將末端改質成各類

官能基或是與各類 peptide、 protein、 antibody 鍵結好的產品，

供學術界或業界直接選購以利研究，這也就是所謂的 PEGylation

【1】。PEG 本身為一親水性 (water-soluble)、電中性 (non-charged)

且不具毒性(nontoxic)之高分子，常被用來當作高分子藥物載體或基因載體之親水性外殼。因其具有良好的親水性以及其鏈段在水溶液中具有相當的立體排斥體積(steric repulsion)，使其在體內長時間循環時可以延展其親水鏈段提供一動態的遮蔽作用，可有效地排開或推開血液中的蛋白質吸附，進而避開巨噬細胞(phagocytes)的辨識。 PEG 除了應用於載體之外殼外，尚有其他學者將其與疏水鏈段自組裝成高分子奈米微胞後，利用其表面之特殊光化學及光物理性質將其應用於半導體晶圓表面之改質以及一些玻璃基材之改質上，如圖 2-1 所示。而由 PEG 組成之奈米粒子之光學性質主要是由其粒徑大小與組成材料有關【2】。

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圖 2-1、PEG 二團聯共聚物之奈米微胞於不同領域上之應用(H. Otsuka, K. Kataoka, Advanced Drug Delivery Reviews, 2003, 55, 403–419)

2-1-2、 Poly(D,L-lactide)之性質與應用

巨乳酸(Poly(D,L-lactide))是常見的生物可降解性單體，一般可由乳

酸(lactic acid)單體經錫觸媒(stannous octanoate)催化，行陽離子開環聚合反應(ring-opening polymerization)得之。聚乳酸依乳酸單體之光學異構物

之不同，可分為L-form 聚乳酸(PLLA)、D-form 聚乳酸(PDLA)及 D,L-form

聚乳酸(PDLLA)，如圖 2-2 所示。PLLA 與 PDLA 之結構規則類似，聚合物之細部結構由結晶態(crystalline)與非結晶態(amorphous)所構成；而 PDLLA 因排列不具有規則性，聚合物為非結晶態(amorphous)。D-form

(24)

如肝、腎、肌肉等，所以在生物醫學的應用上大部分是利用L-form 之聚乳酸(PLLA)與 D,L-form 之聚乳酸(PDLLA)。PLLA 排列規則，容易結晶，為半結晶狀之聚合物，融點(Tm)約為 170-200℃，玻璃轉移溫度(Tg)約為 55-65℃，PDLLA 為不具有特定型態之非結晶態透明材料，玻璃轉移溫度 (Tg)較 PLLA 稍高，約為 50-60℃，無明顯之熔點。而聚乳酸的性質參數會因分子量、分子量分佈、純度及製備方法之不同而不同。 Poly(D,L-lactide)應用在生醫材料上主要有以下三個主要優勢：(1)生物可降解性(biodegradable)良好，使用後能被自然界中微生物完全降解，形成水和二氧化碳，不會污染環境。(2)機械性質(mechanical)良好，適用於熱塑、吹塑等各種加工製程，可應用於各種塑膠製品及進一步地加工成各類織物、民生用品等等。(3)生物相容性(biocompatibility)良好，其在生醫領域之應用性非常地廣闊，如可製作成免拆式人體可吸收之手術縫合線、一次性輸液工具等，而低分子量之聚乳酸更可將其設計在藥物控制釋放之領域上。 O O O O H CH₃ H H₃C O O O O H CH₃ H H₃C O O O O H H₃C CH₃ H [D] [D] [D] [L] [L] [L]

[D]-lactide [L]-lactide meso-lactide

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2-1-3、 Poly(N-Vinylpyrrolidone)之性質與應用

首先， N-Vinylpyrrolidone 單體本身為一極性分子，它與同

樣是極性分子之有機酸(carboxylic acid)、醇類 (hydroxyl group)、

無機鹽類(inorganic salt) 及水之相容性良好。而本研究使用之

(Poly(N-Vinylpyrrolidone)(PNVP)為一親水性 (water-soluble)、電

中性(non-charged)且不具毒性 (nontoxic)之高分子，其性質與 poly

(ethylene glycol)(PEG) 非常類似，可由 N-Vinylpyrrolidone 在 AIBN 起始劑作用下行自由基聚合反應 (radical polymerization) 獲得。常用於生物醫療領域，作為藥品添加物、生物活性蛋白質之高分子修飾基團，且其在血液中之循環時間以及人體相容性甚至比 PEG 還來的好【 3】。由文獻可知， PNVP 以往常被學者利用其良好之生物相容性，與不同功能之疏水或親水性單體進行自由基共聚合，設計出不同功能之藥物载體及基因載體。例如，2002 年， Yinfeng Zhuang 等人即是利用 NVP 與具有溫度

應答之 NIPAAm 單體，以放射性聚合 (radiation polymerization)

的方式進行共聚合，形成具有交聯式高分子網狀結構 (Interpenetrating Polymer network)之高分子水膠藥物载體【 4】。

除此之外，2000 年，Dong Woo Lim 等人亦利用 NVP 與 DMAEMA

以自由基聚合的方式先形成共聚合物，再將其作末端作改質修

飾，而後再進一步地將其與改質過後的 PEG 結合，形成雙團聯

(26)

2-1-4、 Poly(N-Vinylimidazole)之性質與應用

N-Vinylimidazole(NVI) 為一親水性且具酸鹼應答效果的單

體，我們可藉自由基聚合反應(free radical polymerization)，將其

聚合為 Poly(N-Vinylimidazole)(PNVI) 【 6 】。其結構與 poly(4-vinylpyridine)相似，皆是一個含有雜原子(heteroatom)之未飽和環狀芳香族化合物(aromatic compound)，二者在 N 的位置上，皆含有一個未鍵結的孤對π電子。此孤對π電子具有抓取環境中氫離子之能力，因此，在酸性環境下(pH<6)，NVI 本身即具有質子化(protonaiton)的能力，如圖 2-3 所示。我們即是利用 NVI 之酸鹼應答能力，在酸性環境下，藉著 PNVI 高分子鏈段間帶正電性的結果造成靜電排斥力，使奈米微胞本身變得較為膨潤，將包覆在內核的抗癌藥物釋放以達到癌細胞毒殺的效果。除此之外，PNVI 可以與許多帶電性分子產生鍵結(金屬離子、蛋白質結構等)，形成一複合型結構，因此我們可以將某些具有與生物分子產生鍵結能力的配體(ligands)(例如染料或是具有反應性的高分子)輕易地導入 PNVI 形成複合型膠體【7】。圖2-3、PNVI 之 imidazole 官能基在質子酸存在下之質子化與去質子化

可逆反應示意圖(M.JESU’S MOLINA et al, Journal of Polymer Science:

(27)

其他類似於 imidazole 官能基之高分子，例如 poly-histidine(polyHis)，

由Y. H. Bae 等人研究 polyHis 發現，imidazole 基團在體內可藉由 proton

sponge 之機制誘導 endosome membrane disruption activity【8-9】，如此一

來於高分子系統導入polyHis 於內核，對於細胞內的藥物傳遞會有更佳的

效果，如圖2-4 所示。因此，現今已有其他學者將其應用於 DNA 基因治

療，將末端改質成具有imidazole 的官能基，使其在基因傳遞治療上具有

更好的療效【10】。

圖2-4、PHis-PEG 與 PLLA-PEG-PHis-biotin 之複合型奈米微胞結構

(28)

2-2、高分子奈米微胞之介紹 2-2-1、高分子奈米微胞之形成機制 高分子二團聯共聚物欲在水溶液( 亦有學者探討其在有機溶液中之組裝情形)中自我組裝成一有序列之結構，通常其結構皆必須具有親疏水性差異明顯的兩段高分子鏈，而隨著親疏水鏈段比列之不同，其在水溶液中之組裝結構亦不相同，常見的

結構有微胞(micelle) 、棒狀 (cylinder) 、層板狀 (lamella) 等結構

【11】。在此，我們將研究重點放在高分子微胞之探討上，當我們提高親疏水鏈段之組成比例時(增加親水鏈段比；降低疏水鏈段比)，組裝之結構會由層板狀或棒狀轉為微胞之結構。通常，組成高分子微胞之共聚物包含了兩種(依結構設計需求之不同，有時單體之種類可能有兩種以上)不同溶解度的單體，而這兩種單體可依用途之不同而設計成許多不同形式之雙性共聚合物，

如二團聯共聚物(diblock copolymer) 、三團聯共聚物 (triblock

copolymer)及接枝共聚物 (graft copolymer)等。其中以雙性團聯共

聚物(amphiphilic block copolymer)所形成之高分子微胞研究最

為完整【12-13】。高分子微胞之形成取決於親疏水性分子鏈段的

比例。在水相環境下，當親水性鏈段之分子量大於疏水性鏈段時，高分子鏈會因在水溶液中親疏水性之不同而排列成核殼結

(29)

圖2-5、雙性高分子自組裝形成高分子微胞之示意圖高分子微胞形成之過程包含了兩種作用力的平衡，其一是使高分子互相聚集的疏水性作用力，其二是避免高分子微胞無限聚集而形成微相(microdomain)的高分子鏈段排斥力。其熱力學行為與小分子量的界面活性劑相似，形成微胞的驅動力主要是因為在水溶液中，雙性共聚合物的疏水性鏈段為了減少與水的接觸面積而自我聚集，再加上覆蓋在疏水性鏈段外層的親水性鏈段使得疏水性鏈段與水的接觸面積減到最低，因此使系統的自由能達到最小值而形成最穩定的狀態【14-15】。而研究高分子微胞之最重要因素即是高分子微胞本身穩定性之探討，亦即高分子微胞在溶液中因結構不穩定而瓦解或過度聚集造成粒子之沉澱的可能性。在一般情況下，穩定的高分子微胞可以在體內長時間地循環並累積於適當的組織，以進行局部的藥物釋放。而高分子微胞不論在體外與體內的穩定性皆與它們的臨界微胞濃度有關，一般疏水性鏈段對臨界微胞濃度的影響遠大於親水性鏈段【16-17】。以下說明親疏水性鏈段分別對於高分子微胞穩定度的影響：(1)在固定親水性鏈段分子量下 Dialysis Self-assembly Solidification

Swollen Precursor Mixed Micelle

Random Coil

Solvent exchange

(30)

增加疏水性鏈段分子量，臨界微胞濃度會明顯下降，因此會增加高分子微胞的穩定性。(2)在固定疏水性鏈段分子量下增加親水性鏈段分子量，臨界微胞濃度只會小幅上升。(3)在固定親 /疏水性鏈段的比例下增加雙性共聚合物分子量，只會造成臨界微胞濃度小幅下降。(4)一般在相同分子量與親 / 疏水性鏈段比例下，三團聯共聚物的臨界微胞濃度會高於二團聯共聚物的臨界微胞濃度【 16-20】。而由雙性接枝共聚物所形成的高分子微胞，相較於團聯共聚物而言，較易發生互相聚集的現象，這是因為接枝共聚物之疏水性鏈段運動性低於團聯共聚物，因此會形成結構較鬆散之高分子微胞，導致某些疏水性鏈段與水接觸，所以高分子微胞彼此間容易聚集形成較大的顆粒【 21-26】。研究高分子微胞的另一項重要參數即為臨界微胞濃度 (critical micelle concentration, CMC)。在溶液中，雙性共聚合物之濃度高到足以形成微胞之濃度時，此時微胞本身與高分子 (polymer) 也正好達到某一平衡，而此濃度即稱為臨界微胞濃度。嚴格來說，有很多方法都可以用來決定臨界微胞濃度，幾乎任何物理的參數都可以用來表示系統在臨界微胞濃度時的物理性質變化。然而，由於靈敏度的問題，所以只有少數方法真正被用來決定臨界微胞濃度，如高效能液相層析儀(HPLC)、小

角度光散射儀 (small angle light scattering) 、螢光光譜儀

(fluorescent spectroscopy)等。而其中又以螢光光譜儀最為靈敏與精確。當溶液中雙性共聚合物濃度達到臨界微胞濃度或稍高於

臨界微胞濃度時【15】，會形成鬆散的高分子微胞結構，在內核

(31)

濃度之增加，將會改變原先溶液中高分子與微胞之平衡，使其傾向於生成高分子微胞之方向，內核中殘留之些微水溶液亦會逐漸排出於結構外，使內核的結構變的更加緊密及穩定，同時也會使高分子微胞的水合半徑逐漸變小。臨界微胞濃度決定了雙性共聚合物在藥物載體上的應用性，若雙性共聚合物的臨界微胞濃度太高，則其形成的高分子微胞在進入體內時，會因為被大量的血液稀釋而變的不穩定而容易分解，其所攜帶的藥物也因過快的釋放而在血液中沈澱，並因此快速被人體所代謝。因此在研究高分子微胞的藥物控制釋放上，臨界微胞濃度是一個很重要的因素。 2-2-2、高分子奈米微胞之包覆原理 高分子微胞的核殼結構提供了攜帶疏水性藥物的空間，因此可以保護藥物不被體內酵素分解(內核 )及抵抗蛋白質與細胞的吸附(外殼 )，故常被用於藥物控制釋放之研究。而高分子微胞可藉由物理性包覆、化學性鍵結或靜電作用力來包覆藥物。分別敘述如下：(1)物理性包覆，其驅動力主要是疏水性鏈段與藥物間的疏水性作用力。因此，增加疏水性鏈段分子量可以增加藥物的包覆量，實驗也證實藥物的疏水性越高，微胞的包覆效果也越好。常見的物理性包覆方式有溶劑交換法 (solvent

exchange process)及油相 /水相乳化法 (O/W emulsion method)，如

圖2-6所示。前者是利用有機溶劑與水的緩慢交換使藥物與疏水

性高分子聚集；後者則是利用有機溶劑在水中形成乳化粒子，

(32)

用共價鍵(如醯胺鍵 (amide bond))來鍵結藥物，此類鍵結非常安定，不容易被酵素分解或水解，因此必須在藥物與高分子之間

導入一特定環境下會斷裂之隔離基(spacer)以利藥物釋放，如圖

2-7 所示。 K. Kataoka 等人於 2003 年以 poly(ethylene glycol) 與 poly-(aspartic acid) 形成二團聯共聚物 (PEG-b-PAsp) 共價鍵結 adriamycin[PEG-b-PAsp(ADR)]形成雙性共聚合物，進行體內實驗的研究【28】，發現在靜脈注射下，其在體內的循環時間及分佈皆與共聚物鏈段的相對大小有關，較長PEG鏈段與較短 PAsp 鏈段在體內的循環時間較長且不易被內質網吸收。(3)靜電作用力，主要是利用兩種相反電性的物質互相聚集而形成微胞的結構，一般來說，利用這種電性結合的高分子微胞，通常皆應用於基因治療上，利用帶有正電性之高分子鏈段與帶有負電性之 DNA做電性鍵結，藉此將 DNA包覆於高分子微胞之內層中以利於攜帶，如圖 2-8 所示。 K. Kataoka 等人於 2004 年，利用 PEG-PMPA-PLL三團連共聚物與帶負電之 DNA鍵結形成高分子

錯合物微胞(polyion complex micelles)，將其應用於基因治療上

【29-33】。在高分子微胞之藥物包覆研究上，近來有學者利用數學模擬藥物包覆之過程，已證實在藥物包覆初期時，是藉由核中溶劑(水 )分子的互換使藥物進入高分子微胞的內核，而後藥物再逐漸往內核中心累積，並且將高分子微胞的疏水鏈段推離內核中心【34】。因此，當高分子微胞包覆大量藥物時，由於內核會向外膨脹而使得高分子微胞的粒徑變大。包覆藥物的效率主要是由疏水性藥物與雙性高分子疏水鏈段的相容性來決定，而藥物

(33)

與雙性高分子疏水鏈段的相容性可以依據 Flory-Hagguins 作用力參數(interaction parameter)χsp 來判斷【 35】。當 χsp 越小時，藥物與疏水鏈段的相容性就越大。而雙性高分子的親水鏈段與疏水鏈段之比例也會影響包覆藥物的效率；疏水鏈段分子量越大則內核就越大，故藥物包覆量越多；反之，增加親水鏈段的分子量，則高分子微胞的臨界微胞濃度會增加，亦即在固定的雙性高分子濃度下，所能形成微胞的數目相對較少，因此藥物包覆量亦減少。圖2-6、高分子微胞之物理性包覆藥物示意圖 (a)透析法；(b)乳化法

(34)

圖2-7、PEG-b-PAsp(ADR)之化學鍵結型奈米微胞及其藥物釋放之示意圖(Y. Bae, K. Kataoka et al, Bioconjugate Chem. 2005, 16, 122-130.)

(35)

圖2-8、PEG-PMPA-PLL 三團連共聚物與 DNA 鍵結形成高分子錯合物微胞之示意圖(K. Kataoka et al, J. AM. CHEM. SOC. 2005, 127, 2810-2811)

2-2-3、免疫隱蔽性奈米微胞

生物體內的細胞膜是由磷脂質(phospholipid)所組成，而磷

脂質為一雙性分子(amphiphiles)，是由一個甘油 (glycerol)與兩條

脂肪酸鏈(fatty acid chain) 組成疏水端，另一端為極性頭基

(hydrophobic polar headgroup)組成之親水端。磷脂質的親水端 (極性頭基 )略帶負電性，亦即細胞膜表面之電性為弱負電性，故我們在設計免疫隱蔽性奈米微胞之外殼結構時，就必須選用帶有弱負電性之親水鏈段，常見的弱負電親水性高分子有 poly(ethylene glycol)(PEG)、 poly(2-ethyl-2-oxazoline)(PEOz)、 poly(2-hydroxyethyl methacrylate)(PHEMA)以及 poly(N-vinyl- 2-pyrrolidone)(PNVP)等等【 2,36-38】。由此類高分子組成之奈米

(36)

(neutrophils)所辨識，可有效地提高在體內循環之半衰期，並可利用腫瘤組織之特異性，達到選擇性的自然標的作用(passive targeting)。此外，微胞粒徑大小亦相當重要，若粒徑小於 100 nm 可避免被免疫系統所辨識；小於 50 nm，則可輕易被腎臟系統所排泄。免疫隱蔽性奈米微胞的例子有很多，相關的文獻亦不勝枚舉，其中於 2005 年時， M. Annka 等人就利用 poly(ethylene glycol)及 poly(N-isopropylacrylamide)，設計一具有免疫隱蔽性與溫度敏感性之二團聯共聚物，並探討在水相中的自組裝行為與溫度應答行為，如圖 2-9 所示【 39】。圖 2-9、免疫隱蔽性奈米微胞 PEG-b-PNIPA 之自組裝與聚集行為之示意

(37)

2-2-4、生物可降解型奈米微胞 高分子材料欲應用於生物醫學領域，其基本特性之一即為本身必須具備生物可降解的特徵，所謂的生物可降解性 (biodegradable) 即為材料可被微生物分解或是被體內之酵素分解成微小、無害的小分子系統皆稱之。對於將高分子材料應用於生物體內之行為而言，不見得一定要分解成小分子非可，只要材料本身可行生物吸收 (bioabsorption) 、生物再吸收 (bioresorption)以及生物溶蝕 (bioerosion)之行為而轉變成可被人體吸收或排泄之小鏈段，我們皆稱為生物可降解性高分子。而此類高分子應用於奈米微胞之製備上，常見的材料有聚酯 (polyester)、聚醯胺 (polyamide)、聚酸酐 (polyanhydride)以及蛋

白質(protein)等，如表 2-1 所示【 40】。其中聚酸酐本身為聚酯的變形，其本身之降解行為(半衰期 )皆比聚酯與聚醯胺來的快 (短 )，而其中聚醯胺由於其本身具有強烈的氫鍵作用力與排列規則的重複單元(高分子鏈段較剛硬 )，故其降解之半衰期相當地長，甚至常被歸類於生物不可降解性高分子。雖然聚酯類高分子本身亦具有氫鍵作用力，但由於其本身之鏈段較柔軟之故，較容易被微生物或體內酵素分解或吸收。至於常見的聚酯類高

分子有 poly(D,L-lactide)、 poly(ε-caprolactone)等；常見的聚酸

酐高分子有 poly(sebacic anhydride)，而聚酯類與聚酸酐類高分

子應用於奈米微胞之設計上，通常皆將其設計於奈米微胞之內

核，利用其疏水作用力，包覆疏水藥物(例如 doxorubicin)。而常

見的聚醯胺類高分子有 poly(2-ethyl-2-oxazoline)，由於聚醯胺類

(38)

本身常被當作奈米微胞之外殼，於體內循環時，可藉其表面帶負電之介面電位穩定地於血液中循環而避免被巨噬細胞 (macrophage)或嗜中性白血球細胞 (neutrophils)所辨識，因此可大大地延長奈米微胞於血液中之循環時間，所以由 poly(2-ethyl-2-oxazoline)所組成之奈米微胞，其本身不但是生物可降解性之微胞亦為免疫隱蔽性微胞之ㄧ支。綜觀上述，我們可以依高分子之不同降解半衰期與其他特性，設計出不同用途

之奈米微胞。例如 2006 年 J. Rieger 等人發表於 Adv. Funct.

Mater.，在其研究中，Rieger 團隊利用 poly(ε -caprolactone)當作

奈米微胞之內核以及 poly(ethylene glycol) 當作奈米微胞之外

殼，設計出不同型態之團聯與接枝共聚物，探討奈米微胞之穩

(39)

表2-1、常見之生物可分解性高分子【40】

Polymer Structure Example Enzyme

protein polypeptides Albumin Fibrinogen Collagen Gelatin peptide chymotrypsin pepsine papain, etc.

Poly(amino acid) Poly-L-leucine

Poly-L-lysine Poly-L-glutamic acid

polysaccharides Amylose Hydroxyethylstarch Dextran Alginic acid Chitin amylase amylase lysozyme polyesters Poly(α-hydroxy acids) Polylactide Polyglycolide Polyglactin Poly(α-malic acid) none none none none

Poly(ω- hydroxy acids) Poly-ε-caprolactone none

Poly(ester-ether) Poly(1,4-dioxan-2-one) none

polyanhydride Poly(sebacic anfydride) None

(40)

2-2-5、酸鹼應答型奈米微胞

近幾年來，酸鹼應答型奈米微胞在癌症治療上逐漸受到重

視，已有不少學者利用細胞內外 pH 值差異或癌症組織較低之 pH

值等特性設計微胞結構，達到定點藥物制放之目的。而所有的

酸鹼應答型高分子都具有酸性/陰電性之官能基，如 carboxylic

acid 或 sulfonic acid 等；或是具有鹼性 /正電性之官能基，如 ammonium salt 等。當外在環境之 pH 值大於或小於官能基的 pKa

值時，就會使酸性官能基去質子化(deprotonation)而帶負電或使鹼性官能基質子化(protonation)而帶正電，常見的酸鹼應答型高分子皆如圖 2-10 所示【 42】。一般而言，酸鹼應答型奈米微胞應用於癌症治療上可簡單地設計成三種不同的類型： (1) 利用結構中高分子鏈段質子化或去質子化所造成的靜電排斥力(正電排斥力或負電排斥力 )，直接造成結構的破壞，進一步地將微胞所包覆之藥物做選擇性地釋放，例如 2004 年， G. H.

Hsiue 等人以 poly(D,L-lactide)-g-poly(N-isopropyl

acrylamide-co-methacrylic acid)接枝共聚物製備奈米微胞，利用 PLA 之疏水作用力包覆疏水之抗癌藥物 5-FU 後，將奈米微胞置於 pH 5.0 下，可使結構解體釋放出藥物，而於 pH 7.4 時，抗癌藥物則被穩定地被包覆於微胞之內核【43】。 (2) 利用化學鍵結方式，即利用共價鍵 (如醯胺鍵 (amide bond)) 來鍵結藥物，在藥物與高分子之間導入一特定酸性環境下會斷裂之隔離基(spacer)以利藥物釋放，通常是將此隔離基之斷鍵酸

(41)

鹼值設定在 pH4.5~6.5 之間。亦即是利用癌症組織附近之低 pH

值，進行細胞外或細胞內之藥物釋放。K. Kataoka 等人於 2005

年，即是利用 poly(ethylene glycol)與 poly-(aspartic acid)形成

雙團聯共聚物(PEG-b-PAsp)，將其與 adriamycin 行共價鍵結形成 [PEG-b-PAsp(ADR)]之雙性共聚合物，以進行體內藥物釋放的研究【44】。 (3) 將奈米微胞之內核設計成帶有電性 ( 正電性或負電性皆可 ) 之高分子鏈段(此鏈段不需設計為疏水鏈段 )，利用正負電相吸之原理，將其與相反電性之藥物做電性之結合。然而此具有應答行為之內核，其酸鹼應答範圍同樣地必須界於 pH4.5~6.5 之間，才可應用於癌症治療上。例如，T. G. Park 等人於 2000 年，利用 poly(DMAEMA-co-NVP)-b-PEG-galactose 雙性團聯共聚物包覆帶有負電之 DNA 做為基因治療之載體，並探討其 DNA 包覆與轉染之行為與細胞存活率之相關性【45】。

(42)

圖2-10、不同種類的酸鹼應答巨電解質高分子： (1) Poly(4-vinylpyridine),

(2) Poly[thio-1-(N,N-diethyl)aminoethylethylene] (3) poly(vinylimidazole)

(4) poly(2-ethacrylic acid)

(S. R. Tonge, B. J. Tighe, Advanced Drug Delivery Reviews, 53 2001, 109–122)

(43)

2-2-6、開關型奈米微胞

簡言之，開關型奈米微胞即是可藉由人為操控或是環境的改變而具有可逆行為(reversible)之載體，通常可藉由環境中之溫度(temperature)、酸鹼值(pH)、離子強度(ionic strength)、溶劑(solvent)、磁場(magnetic field)、電場(electric field)、光線(light)以及特異分子(specific molecule)存

在下來調控載體的開關情形【46-48】。然而開關型載體要做成奈米尺寸並不容易，目前文獻上常見的開關型載體皆是將具有應答行為的高分子接枝在微米尺寸之容器表面，所以其開關行為僅侷限在高分子接枝之表面區域，應答效率有限。另外，開關型載體亦可做成微米尺寸之高分子水膠(hydrogel)，而水膠之彭潤情形可由本身之交聯程度決定，故其開關程度可自由地控制，缺點即為本身無法藉由高分子自組裝成奈米尺寸且具由殼核結構之奈米微胞，這將會限制其應用價值。至於最常見的開關型應答材料有藉由溫度調控的poly(N-isopropyl acrylamide)(PNIPAAm)，因

其本身具有所謂的低臨界溶液溫度(lower critical solution temperature， LCST)，PNIPAAm 之 LCST 約為 32℃，高於此溫度，PNIPAAm 會呈凝膠態；低於此溫度則會呈溶液態，且型態的轉變相當快速，故非常適合拿來當作開關型載體的研究，如圖2-11 所示【49】。其他較常見的開關型載體有利用用環境中酸鹼值的改變來最為調控的因子，例如 poly(methacrylic acid)，其酸鹼應答約在 pH 5.0 附近，可將高分子接枝在載體表面，藉由其本身質子化或去質子化的能力，造成高分子鏈段的彭潤或是收縮，進一步造成開關應答的效果，如圖2-12 所示【50】。綜觀上述，要研究一開關型載體並不容易，然而要設計成奈米層級之開關型載體更有其難度，本論文即是在挑戰並設計出一具有酸鹼應答之開關型奈米微胞。

(44)

圖 2-11、溫度應答之開關型載體示意圖 (Liang-Yin Chu et al,

Journal of Membrane Science, 192 (2001) 27–39)

圖 2-12、酸鹼應答之開關型載體示意圖 (Liang-Yin Chu et al,

(45)

2-3、複合型奈米微胞之介紹

近年來，複合型奈米微胞(mixed micelles)為各界發展奈米科

技中重點研究之一。其研究範圍涵蓋層面相當廣泛，包括界面

活性劑與高分子系統(surfactant-polymer system)、高分子與微脂

粒系統(polymer- liposome system)、以及高分子與高分子系統

(polymer-polymer system)等。高分子各自具有其臨界微胞濃度，因此複合型高分子奈米微胞在形成時涉及兩種不同高分子在奈米結構中之嵌入(entry)及逃脫 (escape)行為，而逃脫之高分子若其在溶劑中之濃度高於臨界微胞濃度時亦能各自形成單一種奈米結構，因而可能造成系統同時有單一高分子奈米結構與複合型高分子奈米結構並存之形態，而此一現象可由兩種高分子微胞之雜交行為(hybridization)推論得知【 51】。此外，共聚合高分子之形態、分子內或分子間相互作用力、以及高分子之立體障礙等亦皆會影響另一組成進入複合結構之能力，因而難以探討其複合型微胞形成之機制。 2-3-1、高分子高分子複合型奈米微胞 高分子微胞應用於藥物制放傳輸系統上是近十幾年來各方研究重點之一。其與微脂粒之差異乃在於高分子種類繁多，並可依實際需要設計與合成；高分子所形成之奈米微胞結構穩定，在體內血液之半衰期較長；再者，高分子微胞可使其同時具有多功能性，可製備成多能化之奈米元件應用於診斷與治療上。然而，高分子縱使可利用分子設計達到多樣化與多功能性，

(46)

但可能因其結構複雜或立體障礙過大而無法形成奈米級微胞。因此，兩種高分子組合而成之複合型高分子微胞在現今已逐漸受到重視。而由目前的研究文獻上來看，大部分都在探討因疏水性作用力聚集(hydrophobic interaction) 所形成之複合型奈米微胞，如圖 2-13 所示【 52-59 】。僅有少數是以靜電作用力 (electrolytic interaction) 的方式來形成複合型高分子微胞【58,60-65】。圖 2-13、複合型奈米微胞疏水性自我排列示意圖。 (C. Wu, Macromol., 2004, 37, 2438) 此外，1996 年 P. Sens 等人以兩團聯共聚物探討高分子之不對稱性對於複合型奈米微胞形成之影響。其研究結果結果發現：（1）若兩高分子之大小與不對稱性差異不大，則在自我聚集過

(47)

程中，較短之高分子會持續的併入較大之高分子所形成的微胞中，而形成複合型高分子微胞；（2）若不對稱性差異大，則複合型高分子微胞與較大之高分子所形成的微胞皆會共同存在【66】。另外，1999 年 Benjamin Chu 等人也利用溫度的變化，改變 E9 9P69E99 與 E45B1 4E4 5 三團聯共聚物（ E 、 P 、 B 分別為

oxyethylene、 oxypropylene 和 oxybutylene）在水溶液中的臨界

微胞濃度，並藉由其臨界微胞濃度之相對大小，來探討 E9 9P6 9E9 9 與 E45B14E4 5 混合物在水溶液中的自我聚集行為，並歸納出以下之結論：（1）對於兩個可互溶的團聯共聚物在一選擇性溶液中通常會自我聚集形成複合型高分子微胞，而不是個別的高分子微胞共存；（2）在固定溫度下，若一團聯共聚物（ A）的臨界微胞濃度遠低於另一團聯共聚物（B），則兩者混合之高分子溶液的臨界微胞濃度主要由共聚物（A）來決定。當混合溶液中之共聚物（A）濃度達到其臨界微胞濃度時，則共聚物（ A）會先形成微胞，而共聚物（B）會逐漸地加入團聯共聚物（A）所形成之微胞，且隨著團聯共聚物（ B）濃度的增加，加入微胞的比例就越高，最後達到其進料之比例；（3）若共聚物（ B）的臨界微胞濃度只略高於共聚物（ A），會有一部份之共聚物（B）會參與共聚物（ A）微胞化的過程，

(48)

即使共聚物（B）之濃度低於其臨界微胞濃度，這是由於共聚物之分子量分佈的影響。對於具有相同臨界微胞濃度（coassosiation point）的兩個共聚物而言，他們會同時聚集而形成複合型微胞，且臨界微胞濃度仍然與個別的高分子（A）或（ B）溶液相同。（4）複合型微胞之重量平均聚集數（ weight-average association

number,nw）及水力半徑（hydrodynamic radius,Rh）會介於

共聚物（A）及共聚物（ B）間，而在複合型微胞中具有較

大比例之共聚物，對於 nw與 Rh 也具有較大之影響【67】。

2-3-2、高分子-微脂粒複合型奈米微胞

從 1965 年英國劍橋 Babraham Insitute 的 Alec Bangham 發

現當磷脂質薄膜分散於水相環境系統中時，會形成許多類似洋蔥多層結構（multilamella structure）的中空球體後，微脂粒的形成機制及其可能的應用與發展逐漸受到起重視。由於微脂粒特殊的中空球體及類似生物膜的結構，再加上其為天然物質所構成，具有良好的生物相容性及生物可分解性，使得微脂粒在生物學、製藥以及醫學的研究與應用皆佔有相當重要的地位。但由於微脂粒在體內、體外存在著穩定性的問題，而使得微脂粒的發展與應用受到非常大之限制。因此，近幾年來添加一物質進入微脂粒用於穩定載體結構成為一研究與應用之趨勢。而其中尤以高分子與微脂粒混合製備形成複合型奈米微胞（或稱為人造微脂粒）最受重視。其優點不僅可改善微脂粒之穩定性、

(49)

提高微脂粒於血液中之半衰期外，更可藉由高分子之特殊結構使微脂粒同時具有環境應答之性質或具有標的之性質。從文獻上已可得知多種高分子團聯共聚合物應用於高分子 -微脂粒複合型奈米 -微胞系統上。而其形成機制之探討著重磷酯質與高分子之立體空間作用力、構形改變、以及動態穩定性等。例如以 Langmuir-Blodget technique 探討單一分子層之磷酯質與高分子分散與聚集行為；以螢光光譜儀研究高分子與磷酯質之聚集；以及以橢圓儀(ellipometry)研究分子構形之變化等。圖 2-14、高分子 -微脂粒複合型奈米微胞之形態示意

圖。(B. Ceh, Adv. Drug Deliv. Rev., 1997, 24, 165.)

一般常見用於增加微脂粒穩定性的高分子有 poly(ethylene

glycol) (PEG) 高分子衍生物、 chitosan 高分子衍生物、以及 poly(vinyl alcohol) (PVA)高分子衍生物等。不同之高分子組成與

(50)

結構在微脂粒脂表面會呈現不同之構形，如圖 2-14 所示。其中最常見的高分子為 PEG 與 PVA 等高分子衍生物，由於其本身帶弱電性，因此其與微脂粒之結合方式大部份皆是利用其衍生物 ( 疏水端 ) 與磷脂質之脂肪鏈段以疏水力量 (hydrophobic interaction)聚集，而將親水鏈段裸露於外【 68-72】，如圖 2-15 所示。而具帶電性之高分子如 chitosan 等，則可利用其電性與帶相反電性之磷脂質產生電性吸引作用，使高分子能緊密與微脂粒結合【73-76】。而這些高分子包覆於微脂粒外層後，高分子鏈段能避免微脂粒之間的相互融合(fusion)，且高分子間無聚集產生，故能增強微脂粒之穩定性。而若高分子本身極具親水性，則其與微脂粒結合後，則能延長微脂粒於血液系統中的循環時間，並且可躲避免疫系統之辨識，或避免與組織或細胞產生沾黏，而提高微脂粒於血液中之半衰期，也可避免微脂粒受鹽類與 lipase 等破壞，使高分子 -微脂粒複合型奈米微胞能累積於欲標的之器官或細胞。圖 2-15、含 poly(ethylene glycol)高分子衍生物之微脂